利用 h-oig境外矩阵子 filling (homing) 进行室内胰岛移植

细胞疗法是一个热门话题, 因为它旨在以再生医学为基础的疾病治疗。近年来, 生物材料辅助细胞疗法的研究越来越多, 特别是因为细胞植入往往需要一个载体来将细胞从培养皿转移到接受者。生物材料支架是潜在的有价值的细胞载体, 履行几个角色¹。一个有能力的载体应该保护细胞免受机械压力, 并提供良好的生长条件, 如基本生长因子、代谢废物排泄、营养物质交换和氧气²。

在细胞治疗中使用的不同类型的生物材料中, 水凝胶有许多优点。它们具有生物相容性, 可生物降解, 易于处理, 并促进氧气扩散³。此外, 目前的技术允许使用水凝胶来帮助细胞生存和移植, 例如, 补充生长因子或细胞外基质^{蛋白 4}。

含有干细胞的水凝胶载体可以作为治疗方法注射 , 例如骨再生⁵和神经系统疾病⁶。需要植入代谢活性细胞。虽然这种方法的体外验证是可能的, 但体内验证的工具和技术仍有待完善。

细胞和水凝胶移植可以很容易地进行皮下注射时, 生物相容性试验。然而, 当移植细胞是为了调节系统因素, 他们的代谢行动, 这种皮下定位不是最佳的, 基本上在静脉引流⁷。因此, 目前还没有工具来快速、安全和有效地评估水凝胶的有益效果。根据胰岛移植的例子, 即要求激素从移植物中释放到血液中, 以响应血糖水平, 我们开发了一种新的细胞水凝胶在体内植入的方法。

第一步是确定受体移植位点, 它可以接受带有细胞的水凝胶。动量为植入提供了很大的空间, 具有很高的可塑性, 其致密的血管化与腹腔内的设置相结合, 对于研究具有高代谢活性^{的细胞来说}是很有趣的8。接下来我们需要建立一种手术技术, 允许细胞和水凝胶转移到动量中。在整形外科9中使用的填充物^的启发下, 我们开发了 h-oiged 矩阵子文件 (homing) 方法。嵌入水凝胶中的胰岛被注射到口腔组织内。该技术还旨在提供最大的移植利用细胞和水凝胶混合物的多个沉积到口腔组织, 其中大量的血管也改善移植氧。

在本研究中, 我们描述了一种简单和创新的技术, 用于胰岛植入之间的胎盘, 在脂肪组织中最接近血管。这包括微创手术, 这可以在腹腔镜下完成, 与注射胰岛在水凝胶的脂肪组织。这项技术很容易适用于所有需要在代谢功能环境中测试的水凝胶和细胞组合。

所有动物实验都是根据国家卫生研究院的指导方针进行的, 授权号为: al/607/12* 13。

1. 收件人准备

1. 化学诱导受者大鼠糖尿病。
   1. 腹腔内向大鼠注射 75 mg/kg 链球菌 (stz, 在不育 0.1 m 柠檬酸缓冲液中, ph 值 4) 给大鼠¹⁰。
      请注意:在移植研究中, 使用了6只一周大的刘易斯毒鼠, 重达15-190 克。
   2. 通过在头四天的每日血糖测量检查糖尿病状况。当大鼠在皮下注射长效胰岛素 6时, 以防止糖尿病并发症和体重减轻, 直到胰岛素颗粒植入。
   3. 当两种尾巴静脉血糖指标连续 2天 gt;4-5 g/l 时, 将大鼠纳入队列, c-肽水平为 & lt;200 pm。用酶联免疫吸附法 (elisa) 测量血糖。
   4. 在皮肤下植入胰岛素颗粒 (见 1.2)。
      请注意:慢性胰岛素治疗可以更好地调节血糖, 避免糖尿病并发症 (加重移植部位的氧化应激)¹¹。此外, 这种疗法还能保护糖尿病状态和正常的生长曲线 (没有在糖尿病动物身上观察到的通常减肥)。这可能会导致一个更大的东方脂肪垫, 这是理想的进行移植。
2. 胰岛素颗粒的植入
   1. 用气体麻醉 (500 mL/min o2 中的3% 异氟烷) 对大鼠进行麻醉, 并将大鼠置于俯卧部位。
   2. 通过检查是否没有反射 (抓爪) 来验证麻醉状态。使用聚维酮碘清洁颈部, 并使用剃须刀刀片剃须该区域。再次应用聚维酮碘, 让它站立3分钟。
   3. 将1.5 胰岛素颗粒 (3 单位 (U)/200 克大鼠) 放入 1: 5 稀释的 povidone 碘溶液中进行颗粒消毒。使用 16 g 的小车刺穿颈部皮肤, 并使用带家具的导轨和造型插入颗粒。检索指南和样式, 并缝合一个点。使用聚维酮碘清洁针脚。
      请注意:手术后疼痛治疗是没有必要的, 因为干预是类似于单皮下注射 (sc)。
   4. 让大鼠从麻醉中恢复, 并确保大鼠能够获得食物, 以避免低血糖。
   5. 通过测量植入后血糖下降的情况来测量颗粒的效率。
   6. 通过监测每月1个月的血糖水平, 检查颗粒的效率。
   7. 当胰岛素颗粒植入1个月后, 将尾静脉血 c 肽水平的测量保持在 200 pm 以下时, 将大鼠纳入队列中。
      请注意:检查 c 肽水平是强制性的, 以评估动物在移植前的基线, 并确认其糖尿病状态。低 c 肽再生总是发生在随访过程中。最低的 c-多肽是最低的再生。

2. 霍明: 室内基质胰岛灌装

1. 胰岛基质混合物的制备。
   1. 在层流罩中准备粘稠的胰岛载体。在浓度为1.5% 的无菌 pbs 中溶解海藻酸盐粉末。通过0.22μm 的过滤器对制剂进行灭菌。为每个接收者准备400μl。
      请注意:任何一种粘度适宜通过 21 g 针注射的水凝胶都可以使用。
   2. 如前面所述^{的 12只}, 将胰岛与健康的刘易斯老鼠 (200-250 克) 隔离开来。
   3. 胰岛等价物中的计数胰岛数 (ieq) (其中一个 ieq 被认为相当于直径为150μm 的胰岛)¹³。
   4. 在层流罩中, 在 1.5 ml 管中制备7660小岛当量 (ieq) 的等价物。
   5. 用500μl 的 cmrl (干诺医学研究实验室) 中度清洗胰岛, 不含胎儿牛血清。
   6. 颗粒胰岛离心 (在 500 x克和4°c 时 2分钟)。放弃上清液。
   7. 在小岛上加入150μl 海藻酸氢凝胶载体, 通过上下移液仔细混合, 并将混合物放在冰上。
   8. 通过将150μl 的空海藻酸盐装入注射器, 准备一个无死体积的无体积的无菌性 21 g 针和1毫升注射器。
   9. 用胰岛和海藻酸盐 (150μl, 总体积 300μl) 混合填充注射器。把注射器放在冰上。
2. 手术
   1. 使用冷灭菌消毒手术器械 (2% 的 steranios 为 20分钟)。
   2. 采用异氟烷麻醉对大鼠进行麻醉, 并将大鼠置于俯卧部位。
   3. 使用剃须刀片刮伤颈部区域, 并用聚维酮碘对颈部区域进行消毒。让碘代表3分钟。
   4. 用手术刀做一个切口, 用钳子取出1.5 胰岛素颗粒。使用一个或两个单针点关闭皮肤。不要将大鼠从麻醉中取出。
      请注意:1个月后, 颗粒可以易碎, 因为一些纤维化组织可以包裹作为颗粒;用剪刀正确地解剖它。
   5. 将老鼠置于仰角位置。用 povidone 碘对腹膜区域进行沙化和消毒。让碘代表3分钟。
   6. 用手术刀在胸骨下面创建一个1.5 厘米的剖腹手术。在切割区域周围放置湿无菌纱布。
   7. 识别胃部旁边的脂肪垫。使用钳子小心地抓住动量, 轻轻地将其从腹腔拉出, 并将其铺在纱布上。
      请注意:口腔组织从脾脏延伸到十二指肠, 并在中期附着在胃部。接受胰岛素治疗的糖尿病大鼠在纱布上扩散时, 正常的动量约为2厘米。
   8. 使用预热37°c 无菌盐水的2毫升对口腔组织进行水合作用。使用小弯曲钳操纵组织, 并穿透在外层之间的针的腹部。将针头完全插入。
   9. 慢慢开始注射胰岛制剂, 并小心地向后移动针头, 将胰岛注射到几个地方 (如线)。在取出针头之前, 请确保水凝胶已停止离开针头, 以避免丢失分散的小岛。
   10. 根据需要重复此操作, 使用不同的入口点注射注射器的全部内容物, 以便将胰岛分布在整个口腔组织中。
       请注意:在大鼠中, 一般需要注射四到五次。
   11. 检查胰岛在注射结束时是否聚集在注射器中。
       请注意:如果某些胰岛仍然可见, 则可以从注射器中取出针头, 用100μl 的空水凝胶直接填充注射器, 然后重新连接针头。可以进行第二轮注射, 将剩余的小岛冲洗干净。
   12. 再次使用无菌生理盐水补充腹腔切开术的腹腔组织和壁。使用钳子小心地替换腹腔内的动量。
   13. 将2毫升预热无菌盐水注入腹腔, 使大鼠补水。
   14. 使用连续的螺纹缝合来关闭肌肉壁。然后用单针点 (逐点) 缝合皮肤层。
   15. 每天一次, 在皮下注射美洛昔康 (1.5 mg/kg) 作为镇痛药, 为期5天。
   16. 将大鼠放入笼子中的加热垫上, 直到麻醉恢复。对所有受者大鼠重复此过程。
   17. 每天测量移植后的血糖。如果血糖是 & gt;2 g/l, 每天注射 6 u 长期注射胰岛素皮下注射一次。
   18. 通过血糖和 c-肽监测在1个月或2个月内评估移植功能。
       请注意:在移植成功的情况下, 血糖应在移植后2-5 内稳定, 大鼠可以脱下胰岛素。

3. 人工移植术

请注意:此过程将允许确认良好的移植功能。在检索到功能性移植后, 大鼠应恢复到糖尿病状态。此步骤是在代谢随访1或2个月后执行的。

1. 用气体麻醉对大鼠进行麻醉, 并将其置于仰角位置。
2. 将腹膜区域粉碎, 用聚维酮碘消毒3分钟。
3. 用手术刀在胸骨下面创建一个1.5 厘米的剖腹手术。将湿无菌纱布放置在切割区域周围。
4. 识别胃部旁边的动量。使用钳子小心地将其涂在纱布上。
5. 用剪刀切除动量。从粘附在胰腺尾部 (脾脏旁边) 的部分开始。如果发生出血, 请使用干燥的无菌纱布来止血。
6. 继续沿着连接到胃的部分切除, 并找回动量。
   请注意:在这个地方, 胃上动脉 (图 1) 如果不小心被割伤, 会引起大量出血。动脉切口是不可避免的检索移植物, 但出血可以通过钳子和纱布管理。如果发生意外切割, 请用干纱布牢固压缩, 并将压缩保持至少1分钟。出血应该停止。如果没有, 可以使用夹子或电动双鱼对容器进行烧焦。

图 1: 动脉分布.对于胃移植的解释, 由胃上动脉组成的临界区域是蓝色的。在切除这部分腹腔组织时, 必须注意右胃内动脉部分。压缩、结扎或烧焦可用于限制出血。请点击这里查看此图的较大版本.

7. 检查是否有出血持续。如果没有, 注射2毫升预热盐水, 关闭大鼠, 并按照前面所述进行处理。
    被放生的动物回到糖尿病状态。胰岛素注射 (6 usc1天) 是强制性的, 以确保动物的福祉。
8. 使用过量的戊巴比妥 (182.2 mg/kg) 解释后10至12天对大鼠进行安乐死。

4. 组织学分析: 血红素和 eosin 染色

1. 用4% 的甲醛 (pfa) 修复回收的单胞菌, 并嵌入石蜡中。
2. 切割厚度为4μm 的切片, 并应用血红素和 eosin 染色进行移植的形态学评估。

5. 统计分析

1. 利用统计分析软件和方差重复度量分析 (anova), 以图基的诚实意义差异检验为后临时检验, 确定统计意义。p值表示: *p < 0.05;* * p < 0.01;p < 0.001。

h份方法允许避免血管内植入和将胰岛限制在器官中。整个胰岛植入术 (包括麻醉) 的最长时间为 8-10, 这是一个与经典肝移植相当的时间表。

为了研究胰岛在口腔组织内的分布方式, 采用 h册方法移植了右旋糖珠 (图 2)。植入后的一天, 大鼠被牺牲, 并检索到子宫组织进行组织学分析。血红素和 eosin 染色显示珠子在整个组织中的均匀分布 (图 2, 右下角)。很多时候, 珠子靠近血管, 很好地植入了脂肪组织。植入后, 立即发生炎症反应周围的珠子, 导致组织重排, 以嵌套在组织中的胰岛。

图 2: 植入一天后, 霍明技术和珠子通过口腔组织的分布的描述.(a) 采矿技术的说明。器官暴露 (a, 左) 后, 胰岛水凝胶混合 (这里被蓝色糊精珠取代, 以更好的可视化) 被仔细注射在组织中使用无毛针 (a, 中间)。植入组织中的珠子是可见的 (a, 右)。(b) 注射珠子后 1天, 血红素和奥辛染色。珠子在组织中被发现, 分布均匀。刻度栏 = 100 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.

为了验证这项技术, 我们使用刘易斯大鼠 (n=8 8) 进行了等基因研究。使用 h份法对每公斤大鼠体重接受胰岛移植 (7660胰岛当量, ieq) 的糖尿病大鼠进行了为期两个月的血糖和 c-肽血症监测。血糖通过植入胰岛素颗粒来控制 (以证明图 3a中观察到的血糖第一下降)。移植功能反映在血糖约 2 gl 和 c-多肽 & gt;500 pm。移植前, 大鼠为糖尿病 (血糖和 gt;5 gl 和 c-gtidemia & lt;200 pm)。在移植和胰岛素颗粒回收后, 仅在 h份移植后3天观察到血糖维持和归一化, 并一直持续到移植物检索 (p < 0.05 与移植前水平相比)。经过自我解释, 血糖再次上升到移植前的水平, 这证明了霍明移植的小岛的功能 (图 3a)。C-peptidemia 模式正好相反, 在移植之前, c-多肽模式很低, 甚至无法检测到, 然后在整个研究过程 (p & lt;0.05) 中增加和维持这一增加的水平, 在进行实验解释后,(图 3b)。组织学对其解释的分析显示, 高度再血管化的胰岛, 很可能是由于它们靠近血管 (图 3c)。

图 3: 接受 homing 和移植物评估的大鼠的两个月代谢随访.(a) 使用海藻酸盐作为胰岛载体后的血糖测量和 (b) c-肽评估 (tx: 移植和胰岛素颗粒回收;外植: 外种的出展)。移植是功能性的, 如胰岛素颗粒回收后维持正常血糖和胰岛植入后 c-肽血症增加所示。灰色阴影区域表示每个时间点的最小值和最大记录值。(c) 采用 h名方法对胰岛移植后的口腔切片进行血红素和 eosin 染色。胰岛在植入两个月后很好地融入组织, 没有任何周围的纤维化组织。船只在小岛周围和里面生长, 如箭头所示, 从而完全恢复了胰岛的功能。小岛的形态似乎也保存得很好。标度条 = 50μm. (n = 8) (*p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001, 使用 tukey 的诚实意义差异测试作为事后测试确定)。请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。