利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

本视频将提供详细的体外SHAPE实验方案，用于确定在RNA靶向小分子存在下目标RNA序列的二级结构。体外SHAPE是一种经济有效的方法，可用于了解氨基酸尺度RNA元件中每个核苷酸的动态特性，这类RNA元件通常少于200个核苷酸。在按照文稿所述方法制备RNA模板后，通过添加γ-32P标记的ATP和逆转录引物，对逆转录引物进行放射性标记。

在1.7毫升微量离心管中加入10XPNK反应缓冲液、多核苷酸激酶和RNA的游离水，总体积为20微升。然后在37摄氏度孵育1小时。接着将样品在65摄氏度活化20分钟，随后将样品通过脱盐柱过滤，并在1000 × g离心。加入25微升2×TBE尿素上样缓冲液并混匀。

将这些标记产物加入10%丙烯酰胺凝胶中，并确保避免放射性物质渗入上层缓冲槽。以20瓦功率电泳运行一小时。电泳结束后，取下凝胶夹板的玻璃板。

将凝胶放在一块塑料膜上。将塑料膜折叠覆盖在凝胶顶部，形成一个密闭的夹心结构。将凝胶夹心置于一块钙-钨酸盐荧光屏上，并使用成像仪进行曝光。

再次使用普通光线拍摄凝胶图像，以确定凝胶的边缘位置。使用图像处理软件将两张图像叠加，即亮图像与暗图像叠加，然后将顶层图像设置为略微透明，以便同时观察两张图像。

确保打印的图像与实际凝胶大小相同。然后将凝胶与打印的图像对齐。最后，使用灭菌的剃须刀片从凝胶中切下所需的目标条带，并将每块凝胶放入单独的1.7毫升微量离心管中。

为了通过被动洗脱法从凝胶切片中回收DNA，向每个1.7毫升离心管中加入0.3毫升洗脱沉淀混合液。将离心管置于放射性安全容器中，在4°C下于旋转仪上孵育16小时。孵育结束后，将液体转移至新的1.7毫升离心管中。

加入2.5倍体积的预冷至-20°C的无水乙醇，倒置离心管6次以混匀液体。将离心管置于-80°C条件下孵育至少1小时。在4°C、10,000g条件下离心10分钟后，用移液器小心吸除上清液。

加入1毫升80%乙醇以洗涤沉淀物。涡旋振荡15秒，然后在相同条件下再次离心。用移液器吸除上清液后，将DNA沉淀在空气中干燥5分钟。

加入 50 微升无 RNA 酶的水，通过上下吹打 10 次混匀。使用闪烁计数器将 DNA 浓度标准化至约每微升 100,000 计数。为准备四个样品进行化学修饰，将 8 皮摩尔 RNA 溶于 32 微升 0.5 × TE 缓冲液中，加入 1.7 毫升微量离心管。

在80摄氏度下加热两分钟，然后迅速置于冰上冷却至少一分钟。随后加入8微升5倍折叠缓冲液，混匀后将9微升该RNA混合物分别加入四个标记为1至4的PCR管中。向标号为1的管中加入1微升10% DMSO，向2号管中加入1微升浓缩小分子溶液，向3号管中加入1微升稀释的小分子溶液，向4号管中加入1微升水。

将所有PCR管置于PCR仪中，在37摄氏度下孵育30分钟。在进行二引物OH修饰反应前，立即将1微升2摩尔的NAI储存液加入3微升经DEPC处理的水中，配制成0.5摩尔的工作液。随后立即取1微升该溶液分别加入第1、2、3号管中。

向4号管中加入1微升25% DMSO，在37摄氏度的热循环仪中孵育15分钟。准备四个新的1.7毫升微量离心管，每管加入100微升洗脱沉淀混合液和2微升糖原。然后将相应PCR管中的全部液体转移至上述各管中。

向每个试管中加入 0.34 毫升预冷的 200 proof 乙醇，涡旋混匀 5 秒。将试管置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻至少 1 小时。然后在 4 °C 条件下以 14,000 ×g 离心 15 分钟。

不要扰动RNA沉淀，从每根离心管中移除上清液。每管加入0.5毫升80%乙醇以洗涤RNA沉淀，并涡旋振荡15秒。再次在相同条件下离心后，去除上清液，并将RNA沉淀在空气中干燥5分钟。

加入9微升无RNA酶的水，上下吹打10次以混匀。将修饰后的RNA转移至四个新的PCR管中，并像上一步一样将其标记为1至4号。在另外四个PCR管中，每管加入7微升DEPC处理水中含2皮摩尔的RNA，并将其标记为5至8号。

向标记为1至8的八个PCR管中，每管加入2微升回收的放射性标记引物。在65摄氏度加热5分钟后，立即在PCR仪中冷却至4摄氏度。向每个管中加入4微升5x RT缓冲液、1微升0.1摩尔DTT和1微升dNTP混合物。

然后向第1至第4号管中各加入2 µL经DEPC处理的水。向第5号管中加入4 µL 5 mM的ddATP，向第6号管中加入4 µL 5 mM的ddTTP，向第7号管中加入4 µL 5 mM的ddCTP，向第8号管中加入1 µL 5 mM的ddGTP和3 µL经DEPC处理的水，并用移液器吹打4次以混匀。将所有PCR管在PCR仪中于52°C加热1分钟，随后向每管中加入1 µL逆转录酶，并上下吹打4次以混匀。

将反应物在52 °C下于热循环仪中孵育20分钟。为水解RNA，向每个管中加入1 µL 5 M氢氧化钠，于95 °C加热5分钟。随后加入5 µL 1 M盐酸以中和反应，并按前述方法重复乙醇沉淀步骤。

将DNA沉淀在空气中干燥5分钟后，向1.7毫升离心管中加入10微升水和10微升2xTBE尿素上样缓冲液，轻轻吹打10次以重新溶解。将样品在70摄氏度加热5分钟，然后置于冰上冷却，再上样至凝胶。取10微升已置于冰上的样品，加样至8%聚丙烯酰胺测序凝胶中。

以65瓦功率电泳运行两小时，或直至底部染料迁移至凝胶的四分之三处。移除间隔条，轻轻插入刮刀以分离顶部硅化玻璃板。将凝胶覆盖一张较大的滤纸，轻轻按压，使凝胶黏附于滤纸上。

从底部开始，提起滤纸，将凝胶连同滤纸一起从玻璃板上取下。将凝胶转移至之前使用过的包装纸上后，用真空干燥器在70摄氏度下干燥一小时，并确保在凝胶与干燥器之间放置多层滤纸。将凝胶夹心结构转移至经光照漂白的磷屏存储屏匣中，使凝胶的放射性暴露于屏上4至16小时。

最后，将磷光存储屏放置在成像设备上，以中等分辨率扫描约30分钟。在将聚丙烯酰胺测序凝胶暴露于磷光存储屏后，成功的构象实验显示凝胶顶部出现单一且最明显的弯曲条带，并在整个凝胶中以单核苷酸分辨率显示出清晰的弯曲条带，无拖尾现象。该凝胶还表明，在小分子存在下，某些弯曲条带的强度发生变化，提示碱基配对强度发生了改变。

在凝胶分析中一个常见问题是，由于上样样品中盐、DMSO 或其他不需要的物质浓度过高，凝胶中部可能出现被称为盐前沿的弥散区域。可通过乙醇沉淀法去除这些不需要的物质来避免该问题。进行体外 SHAPE 分析时，建议使用均一的 RNA 模板。

我们在五端和三端均使用核糖体来获得此类 RNA。还可以进行细胞内 SHAPE 实验，以获取细胞环境中的 RNA 二级结构。需要注意的是，体外 SHAPE 实验可能无法重现体内 RNA 结合蛋白的相互作用。

体外形态分析是一种通过定量逆转录酶终止位点的图谱强度变化，来检测小分子存在时RNA结构改变的有力方法。请注意，本视频中描述的所有实验均须在经授权的放射性工作场所内进行，并配备适当的个人防护装备和有机玻璃屏蔽装置。