利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

摘要

本文介绍了在存在靶向RNA的小分子的情况下，通过引物延伸分析法（SHAPE）进行体外和细胞内选择性2'-羟基乙酰化的详细实验方案，以确定pre-mRNA目标序列的二级结构。

摘要

在靶向RNA的小分子药物研发过程中，阐明这些小分子与靶标RNA序列相互作用所引起的结构变化具有重要意义。本文提供了一种详细的体外（in vitro）和细胞内选择性2'-羟基酰化引物延伸分析（SHAPE）实验方案，用于研究实验性脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗药物SMN-C2存在下，SMN2基因前体mRNA外显子7的RNA结构变化。在体外SHAPE实验中，通过T7 RNA聚合酶转录一段包含SMN2外显子7的140个核苷酸长的RNA序列，在SMN-C2存在条件下进行折叠，随后使用温和的2'-OH酰化试剂2-甲基烟酰基咪唑（NAI）对其进行修饰。该2'-OH-NAI加合物进一步通过³²P标记的引物延伸进行检测，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离分析。相反，细胞内SHAPE中的2'-OH酰化是在活细胞中原位进行的，针对的是结合了SMN-C2的细胞内RNA。随后通过PCR扩增SMN2基因外显子7的前体mRNA序列以及引物延伸过程中由SHAPE诱导产生的突变，并进行高通量测序分析。比较这两种方法，体外SHAPE成本较低，且无需借助计算工具即可直观呈现结果。然而，体外SHAPE获得的RNA结构模型有时会偏离细胞环境中的真实二级结构，可能是因为缺失了与RNA结合蛋白的所有相互作用。细胞内SHAPE无需使用放射性材料操作场所，能够更准确地反映细胞环境下的RNA二级结构。此外，通过采用高通量测序技术，细胞内SHAPE通常适用于更长的RNA序列范围（约1,000个核苷酸），而体外SHAPE通常依赖PAGE分析，适用长度较短（约200个核苷酸）。对于SMN2前体mRNA的外显子7而言，体外与细胞内SHAPE所获得的RNA结构模型彼此相似。

引言

通过引物延伸分析选择性2'-羟基酰化（SHAPE）是一种用于测量目标RNA序列中每个核苷酸动力学并解析其二级结构的方法，分辨率可达单个核苷酸水平¹。目前已开发出在体外条件^2,3,4（即在确定的缓冲体系中使用纯化的RNA）以及在活体哺乳动物细胞内^5,6应用的SHAPE技术，用于研究中等长度RNA序列的二级结构（通常在细胞内SHAPE中为<1,000个核苷酸，在体外SHAPE中为<200个核苷酸）。该方法特别适用于评估受体RNA在结合RNA相互作用的小分子代谢物时发生的结构变化^2,4,7,8，以及在药物开发过程中研究靶向RNA分子的作用机制^9,10。

方案

1. 体外 SHAPE

注意：本方案修改自已发表的方案¹。

1. 制备RNA模板
   注意： 用于T7转录的模板以合成的双链DNA（dsDNA）形式订购，并通过插入以下任一方式扩增 E. coli 携带独特EcoRI/BamHI限制性内切酶位点（如pET28a）的载体，或通过PCR方法。以下为PCR扩增的操作步骤。
   1. 混合以下材料：50 μL PCR预混液（见 材料表），每种引物各2 μL（10 μM，见 表1 （用于序列分析），200 ng 双链DNA模板（2 μL）、3 μL 二甲基亚砜（DMSO）和41 μL H₂O. 分装至两个PCR管中（每管含50 μL反应混合液）。
   2. 设置热循环仪程序如下：第一阶段：95 °C 预变性 30 秒；第二阶段：95 °C 变性 20 秒；第三阶段：56 °C 退火 20 秒；第四阶段：72 °C 延伸 20 秒；第五阶段：返回第二阶段，循环 30 次；第六阶段：72 °C 最终延伸 3 分钟；第七阶段：4 °C 无限期保存，直至进行下一步操作。
   3. 通过凝胶切胶回收纯化PCR扩增产物（参见

结果

我们先前已证明，一种RNA剪接调节剂SMN-C2可与SMN2基因pre-mRNA外显子7上的AGGAAG基序相互作用，并利用SHAPE技术评估了在SMN-C2存在下RNA结构的变化⁶。SMN-C2的结合位点不同于美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗的反义寡核苷酸（ASO）nusinersen，后者结合并阻断位于内含子7的内含子剪接沉默子（ISS）^27,28（图1A）。目前已知的大多数SMN2外显子7剪接调控元件均位于pre-mRNA中外显子7约100个核苷酸范围内²⁹；因此，分别采用长度为140和276个核苷酸的RNA序列进行体外和细胞内SHAPE分析，以覆盖外显子7及其相邻的内含子区域（图1A）。

讨论

在体外 SHAPE 实验中，使用高质量且均一的 RNA 模板至关重要。然而，T7 转录通常会产生异质性序列³⁶。特别是，在 3' 末端带有 ±1 个核苷酸且产量不可忽略的序列³⁶，通常难以通过聚丙烯酰胺凝胶纯化去除。异质性 RNA 模板可能导致引物延伸产物在测序凝胶分析中出现多组信号，有时会使结果难以解读。在 RNA 模板表达盒的 5' 和 3' 两端引入核酶，可使两端序列均一化。

体外和细胞内 SHAPE 实验中，2'-OH 修饰试剂的孵育时间是另一个关键因素。Weeks 团队建议，孵育时间应至少为水解型 2'-OH 酰化试剂半衰期的五倍¹在我们实验中，与NAI孵育T_1/2 约20分钟 >体外和细胞内 SHAPE 反应时间达到 30 分钟会导致过度反应的结果。如图所示 图1D，一个良好的 体外 SHAPE 分析应具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNA寡核苷酸	IDT		gBlock 用于 >200 bp DNA合成
Phusion Green Hot Start II 高保真 PCR 预混液	赛默飞世尔科技	F566S
NucleoSpin 凝胶和 PCR 产物纯化试剂盒	Takara	740609.50
MegaScript T7 转录试剂盒	赛默飞世尔科技	AM1333	包含10x反应缓冲液、T7酶、NTP和Turbo DNase
DEPC处理水	赛默飞世尔科技	750023
2x TBE-尿素上样缓冲液	赛默飞世尔科技	LC6876
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）	Bio-Rad	1610146
10x TBE 缓冲液	赛默飞世尔科技	15581044
Nalgene 快速流™ 滤波单元	赛默飞世尔科技	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	赛默飞世尔科技	17919
SYBR-Safe 染料	赛默飞世尔科技	S33102
6% TBE-尿素微型凝胶	赛默飞世尔科技	EC6865BOX
ChemiDoc	伯乐（Bio-Rad）
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
高通量筛选™ 增强型屏幕	GE Healthcare	RPN1669	钨酸钙荧光屏
磷光存储屏	分子动力学	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI（2M）	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	赛默飞世尔科技	AM9515
SuperScript IV 逆转录酶	赛默飞世尔科技	18090010	包含 5x RT 缓冲液、SuperScript IV
dNTP混合液（10 mM）	赛默飞世尔科技	R0192
ddNTP 集合（5 mM）	Sigma	GE27-2045-01
大号滤纸	Whatman	1001-917
凝胶干燥仪	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA血液小型试剂盒	Qiagen	51104	还含有 RNase A 和蛋白酶 K
SMN2 微型基因34	Addgene	72287
热灭活胎牛血清	赛默飞世尔科技	10438026
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122
Opti-MEM I	赛默飞世尔科技	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	赛默飞世尔科技	12605010
不含 Ca/Mg 的 DPBS	赛默飞世尔科技	14190250
TRIzol	赛默飞世尔科技	15596018
RNeasy mini 柱	Qiagen	74104	还含有 RW1 缓冲液、RPE 缓冲液
RNase-Free DNase 试剂盒	Qiagen	79254	含有 DNase I 和 RDD 缓冲液
去离子甲酰胺	赛默飞世尔科技	AM9342
MnCl2•4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
随机九聚体	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript 第一链合成系统	赛默飞世尔科技	11904-018	包含10x RT缓冲液、SuperScript II逆转录酶
AccuPrime pfx DNA聚合酶	赛默飞世尔科技	12344024
NextSeq500	Illumina
NucAway 柱	赛默飞世尔科技	AM10070	用于脱盐目的