Name: 利用体外和细胞内形状研究小分子诱导的预 mrna 结构变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学习使用SHAPE技术测定小分子存在下pre-mRNA的二级结构变化。本方法通过体外选择性2'-羟基酰化分析引物延伸实验，为研究RNA动态与相互作用提供可靠方案。

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本研究工作由美国国立卫生研究院R01基金（NS094721，K.A.J.）资助。&#160;&#160;

<ol><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li>
<li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+110%2C+E3256-E3264%22%5BJournal%5D)">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li>
<li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li>
<li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li>
<li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mn+2%2B+-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li>
<li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li>
<li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+%28TAR%29+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li>
<li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li>
<li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li>
<li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li>
<li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs%3A+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li>
<li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+small+molecule+druggable+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li>
<li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li>
<li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li>
<li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Risdiplam%2C+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+%28+SMN2+%29+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li>
<li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li>
<li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH%2C+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+%28S46.003%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li>
<li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li>
<li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li>
<li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+%2C+complex+structural+domains+%2C+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%E2%80%B2+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct+%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li>
<li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205(2014).</li>
<li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li>
<li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQi%2C+H+%22Preparation+of+pyridopyrimidine+derivatives+and+related+compounds+for+treating+spinal+muscular+atrophy%22">Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy</a>. , (2013).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li>
<li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959(2014).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li>
<li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li>
<li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li>
<li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+determination+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在体外 SHAPE 实验中，使用高质量且均一的 RNA 模板至关重要。然而，T7 转录通常会产生异质性序列36。特别是，在 3' 末端带有 ±1 个核苷酸且产量不可忽略的序列36，通常难以通过聚丙烯酰胺凝胶纯化去除。异质性 RNA 模板可能导致引物延伸产物在测序凝胶分析中出现多组信号，有时会使结果难以解读。在 RNA 模板表达盒的 5' 和 3' 两端引入核酶，可使两端序列均一化。
体外和细胞内 SHAPE 实验中，2'-OH 修饰试剂的孵育时间是另一个关键因素。Weeks 团队建议，孵育时间应至少为水解型 2'-OH 酰化试剂半衰期的五倍1在我们实验中，与NAI孵育T1/2 约20分钟 &#62;体外和细胞内 SHAPE 反应时间达到 30 分钟会导致过度反应的结果。如图所示 图1D，一个良好的 体外 SHAPE 分析应具...

通过引物延伸分析选择性2'-羟基酰化（SHAPE）是一种用于测量目标RNA序列中每个核苷酸动力学并解析其二级结构的方法，分辨率可达单个核苷酸水平1。目前已开发出在体外条件2,3,4（即在确定的缓冲体系中使用纯化的RNA）以及在活体哺乳动物细胞内5,6应用的SHAPE技术，用于研究中等长度RNA序列的二级结构（通常在细胞内SHAPE中为&#60;1,000个核苷酸，在体外SHAPE中为&#60;200个核苷酸）。该方法特别适用于评估受体RNA在结合RNA相互作用的小分子代谢物时发生的结构变化2,4,7,8，以及在药物开发过程中研究靶向RNA分子的作用机制9,10。
以RNA为靶点的药物发现最近在学术实验室和制药行业中引起了广泛关注11,12，相关研究采用了多种不同的方法和策略13,14,15,16。近期用于临床的靶向RNA的小分子药物实例包括两种结构不同的实验性药物LMI-07017和RG-791618,19，它们用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA），在II期临床试验中显示出良好的疗效20。研究表明，这两种分子均可作用于运动神经元存活基因（SMN）2的前体mRNA，并调控SMN2基因的剪接过程6,17,21。我们此前已证实，in vitro和细胞内SHAPE技术可用于检测在RG-7916类似物SMN-C2存在下靶标RNA结构的变化6。
原则上，SHAPE 方法以无偏倚的方式，在过量自猝灭酰化试剂存在条件下，测量 RNA 序列中每个核苷酸的 2'-OH 酰化速率。该酰化试剂在水中不稳定，半衰期较短（例如，1-甲基-7-硝基异喹啉酸酐（1M7）的半衰期 T1/2 = 17 秒；2-甲基烟酰胺咪唑酯（NAI）约为 20 分钟），且对碱基种类不敏感2223。这导致柔性碱基的 2'-OH 基团更易发生酰化，从而可转化为对每个核苷酸动态特性的精确评估。具体而言，处于碱基配对状态的核苷酸通常比未配对的核苷酸对 2'-OH 修饰试剂（如 NAI 和 1M7）的反应活性更低。
根据RNA模板的来源以及2'-OH酰化发生的位置，SHAPE通常可分为体外SHAPE（in vitro SHAPE）和细胞内SHAPE（in-cell SHAPE）。体外SHAPE使用纯化的T7转录RNA，其实验设计缺乏细胞环境背景。而在细胞内SHAPE中，RNA模板的转录和2'-OH酰化均在活细胞内进行，因此其结果能够重现RNA在细胞环境中的结构模型。在文献中，细胞内SHAPE也被称为体内SHAPE（in vivo SHAPE），用于指代在活细胞中进行的SHAPE实验24。由于该实验并非在动物体内进行，为准确起见，我们将该实验称为细胞内SHAPE（in-cell SHAPE）。
体外和细胞内SHAPE的引物延伸阶段策略也有所不同。在体外SHAPE中，逆转录在Mg2+存在的情况下会在2'-OH酰化位点终止。因此，使用32P标记的引物延伸产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中表现为一条条带，条带强度与酰化速率成正比1。在细胞内SHAPE中，逆转录在Mn2+存在的情况下会在2'-OH加合物位点产生随机突变。通过深度的下一代测序可捕获每个核苷酸的突变率，进而计算出单核苷酸分辨率的SHAPE反应活性。
细胞内SHAPE技术的一个潜在问题是信噪比较低（即大多数2'-OH基团未被修饰，而未修饰的序列在下一代测序中占据了大部分读段）。最近，Chang实验室开发了一种富集2'-OH修饰RNA的方法，称为体内点击SHAPE（icSHAPE）25。这种富集方法在研究弱效小分子与RNA相互作用时可能具有优势，尤其是在全转录组范围的检测中。

<table><tbody><tr><td>DNA寡核苷酸</td><td>IDT</td><td></td><td>gBlock 用于 &gt;200 bp DNA合成</td></tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II 高保真 PCR 预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶和 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Takara</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>MegaScript T7 转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM1333</td><td>包含10x反应缓冲液、T7酶、NTP和Turbo DNase</td></tr><tr><td>DEPC处理水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>2x TBE-尿素上样缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流&amp;trade; 滤波单元</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Safe 染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-尿素微型凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C005MC</td><td></td></tr><tr><td>高通量筛选&amp;trade; 增强型屏幕</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1669</td><td>钨酸钙荧光屏</td></tr><tr><td>磷光存储屏</td><td>分子动力学</td><td>BAS-IP MS 3543 E</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Typhoon</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAI（2M）</td><td>EMD Millipore</td><td>03-310</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆转录酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18090010</td><td>包含 5x RT 缓冲液、SuperScript IV</td></tr><tr><td>dNTP混合液（10 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>ddNTP 集合（5 mM）</td><td>Sigma</td><td>GE27-2045-01</td><td></td></tr><tr><td>大号滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td>凝胶干燥仪</td><td>Hoefer</td><td>GD 2000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA血液小型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>还含有 RNase A 和蛋白酶 K</td></tr><tr><td>SMN2 微型基因&lt;sup&gt;34&lt;/sup&gt;</td><td>Addgene</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>TrpLE</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca/Mg 的 DPBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini 柱</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>还含有 RW1 缓冲液、RPE 缓冲液</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>含有 DNase I 和 RDD 缓冲液</td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>随机九聚体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7647</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript 第一链合成系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11904-018</td><td>包含10x RT缓冲液、SuperScript II逆转录酶</td></tr><tr><td>AccuPrime pfx DNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12344024</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway 柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM10070</td><td>用于脱盐目的</td></tr></tbody></table>

利用体外和细胞内shape技术研究小分子诱导的pre-mrna结构变化

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

在靶向RNA的小分子药物研发过程中，阐明这些小分子与靶标RNA序列相互作用所引起的结构变化具有重要意义。本文提供了一种详细的体外（in vitro）和细胞内选择性2'-羟基酰化引物延伸分析（SHAPE）实验方案，用于研究实验性脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗药物SMN-C2存在下，SMN2基因前体mRNA外显子7的RNA结构变化。在体外SHAPE实验中，通过T7 RNA聚合酶转录一段包含SMN2外显子7的140个核苷酸长的RNA序列，在SMN-C2存在条件下进行折叠，随后使用温和的2'-OH酰化试剂2-甲基烟酰基咪唑（NAI）对其进行修饰。该2'-OH-NAI加合物进一步通过32P标记的引物延伸进行检测，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离分析。相反，细胞内SHAPE中的2'-OH酰化是在活细胞中原位进行的，针对的是结合了SMN-C2的细胞内RNA。随后通过PCR扩增SMN2基因外显子7的前体mRNA序列以及引物延伸过程中由SHAPE诱导产生的突变，并进行高通量测序分析。比较这两种方法，体外SHAPE成本较低，且无需借助计算工具即可直观呈现结果。然而，体外SHAPE获得的RNA结构模型有时会偏离细胞环境中的真实二级结构，可能是因为缺失了与RNA结合蛋白的所有相互作用。细胞内SHAPE无需使用放射性材料操作场所，能够更准确地反映细胞环境下的RNA二级结构。此外，通过采用高通量测序技术，细胞内SHAPE通常适用于更长的RNA序列范围（约1,000个核苷酸），而体外SHAPE通常依赖PAGE分析，适用长度较短（约200个核苷酸）。对于SMN2前体mRNA的外显子7而言，体外与细胞内SHAPE所获得的RNA结构模型彼此相似。

我们先前已证明，一种RNA剪接调节剂SMN-C2可与SMN2基因pre-mRNA外显子7上的AGGAAG基序相互作用，并利用SHAPE技术评估了在SMN-C2存在下RNA结构的变化6。SMN-C2的结合位点不同于美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于脊髓性肌萎缩症（SMA）治疗的反义寡核苷酸（ASO）nusinersen，后者结合并阻断位于内含子7的内含子剪接沉默子（ISS）27,28（图1A）。目前已知的大多数SMN2外显子7剪接调控元件均位于pre-mRNA中外显子7约100个核苷酸范围内29；因此，分别采用长度为140和276个核苷酸的RNA序列进行体外和细胞内SHAPE分析，以覆盖外显子7及其相邻的内含子区域（图1A）。
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本文介绍了在存在靶向RNA的小分子的情况下，通过引物延伸分析法（SHAPE）进行体外和细胞内选择性2'-羟基乙酰化的详细实验方案，以确定pre-mRNA目标序列的二级结构。

利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

在靶向RNA的小分子药物研发过程中，阐明这些小分子与目标RNA序列相互作用所引起的空间结构变化……

本视频将提供详细的体外SHAPE实验方案，用于确定在RNA靶向小分子存在下目标RNA序列的二级结构。体外SHAPE是一种经济有效的方法，可用于了解氨基酸尺度RNA元件中每个核苷酸的动态特性，这类RNA元件通常少于200个核苷酸。在按照文稿所述方法制备RNA模板后，通过添加γ-32P标记的ATP和逆转录引物，对逆转录引物进行放射性标记。在1.7毫升微量离心管中加入10XPNK反应缓冲液、多核苷酸激酶和RNA的游离水，总体积为20微升。然后在37摄氏度孵育1小时。接着将样品在65摄氏度活化20分钟，随后将样品通过脱盐柱过滤，并在1000 × g离心。加入25微升2×TBE尿素上样缓冲液并混匀。将这些标记产物加入10%丙烯酰胺凝胶中，并确保避免放射性物质渗入上层缓冲槽。以20瓦功率电泳运行一小时。电泳结束后，取下凝胶夹板的玻璃板。将凝胶放在一块塑料膜上。将塑料膜折叠覆盖在凝胶顶部，形成一个密闭的夹心结构。将凝胶夹心置于一块钙-钨酸盐荧光屏上，并使用成像仪进行曝光。再次使用普通光线拍摄凝胶图像，以确定凝胶的边缘位置。使用图像处理软件将两张图像叠加，即亮图像与暗图像叠加，然后将顶层图像设置为略微透明，以便同时观察两张图像。确保打印的图像与实际凝胶大小相同。然后将凝胶与打印的图像对齐。最后，使用灭菌的剃须刀片从凝胶中切下所需的目标条带，并将每块凝胶放入单独的1.7毫升微量离心管中。为了通过被动洗脱法从凝胶切片中回收DNA，向每个1.7毫升离心管中加入0.3毫升洗脱沉淀混合液。将离心管置于放射性安全容器中，在4°C下于旋转仪上孵育16小时。孵育结束后，将液体转移至新的1.7毫升离心管中。加入2.5倍体积的预冷至-20°C的无水乙醇，倒置离心管6次以混匀液体。将离心管置于-80°C条件下孵育至少1小时。在4°C、10,000g条件下离心10分钟后，用移液器小心吸除上清液。加入1毫升80%乙醇以洗涤沉淀物。涡旋振荡15秒，然后在相同条件下再次离心。用移液器吸除上清液后，将DNA沉淀在空气中干燥5分钟。加入 50 微升无 RNA 酶的水，通过上下吹打 10 次混匀。使用闪烁计数器将 DNA 浓度标准化至约每微升 100,000 计数。为准备四个样品进行化学修饰，将 8 皮摩尔 RNA 溶于 32 微升 0.5 × TE 缓冲液中，加入 1.7 毫升微量离心管。 在80摄氏度下加热两分钟，然后迅速置于冰上冷却至少一分钟。随后加入8微升5倍折叠缓冲液，混匀后将9微升该RNA混合物分别加入四个标记为1至4的PCR管中。向标号为1的管中加入1微升10% DMSO，向2号管中加入1微升浓缩小分子溶液，向3号管中加入1微升稀释的小分子溶液，向4号管中加入1微升水。将所有PCR管置于PCR仪中，在37摄氏度下孵育30分钟。在进行二引物OH修饰反应前，立即将1微升2摩尔的NAI储存液加入3微升经DEPC处理的水中，配制成0.5摩尔的工作液。随后立即取1微升该溶液分别加入第1、2、3号管中。向4号管中加入1微升25% DMSO，在37摄氏度的热循环仪中孵育15分钟。准备四个新的1.7毫升微量离心管，每管加入100微升洗脱沉淀混合液和2微升糖原。然后将相应PCR管中的全部液体转移至上述各管中。向每个试管中加入 0.34 毫升预冷的 200 proof 乙醇，涡旋混匀 5 秒。将试管置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻至少 1 小时。然后在 4 °C 条件下以 14,000 ×g 离心 15 分钟。不要扰动RNA沉淀，从每根离心管中移除上清液。每管加入0.5毫升80%乙醇以洗涤RNA沉淀，并涡旋振荡15秒。再次在相同条件下离心后，去除上清液，并将RNA沉淀在空气中干燥5分钟。加入9微升无RNA酶的水，上下吹打10次以混匀。将修饰后的RNA转移至四个新的PCR管中，并像上一步一样将其标记为1至4号。在另外四个PCR管中，每管加入7微升DEPC处理水中含2皮摩尔的RNA，并将其标记为5至8号。向标记为1至8的八个PCR管中，每管加入2微升回收的放射性标记引物。在65摄氏度加热5分钟后，立即在PCR仪中冷却至4摄氏度。向每个管中加入4微升5x RT缓冲液、1微升0.1摩尔DTT和1微升dNTP混合物。然后向第1至第4号管中各加入2 µL经DEPC处理的水。向第5号管中加入4 µL 5 mM的ddATP，向第6号管中加入4 µL 5 mM的ddTTP，向第7号管中加入4 µL 5 mM的ddCTP，向第8号管中加入1 µL 5 mM的ddGTP和3 µL经DEPC处理的水，并用移液器吹打4次以混匀。将所有PCR管在PCR仪中于52°C加热1分钟，随后向每管中加入1 µL逆转录酶，并上下吹打4次以混匀。将反应物在52 °C下于热循环仪中孵育20分钟。为水解RNA，向每个管中加入1 µL 5 M氢氧化钠，于95 °C加热5分钟。随后加入5 µL 1 M盐酸以中和反应，并按前述方法重复乙醇沉淀步骤。将DNA沉淀在空气中干燥5分钟后，向1.7毫升离心管中加入10微升水和10微升2xTBE尿素上样缓冲液，轻轻吹打10次以重新溶解。将样品在70摄氏度加热5分钟，然后置于冰上冷却，再上样至凝胶。取10微升已置于冰上的样品，加样至8%聚丙烯酰胺测序凝胶中。以65瓦功率电泳运行两小时，或直至底部染料迁移至凝胶的四分之三处。移除间隔条，轻轻插入刮刀以分离顶部硅化玻璃板。将凝胶覆盖一张较大的滤纸，轻轻按压，使凝胶黏附于滤纸上。从底部开始，提起滤纸，将凝胶连同滤纸一起从玻璃板上取下。将凝胶转移至之前使用过的包装纸上后，用真空干燥器在70摄氏度下干燥一小时，并确保在凝胶与干燥器之间放置多层滤纸。将凝胶夹心结构转移至经光照漂白的磷屏存储屏匣中，使凝胶的放射性暴露于屏上4至16小时。最后，将磷光存储屏放置在成像设备上，以中等分辨率扫描约30分钟。在将聚丙烯酰胺测序凝胶暴露于磷光存储屏后，成功的构象实验显示凝胶顶部出现单一且最明显的弯曲条带，并在整个凝胶中以单核苷酸分辨率显示出清晰的弯曲条带，无拖尾现象。该凝胶还表明，在小分子存在下，某些弯曲条带的强度发生变化，提示碱基配对强度发生了改变。在凝胶分析中一个常见问题是，由于上样样品中盐、DMSO 或其他不需要的物质浓度过高，凝胶中部可能出现被称为盐前沿的弥散区域。可通过乙醇沉淀法去除这些不需要的物质来避免该问题。进行体外 SHAPE 分析时，建议使用均一的 RNA 模板。我们在五端和三端均使用核糖体来获得此类 RNA。还可以进行细胞内 SHAPE 实验，以获取细胞环境中的 RNA 二级结构。需要注意的是，体外 SHAPE 实验可能无法重现体内 RNA 结合蛋白的相互作用。体外形态分析是一种通过定量逆转录酶终止位点的图谱强度变化，来检测小分子存在时RNA结构改变的有力方法。请注意，本视频中描述的所有实验均须在经授权的放射性工作场所内进行，并配备适当的个人防护装备和有机玻璃屏蔽装置。

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Genetics

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分子间RNA碱基配对的可视化与定量分析 体外 利用分裂型 Broccoli RNA 报告系统检测 RNA 簇

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