利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

摘要

本文介绍了在存在靶向RNA的小分子的情况下，通过引物延伸分析法（SHAPE）进行体外和细胞内选择性2'-羟基乙酰化的详细实验方案，以确定pre-mRNA目标序列的二级结构。

摘要

在靶向RNA的小分子药物研发过程中，阐明这些小分子与靶标RNA序列相互作用所引起的结构变化具有重要意义。本文提供了一种详细的体外（in vitro）和细胞内选择性2'-羟基酰化引物延伸分析（SHAPE）实验方案，用于研究实验性脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗药物SMN-C2存在下，SMN2基因前体mRNA外显子7的RNA结构变化。在体外SHAPE实验中，通过T7 RNA聚合酶转录一段包含SMN2外显子7的140个核苷酸长的RNA序列，在SMN-C2存在条件下进行折叠，随后使用温和的2'-OH酰化试剂2-甲基烟酰基咪唑（NAI）对其进行修饰。该2'-OH-NAI加合物进一步通过³²P标记的引物延伸进行检测，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离分析。相反，细胞内SHAPE中的2'-OH酰化是在活细胞中原位进行的，针对的是结合了SMN-C2的细胞内RNA。随后通过PCR扩增SMN2基因外显子7的前体mRNA序列以及引物延伸过程中由SHAPE诱导产生的突变，并进行高通量测序分析。比较这两种方法，体外SHAPE成本较低，且无需借助计算工具即可直观呈现结果。然而，体外SHAPE获得的RNA结构模型有时会偏离细胞环境中的真实二级结构，可能是因为缺失了与RNA结合蛋白的所有相互作用。细胞内SHAPE无需使用放射性材料操作场所，能够更准确地反映细胞环境下的RNA二级结构。此外，通过采用高通量测序技术，细胞内SHAPE通常适用于更长的RNA序列范围（约1,000个核苷酸），而体外SHAPE通常依赖PAGE分析，适用长度较短（约200个核苷酸）。对于SMN2前体mRNA的外显子7而言，体外与细胞内SHAPE所获得的RNA结构模型彼此相似。

引言

通过引物延伸分析选择性2'-羟基酰化（SHAPE）是一种用于测量目标RNA序列中每个核苷酸动力学并解析其二级结构的方法，分辨率可达单个核苷酸水平¹。目前已开发出在体外条件^2,3,4（即在确定的缓冲体系中使用纯化的RNA）以及在活体哺乳动物细胞内^5,6应用的SHAPE技术，用于研究中等长度RNA序列的二级结构（通常在细胞内SHAPE中为<1,000个核苷酸，在体外SHAPE中为<200个核苷酸）。该方法特别适用于评估受体RNA在结合RNA相互作用的小分子代谢物时发生的结构变化^2,4,7,8，以及在药物开发过程中研究靶向RNA分子的作用机制^9,10。

以RNA为靶点的药物发现最近在学术实验室和制药行业中引起了广泛关注^11,12，相关研究采用了多种不同的方法和策略^13,14,15,16。近期用于临床的靶向RNA的小分子药物实例包括两种结构不同的实验性药物LMI-070¹⁷和RG-7916^18,19，它们用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA），在II期临床试验中显示出良好的疗效²⁰。研究表明，这两种分子均可作用于运动神经元存活基因（SMN）2的前体mRNA，并调控SMN2基因的剪接过程^6,17,21。我们此前已证实，in vitro和细胞内SHAPE技术可用于检测在RG-7916类似物SMN-C2存在下靶标RNA结构的变化⁶。

原则上，SHAPE 方法以无偏倚的方式，在过量自猝灭酰化试剂存在条件下，测量 RNA 序列中每个核苷酸的 2'-OH 酰化速率。该酰化试剂在水中不稳定，半衰期较短（例如，1-甲基-7-硝基异喹啉酸酐（1M7）的半衰期 T_1/2 = 17 秒；2-甲基烟酰胺咪唑酯（NAI）约为 20 分钟），且对碱基种类不敏感²²²³。这导致柔性碱基的 2'-OH 基团更易发生酰化，从而可转化为对每个核苷酸动态特性的精确评估。具体而言，处于碱基配对状态的核苷酸通常比未配对的核苷酸对 2'-OH 修饰试剂（如 NAI 和 1M7）的反应活性更低。

根据RNA模板的来源以及2'-OH酰化发生的位置，SHAPE通常可分为体外SHAPE（in vitro SHAPE）和细胞内SHAPE（in-cell SHAPE）。体外SHAPE使用纯化的T7转录RNA，其实验设计缺乏细胞环境背景。而在细胞内SHAPE中，RNA模板的转录和2'-OH酰化均在活细胞内进行，因此其结果能够重现RNA在细胞环境中的结构模型。在文献中，细胞内SHAPE也被称为体内SHAPE（in vivo SHAPE），用于指代在活细胞中进行的SHAPE实验²⁴。由于该实验并非在动物体内进行，为准确起见，我们将该实验称为细胞内SHAPE（in-cell SHAPE）。

体外和细胞内SHAPE的引物延伸阶段策略也有所不同。在体外SHAPE中，逆转录在Mg²⁺存在的情况下会在2'-OH酰化位点终止。因此，使用³²P标记的引物延伸产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中表现为一条条带，条带强度与酰化速率成正比¹。在细胞内SHAPE中，逆转录在Mn²⁺存在的情况下会在2'-OH加合物位点产生随机突变。通过深度的下一代测序可捕获每个核苷酸的突变率，进而计算出单核苷酸分辨率的SHAPE反应活性。

细胞内SHAPE技术的一个潜在问题是信噪比较低（即大多数2'-OH基团未被修饰，而未修饰的序列在下一代测序中占据了大部分读段）。最近，Chang实验室开发了一种富集2'-OH修饰RNA的方法，称为体内点击SHAPE（icSHAPE）²⁵。这种富集方法在研究弱效小分子与RNA相互作用时可能具有优势，尤其是在全转录组范围的检测中。

方案

1. 体外 SHAPE

注意：本方案修改自已发表的方案¹。

1. 制备RNA模板
   注意： 用于T7转录的模板以合成的双链DNA（dsDNA）形式订购，并通过插入以下任一方式扩增 E. coli 携带独特EcoRI/BamHI限制性内切酶位点（如pET28a）的载体，或通过PCR方法。以下为PCR扩增的操作步骤。
   1. 混合以下材料：50 μL PCR预混液（见 材料表），每种引物各2 μL（10 μM，见 表1 （用于序列分析），200 ng 双链DNA模板（2 μL）、3 μL 二甲基亚砜（DMSO）和41 μL H₂O. 分装至两个PCR管中（每管含50 μL反应混合液）。
   2. 设置热循环仪程序如下：第一阶段：95 °C 预变性 30 秒；第二阶段：95 °C 变性 20 秒；第三阶段：56 °C 退火 20 秒；第四阶段：72 °C 延伸 20 秒；第五阶段：返回第二阶段，循环 30 次；第六阶段：72 °C 最终延伸 3 分钟；第七阶段：4 °C 无限期保存，直至进行下一步操作。
   3. 通过凝胶切胶回收纯化PCR扩增产物（参见 材料清单 并按照制造商的说明书进行操作）。用35 μL含10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA的Tris-EDTA（TE）缓冲液洗脱产物DNA，获得浓度为0.1–0.5 μg/μL的模板。将纯化的DNA模板标准化至0.10 μg/μL。
      注意： 可选地，可取0.10 μg DNA在1.8%琼脂糖凝胶电泳上分析模板的质量。凝胶上应出现一条符合预期的模板DNA单一条带。
   4. 在PCR管中加入以下试剂，配制T7转录反应体系（总体积40 μL）：10×反应缓冲液4 μL、ATP 4 μL、CTP 4 μL、GTP 4 μL、UTP 4 μL、T7酶4 μL（参见 材料表)，4 μL 来自步骤 1.1.3 的纯化 PCR 扩增产物（0.4 μg）以及 12 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水。用移液器吹吸混匀 4 次。在热循环仪或 37 °C 培养箱中于 37 °C 孵育 4–16 小时。
      注意： 在步骤 1.1.4 的反应进行的同时，开始准备步骤 1.1.6。
   5. 加入 2 μL DNase，用移液器轻轻吹打混匀 4 次，37 °C 孵育 15 分钟。与等体积的 2× Tris-硼酸-EDTA（TBE）-尿素上样缓冲液混合（参见 材料表70 °C 加热 3 分钟以灭活。
   6. 在无RNase的瓶子中，混合75 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1，参见 材料表)，180.2 g 尿素，以及 50 mL 10× TBE 缓冲液（无 RNase，参见 材料表）。将瓶子置于摇床（250 rpm）上振荡，直至尿素晶体完全溶解（可能需要长达2 h）。用经DEPC处理的水定容至500 mL。使用0.2 μm滤膜过滤溶液（参见 材料表).
      注意： 在此过程中，避免使用光亮器械和搅拌子，以防止RNase污染。该溶液可在4 °C保存长达1年。
   7. 用去离子水和70%乙醇蘸取擦拭纸清洁两块适当尺寸（16.5 cm × 24 cm）的电泳玻璃板。将玻璃板与一对2.0 mm垫片对齐（硅化表面朝内），并用胶带密封玻璃板边缘。在玻璃板的角落处使用双层胶带，以防止漏液。
   8. 在烧杯中，用无RN酶的移液枪头将1.1.6步骤中的200 mL丙烯酰胺溶液、2.0 mL 10%过硫酸铵溶液和100 μL四甲基乙二胺（TEMED）迅速搅拌混合30秒。将玻璃板倾斜放置在实验台保护膜上，从玻璃板间隙倒入混合液。轻敲玻璃板以去除气泡，然后将玻璃板平放在实验台保护膜上。立即插入梳子，使凝胶聚合至少1小时。
      注意： 如果凝胶将在次日使用，用一张浸湿的纸巾覆盖凝胶表面，并用较大的塑料膜包裹。平放于4 °C保存。
   9. 移除胶带，将凝胶板固定在电泳槽中。取出梳子，在电泳槽上下室加入足量的1×TBE缓冲液。以20 W功率预电泳30分钟。
      注意： 可选地，如果目标RNA的纯度约为90%或更高，可用小胶替代制备胶。
   10. 用储液槽中的液体将每个加样孔吹打上下混合两次进行清洗。将步骤1.1.5中获得的粗提RNA加入加样孔中。以20 W功率电泳，直至二甲苯蓝FF染料（浅蓝色）迁移至凝胶约三分之二长度处（约60分钟）。
       注意： 确保上样量不超过上样孔高度的三分之一（必要时可使用多个上样孔）。
   11. 将凝胶浸入含有1:10,000稀释比例的安全染料的1x TBE缓冲液中（参见 材料表将凝胶放入足够大的容器中，置于摇床中，80 rpm 振荡 5 分钟。
   12. 在紫外光下识别目标 RNA 条带，并使用洁净的剃刀快速切取凝胶的细条带。将 1–2 块凝胶切片放入 1.7 毫升离心管
   13. 通过被动洗脱法从凝胶切片中回收RNA。向每管中加入适量洗脱/沉淀混合液（每片约0.3 mL）：含0.3 M NaOAc（pH 5.2）、2.5 M LiCl、1 mM EDTA和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的DEPC处理水中溶液。将含有凝胶切片的离心管在4 °C下旋转孵育16小时。
       注意： 此步骤的典型回收率约为 75%。为提高得率，可移除并收集洗脱液，加入相同体积的洗脱缓冲液，然后重复此步骤。
   14. 将洗脱液收集至新的1.7 mL离心管中。 加入2.5倍体积的预冷乙醇，倒置离心管6次以混匀液体，将离心管置于-80 °C环境中至少1小时。
   15. 以 10,000 x g 离心 10 分钟 g 以及 4 °C。用移液器小心吸除上清液。通过加入 80% EtOH（每管 1 mL）洗涤 RNA 沉淀，涡旋振荡 15 秒，然后在 10,000 x g 和 4 °C。
   16. 去除上清液，将RNA沉淀在空气中干燥5分钟。加入50 μL无RNase的水，用移液器吹吸混匀10次。将RNA浓度调整至0.10 μg/μL。将纯化的RNA于-80 °C保存。
       注意： 不要过度干燥RNA沉淀。
   17. 可选：为分析RNA质量，取1.1.16步骤中的RNA 1 μL（100 ng），加入5 μL水稀释，再与5 μL 2x TBE-尿素上样缓冲液混合。随后于70 °C加热3分钟，上样至6% TBE-尿素迷你凝胶中电泳。
       1. 以180 V电压电泳1小时。按照步骤1.1.11的方法进行染色。使用成像系统通过紫外光观察凝胶。在目标长度处应出现单一条带。
2. 准备 ³²P标记的引物
   1. 通过混合以下材料来设置反应：10 μL 的 γ-³²P-ATP（约1.5 mCi，约25 μM，参见 材料清单），2 μL 逆转录（RT）引物（100 μM，序列见 表1），10x T4 多核苷酸激酶（PNK）反应缓冲液 2 μL，T4 PNK 1 μL（参见 材料表），以及 5 μL 无 RNase 水。37 °C 下孵育 1 小时。
      警告： 步骤1.2至1.5需在经批准的放射性物质工作场所中进行适当的防护。 
   2. 65 °C 加热灭活 20 分钟。将样品加入脱盐柱中，1,000 × g 离心 1 分钟。将洗脱液与 25 μL 2× TBE-尿素上样缓冲液混合。 .
      注意： 若不立即纯化，将标记的粗产物于 -20 °C 保存。
   3. 以20 W功率运行10%丙烯酰胺凝胶1小时。
      警告： 加载 ³²将步骤1.2.1中的P标记引物上样至凝胶中，并避免放射性物质渗入上层缓冲槽。上样体积不应超过加样孔高度的三分之一，以确保在凝胶中形成清晰的条带（如有需要，可使用多个加样孔）。底部缓冲槽中的液体可能具有高放射性。
   4. 取下凝胶夹具的玻璃板，将凝胶置于一片塑料膜上。折叠塑料膜以覆盖凝胶顶部，形成密封的夹心结构。将凝胶夹心置于钨酸钙磷屏上，并使用成像仪进行曝光。再用普通光线对凝胶进行成像，以确定凝胶的边缘位置。
   5. 使用图像处理软件将两张图像叠加，使凝胶图像与打印的图像对齐。用新的剃须刀片切下凝胶中目标条带。将1至2片凝胶放入1.7 mL离心管中。
      注意： 确保打印出的图像与实际凝胶大小相同。在切下胶条后，通过再次成像剩余的凝胶来核对对齐情况。
   6. 回收 ³²P标记的引物，按照步骤1.1.13至1.1.16操作。取1.0 μL溶液至0.4 mL离心管中，用1×TE缓冲液稀释引物，使1.0 μL溶液的放射活性约为100,000 cpm。将纯化后的产物储存于-20 °C。 ³²将P标记的引物在-80 °C保存，直至进行RNA 2’-OH修饰反应，但保存时间不超过4周。
3. 小分子结合与RNA 2’-OH修饰
   1. 准备四个样本，将8 pmol RNA加入含32 μL 0.5x TE缓冲液的1.7 mL离心管中 mL离心管中，80 °C加热2 min，然后迅速置于冰上冷却至少1 min。
      注意： 使用以下公式计算RNA的近似分子量：MW =（碱基数）× 340 Da。
   2. 加入8 μL 5倍折叠混合液，其中含有500 mM HEPES（pH 8.0）、20 mM MgCl₂，以及 500 mM NaCl。将 9 μL RNA 混合物分装至四个 PCR 管中，分别标记为 #1–#4。向 #1 管中加入 1 μL 10% DMSO，向 #2 管中加入 1 μL 浓缩小分子溶液（10% DMSO），向 #3 管中加入 1 μL 稀释后的小分子溶液（10% DMSO），向 #4 管中加入 1 μL 水。
   3. 将PCR管置于PCR仪中，37 °C孵育30分钟。
   4. 在进行2’-OH修饰反应前，立即将1 μL NAI储存液（2 M）与3 μL DEPC处理水混合，配制成0.5 M的使用液。随即向1、2、3号管中各加入1 μL NAI使用液，向4号管中加入1 μL 25% DMSO。在PCR仪中37 °C孵育15分钟。
   5. 加入100 μL洗脱/沉淀混合液（配方见步骤1.1.13），2 μL糖原（15 mg/mL），并将每根PCR管中的全部液体转移至1.7 mL 离心管中。向每管加入 0.34 mL 冰冷的 200 proof 乙醇（3 倍体积）。涡旋混匀 5 秒，将离心管置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻至少 1 小时。
      注意： 在此期间，开始准备步骤 1.5.1 中将使用的测序凝胶。
   6. 离心15分钟，转速为14,000 x g 以及 4 °C。去除上清液时注意不要扰动RNA沉淀。通过加入80% EtOH（每管0.5 mL）洗涤RNA沉淀，涡旋15秒，然后在20,000 x g离心15分钟 g 以及 4 °C。再次移除上清液。
      注意： 可选地，使用盖革计数器确保放射性沉淀物保留在管内。
   7. 将RNA沉淀在空气中干燥5分钟。加入9 μL无RNase的水，用移液器吹吸混匀10次。
      注意： 不要过度干燥RNA沉淀。此步骤结束时，所有沉淀物应完全溶解。
4. 标记物制备与引物延伸
   1. 将修饰后的RNA转移至4个新的PCR管中，并如前所述标记为#1–#4。在另外4个PCR管中加入7 μL DEPC处理水中含2 pmol的对照RNA，并标记为#5–#8。向全部8个PCR管中各加入2 μL放射性标记引物（步骤1.2.6）。在热循环仪中于65 °C加热5 min以退火，随后立即降温至4 °C。
   2. 加入 4 μL 的 5x RT 缓冲液（参见 材料表），向八支PCR管中各加入1 μL二硫苏糖醇（DTT，0.1 M）和1 μL dNTP混合液（每种10 mM）。
   3. 加入 2 μL 经 DEPC 处理的 H₂向第1–4号管中加入ddATP。分别向第5–7号管中加入4 μL ddATP（5 mM）、4 μL ddTTP（5 mM）和4 μL ddCTP（5 mM）。向第8号管中加入1 μL ddGTP（5 mM）和3 μL DEPC处理水。用移液器吹打混匀4次。
   4. 在52 °C下于热循环仪中加热1分钟。加入1 μL逆转录酶（参见 材料表），然后用移液器上下吹打混合4次。在52 °C下孵育反应20分钟。
   5. 向每个试管中加入1 μL 5 M NaOH以水解RNA。将试管在95 °C加热5分钟。
   6. 加入5 μL 1 M HCl，重复乙醇沉淀步骤（1.3.5和1.3.6），但省略糖原添加和液体转移。
      注意： 省略步骤1.4.6会导致凝胶中部出现称为“盐前沿”的模糊区域。
   7. 将DNA沉淀在空气中干燥5分钟。加入10 μL H₂加入2×TBE-尿素上样缓冲液10 μL，用移液器吹吸混匀10次以重新溶解。70 °C加热5分钟。上样前将离心管置于冰上冷却。
5. PAGE 分析
   1. 要制备8%的聚丙烯酰胺测序凝胶，请按照步骤1.1.6至1.1.10进行操作，但需进行以下修改：使用100 mL的40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）来配制8%的丙烯酰胺溶液，并使用测序凝胶玻璃板（例如，46 × 57 厘米）配以 0.4 毫米间隔垫片。
   2. 加载步骤 1.4.7 中的 10 μL 样品，在 65 W 条件下运行凝胶 2 h，或直至底部染料迁移至凝胶的3/4处。
      注意： 如有需要，将剩余样品于 -80 °C 保存以备重复实验。
   3. 移除间隔物，轻轻插入刮刀，取下顶部硅化玻璃板。将一张大号滤纸覆盖在凝胶上，轻轻按压，使凝胶黏附于滤纸。从底部开始，提起滤纸，连同凝胶一起从玻璃板上剥离。
   4. 将凝胶连同滤纸一起放置在足够覆盖整个凝胶的塑料膜上（滤纸朝上）。将滤纸/凝胶/塑料膜的夹心结构转移至凝胶干燥器中，滤纸面朝下。
      注意： 为避免放射性物质污染，在凝胶夹层与凝胶干燥器之间使用3至4张较大的滤纸。
   5. 在70 °C下真空干燥凝胶1小时。将凝胶夹心结构转移至经曝光漂白的磷屏存储屏盒中。使凝胶的放射性暴露于屏上4–16小时。
   6. 将磷光存储屏置于成像设备上，以中等分辨率扫描（约30分钟）。
      注意： 如果凝胶图像上存在类似微笑的条带弯曲现象，请使用校正软件（例如，SAFA）处理图像以达到可发表的质量。请注意，标准标记物泳道比2’-OH修饰泳道长1个核苷酸。

2. 细胞内 SHAPE

1. 引物设计
   注意： 与体外 SHAPE 不同，细胞内 SHAPE 无需设计表达载体。然而，应使用一组优化的引物，并在 SHAPE 实验前对其进行验证。
   1. 使用基于BLAST的引物设计工具生成至少三对独特的引物对例如，Primer-BLAST）。为研究人细胞中的前体mRNA，请在引物对特异性检测参数中选择人类基因组（而非转录组）作为参考数据库。扩增片段大小应选择在200–1,000碱基对（bp）范围内。
   2. 从约10个样本中提取基因组DNA⁶ 使用RNase A和蛋白酶K处理，采用基于离心柱的方法分离目的细胞（参见 材料表 并按照制造商的说明书操作）。将纯化的基因组DNA用TE缓冲液调整至0.1 μg/μL。
   3. 按照步骤 1.1.1 和 1.1.2 中的方案进行测试 PCR。
      注意： 理想的引物组应在1.8%琼脂糖凝胶上产生单一条带。
2. 细胞制备与2’-OH修饰
   注意： 为增加目的pre-mRNA的丰度，将含有正确序列且在巨细胞病毒（CMV）启动子驱动下组成型表达的微型基因转染至宿主细胞中。
   1. 预先将含有10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素混合液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）在37 °C预热。转染前24小时，以50%汇合度在培养基中接种293T细胞。转染前约1小时，更换为不含抗生素、含2% FBS的DMEM培养基。
   2. 加入10 μg微基因质粒至100 μL低血清培养基中（参见 材料表在96孔板的1个孔中，上下吹打溶液4次以混匀。
   3. 加入40 μL转染试剂（参见 材料表将上述混合物加入另一孔中含100 μL低血清培养基的孔内，用移液器轻轻吹打混匀4次，室温孵育5分钟。
   4. 将全部质粒溶液加入转染试剂悬浮液中。用移液器轻轻吹打混匀4次，室温孵育30分钟。
   5. 将全部DNA/转染试剂混合物逐滴加入培养皿中培养基的表面。在37 °C孵育6–12小时。
   6. 吸弃培养基，用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，不含 CaCl₂）轻柔洗涤一次。₂ 和 MgCl₂，参见 材料表用3 mL胰蛋白酶溶液消化细胞，在室温下孵育5分钟。
   7. 轻轻敲击培养皿，使细胞从皿底解离。加入6 mL培养基中和胰酶。以300 x g离心 g 孵育4分钟，然后移除培养基。
   8. 重悬约10⁶ 每个样本将细胞重悬于199 μL反应培养基（含1% FBS的DMEM）中，并将细胞悬液转移至96孔板。在37 °C孵育30分钟，实验组加入1 μL化合物工作液，三个对照组均加入1 μL DMSO。
      注意： 应包括三个对照样本：含NAI的DMSO对照、变性RNA与NAI对照，以及NAI阴性对照。
   9. 除变性对照（DC）RNA 和 NAI 阴性对照外，向每个样品中加入 10 μL 2 M NAI。用移液器吹打混合 4 次。37 °C 孵育 15 分钟。每隔 5 分钟轻轻振摇培养板以重新悬浮细胞。
   10. 将细胞转移至 1.7 mL 离心管，400 x g 离心 g 立即离心2分钟。去除上清液时勿扰动细胞沉淀。
   11. 加入0.4 mL硫氰酸胍（见 材料表涡旋15秒以混匀。室温孵育样品5分钟。
       注意： 样品可在 -20 °C 保存，直至进行下一步操作。
3. RNA提取
   1. 向每份硫氰酸胍均质样品中加入0.2 mL氯仿，涡旋振荡15秒，室温孵育2分钟。
   2. 离心5分钟，12,000 x g 以及 4 °C。上层无色水相含有 RNA。将约 380 μL 水相溶液转移至新的 1.7 毫升离心管
      警告： 不要扰动两相界面，以免造成污染。
   3. 加入1.5倍体积的乙醇（约570 μL）。涡旋振荡15秒以混匀。
   4. 将600 μL RNA混合液转移至RNA分离离心柱中（参见 材料表）。在12,000 x g 15秒。弃去洗脱液。重复此步骤，使所有液体通过同一离心柱。
   5. 用 0.35 mL 的 RW1 缓冲液洗涤柱子（参见 材料表) 通过离心15秒。加入80 μL无RNase的DNase I（溶于RDD缓冲液中）（参见 材料表室温孵育20分钟。
      注意： 必须彻底去除所有DNA污染。
   6. 随后用 0.35 mL RW1 缓冲液和 0.6 mL 2x RPE 缓冲液洗涤柱子（参见 材料表) 每步以15秒离心。将吸附柱放入空收集管中，于12,000 x g离心，以干燥柱子。 g 1 分钟。
   7. 向柱子的中心加入 32 μL 无 RNase 水。孵育 1 分钟。在 12,000 x g 30秒，以获得约30 μL的纯化RNA溶液。在处理变性样品时，将样品置于-20 °C保存。
4. 变性RNA对照制备
   1. 将30 µL RNA样品用于DC，置于1.7 将1 mL塑料管置于冰上。向管中加入50 μL甲酰胺和15 μL DC缓冲液（含300 mM HEPES（pH 8.0）和25 mM EDTA）。
   2. 加热至95 °C持续1分钟以变性RNA。迅速加入5 μL NAI储存液（2 M），轻轻弹动混匀两次，立即将离心管放回加热块中。在95 °C继续孵育1分钟，随后立即置于冰上。
   3. 加入0.4 mL硫氰酸胍。重复步骤2.3.1–2.3.4。
   4. 用 0.6 mL 的 2x RPE 缓冲液洗涤柱子（参见 材料表) 每步离心15秒。将吸附柱放入空的收集管中，于12,000 x g离心，以干燥柱子。 g 1 分钟。
   5. 向柱子的中心加入 32 μL 无 RNase 水。孵育 1 分钟。在 12,000 x g 30秒，以获得约30 μL的回收DC RNA溶液。
5. 引物延伸
   1. 将2.3.7和2.4.5中的RNA溶液用无RN酶水稀释至0.5 μg/μL。新鲜配制30 mM MnCl₂₂ 来自 MnCl 的溶液₂∙4H₂O型粉末
   2. 将每个样本的 9 μL RNA 溶液转移至 PCR 排管中。在每管中加入 1 μL 10 mM dNTP 和 1 μL 2 μM 基因特异性引物（GSP）。用移液器吹打混匀 4 次。在 PCR 仪中 65 °C 孵育 5 分钟，随后置于冰上 >1 分钟
      注意： 或者，可使用1 μL随机九聚体替代GSP。
   3. 在每个PCR管中，加入2 μL 10x RT缓冲液的混合物（参见 材料表)，30 mM MnCl₂ 4 μL₂，以及2 μL 100 mM DTT。用移液器吹打混合4次。在42 °C孵育2分钟。
   4. 加入1 μL逆转录酶（见 材料表用移液器上下吹打4次以混匀。在42 °C下于热循环仪中孵育3 h。
6. 文库构建与下一代测序
   1. 加入1 μL DNA聚合酶和5 μL 10x DNA聚合酶缓冲液（参见 材料表)，2 μL DMSO，每种引物各1.5 μL（10 μM），34 μL H₂O₂O，以及步骤 2.5.4 中获得的 5 μL cDNA
   2. 设置热循环仪程序如下：第一阶段：95 °C 预变性 2 分钟；第二阶段：95 °C 变性 30 秒；第三阶段：60 °C 退火 30 秒；第四阶段：68 °C 延伸 30 秒；第五阶段：返回第二阶段，循环 30 次；第六阶段：68 °C 最终延伸 3 分钟；第七阶段：4 °C 无限期保存，直至进行下一步操作。
   3. 使用1.8%琼脂糖凝胶纯化扩增产物。
      注意： PCR条带应在凝胶上呈现为单一条带。
   4. 使用文献中已建立的标准片段化和连接方法构建文库^6,26.
   5. 使用下一代测序设备进行测序，采用1 x 75单端读长，每个样本产生约1000万条读段。
   6. 使用 Weeks 团队开发的 ShapeMapper 和 SuperFold 软件包分析结果²⁶.

结果

我们先前已证明，一种RNA剪接调节剂SMN-C2可与SMN2基因pre-mRNA外显子7上的AGGAAG基序相互作用，并利用SHAPE技术评估了SMN-C2存在下的RNA结构变化⁶。SMN-C2的结合位点不同于美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗的反义寡核苷酸（ASO）nusinersen，后者结合并阻断位于内含子7的内含子剪接沉默子（ISS）^27,28（图1A）。目前已知的大多数SMN2外显子7剪接调控元件均位于pre-mRNA中外显子7约100个核苷酸范围内²⁹；因此，分别采用长度为140和276个核苷酸的RNA序列进行体外和细胞内SHAPE分析，以覆盖外显子7及其相邻的内含子区域（图1A）。

讨论

在体外 SHAPE 实验中，使用高质量且均一的 RNA 模板至关重要。然而，T7 转录通常会产生异质性序列³⁶。特别是，在 3' 末端带有 ±1 个核苷酸且产量不可忽略的序列³⁶，通常难以通过聚丙烯酰胺凝胶纯化去除。异质性 RNA 模板可能导致引物延伸产物在测序凝胶分析中出现多组信号，有时会使结果难以解读。在 RNA 模板表达盒的 5' 和 3' 两端引入核酶，可使两端序列均一化。

体外和细胞内 SHAPE 实验中，2'-OH 修饰试剂的孵育时间是另一个关键因素。Weeks 团队建议，孵育时间应至少为水解型 2'-OH 酰化试剂半衰期的五倍¹在我们实验中，与NAI孵育T_1/2 约20分钟 >体外和细胞内 SHAPE 反应时间达到 30 分钟会导致过度反应的结果。如图所示 图1D，一个良好的 体外 SHAPE 分析应具...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNA寡核苷酸	IDT		gBlock 用于 >200 bp DNA合成
Phusion Green Hot Start II 高保真 PCR 预混液	赛默飞世尔科技	F566S
NucleoSpin 凝胶和 PCR 产物纯化试剂盒	Takara	740609.50
MegaScript T7 转录试剂盒	赛默飞世尔科技	AM1333	包含10x反应缓冲液、T7酶、NTP和Turbo DNase
DEPC处理水	赛默飞世尔科技	750023
2x TBE-尿素上样缓冲液	赛默飞世尔科技	LC6876
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）	Bio-Rad	1610146
10x TBE 缓冲液	赛默飞世尔科技	15581044
Nalgene 快速流™ 滤波单元	赛默飞世尔科技	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	赛默飞世尔科技	17919
SYBR-Safe 染料	赛默飞世尔科技	S33102
6% TBE-尿素微型凝胶	赛默飞世尔科技	EC6865BOX
ChemiDoc	伯乐（Bio-Rad）
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
高通量筛选™ 增强型屏幕	GE Healthcare	RPN1669	钨酸钙荧光屏
磷光存储屏	分子动力学	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI（2M）	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	赛默飞世尔科技	AM9515
SuperScript IV 逆转录酶	赛默飞世尔科技	18090010	包含 5x RT 缓冲液、SuperScript IV
dNTP混合液（10 mM）	赛默飞世尔科技	R0192
ddNTP 集合（5 mM）	Sigma	GE27-2045-01
大号滤纸	Whatman	1001-917
凝胶干燥仪	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA血液小型试剂盒	Qiagen	51104	还含有 RNase A 和蛋白酶 K
SMN2 微型基因34	Addgene	72287
热灭活胎牛血清	赛默飞世尔科技	10438026
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122
Opti-MEM I	赛默飞世尔科技	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	赛默飞世尔科技	12605010
不含 Ca/Mg 的 DPBS	赛默飞世尔科技	14190250
TRIzol	赛默飞世尔科技	15596018
RNeasy mini 柱	Qiagen	74104	还含有 RW1 缓冲液、RPE 缓冲液
RNase-Free DNase 试剂盒	Qiagen	79254	含有 DNase I 和 RDD 缓冲液
去离子甲酰胺	赛默飞世尔科技	AM9342
MnCl2•4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
随机九聚体	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript 第一链合成系统	赛默飞世尔科技	11904-018	包含10x RT缓冲液、SuperScript II逆转录酶
AccuPrime pfx DNA聚合酶	赛默飞世尔科技	12344024
NextSeq500	Illumina
NucAway 柱	赛默飞世尔科技	AM10070	用于脱盐目的