Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 探索乳腺癌的生物标志物和生存预测指标的基础上, 综合分析汇集的临床数据集, 从各种可公开访问的数据库, 使用表达策略, 相关和一步一步地进行生存分析。
Abstract
近年来, 新兴数据库旨在降低处理复杂的癌症基因组数据集的障碍, 从而促进研究人员分析和解释不同类型癌症的基因、样本和临床数据。在此, 我们描述了一个实用的手术过程, 以 ID1 (DNA 结合蛋白的抑制剂 1) 为例, 以描述乳腺癌的生物标志物和生存预测剂的表达模式的基础上, 集合的临床数据集, 从在线访问数据库, 包括 ONCOMMINE、bcGenExMiner v4.0 (乳腺癌基因表达矿工 v4.0)、GOBO (乳腺癌在线基因表达结果)、HPA (人类蛋白质图集) 和 Kaplan-Meier 绘图仪。分析从查询癌症样品与正常样本的感兴趣基因 (例如 ID1) 的表达模式开始。然后, 对 ID1 与乳腺癌临床病理特征进行了相关分析。其次, 根据不同的亚群对 ID1 的表达谱进行分层。最后, 分析了 ID1 表达与生存结果的关系。该操作过程简化了从不同数据库整合基因级多维数据类型的概念, 并测试了有关乳腺癌基因改变事件的复发和基因组背景的假设。该方法可以提高结论的可信度和代表性, 从而为感兴趣的基因提供信息视角。
Introduction
乳腺癌是一种异质性疾病, 在不同的分子亚型中具有不同的预后和治疗策略, 其发病机制和发展可能与不同的分子机制1,2有关,3. 然而, 确定治疗目标通常需要数年甚至数十年的时间, 从基础研究的初步发现到临床使用4。高通量测序技术在癌症基因组中的广泛应用, 极大地推动了寻找有价值的生物标志物或治疗靶点的过程 5。
从大型癌症基因组学平台 (如 ICGC (国际癌症基因组联盟) 和 TCGA (癌症基因组图集)) 产生的大量癌症基因组学数据, 给研究人员执行数据带来了巨大挑战探索、集成和分析, 特别是对于缺乏信息学和计算方面的强化培训的用户, 6、7、8、9、10。近年来, 新兴数据库 (如 ONCOMINE、bcGenExMiner v4.0 和 Kaplan-Meier 绘图仪等) 的设计和开发旨在降低处理复杂的癌症基因组数据集的门槛, 从而方便调查人员分析和分析和开发。解释不同类型癌症的基因、样本和临床数据11。该协议的目的是描述一种研究策略, 该策略与一系列开放访问数据库中的多层次基因信息相结合, 这些数据库已得到大量研究人员的广泛认可, 以确定潜在的生物标志物和乳腺癌的预后因素。
ONCOM内数据库是一个基于网络的数据挖掘平台, 包含癌症微阵列信息, 旨在促进发现新的生物标志物和治疗目标11。目前, 该数据库中有超过4800万的基因表达测量数据, 来自65个基因表达数据集11,12个。BcGenExMiner v4.0 (非营利机构的免费工具), 也称为乳腺癌基因表达矿工, 是一个用户友好的基于 web 的应用程序, 由 3 414名康复乳腺癌患者和 1 209 例患者的 DNA 微阵列结果组成。贬损事件13。它旨在提高基因预后分析性能的 r 统计软件和包。
GOB 是一个多功能的用户友好在线工具, 提供微阵列信息 (例如 Affymetrix U133A), 这些信息来自51样本的乳腺癌细胞系和1881个样本的乳腺肿瘤数据集, 可提供广泛的分析14。GOB 数据库中有多种应用, 包括快速分析乳房肿瘤和细胞系不同分子亚型的基因表达谱, 筛选共同表达的基因以创造潜在的偏子, 以及乳腺癌数据集15中单个基因、基因集合或基因特征的结果和基因表达水平之间的相关分析.
人类蛋白质地图集是一个开放的方案, 为科学家设计, 以探索人类蛋白质组, 它已经为人类生物学和疾病领域的大量出版物做出了贡献。人类蛋白质地图集被认为是生命科学社区16,17的欧洲核心资源。
Kaplan Meier 绘图仪是一个在线工具, 同时整合基因表达和临床数据, 可以根据 10, 461个癌症样本评估 54, 675 基因的预后效应, 其中包括 1, 65个胃、2, 437 例肺、1 816 例卵巢和 5, 143 例乳腺癌患者平均随访 33/49/69-69个月 18.基因表达、无复发生存 (rfs) 和整体生存 (os) 的信息可从该数据库下载19,20。
在这里, 我们描述了一个实际的操作过程, 使用多个可公开访问的数据库来比较、分析和可视化在多个癌症研究中感兴趣的基因表达的变化模式, 目的是总结乳腺癌的表达谱、预后值和潜在生物学功能。例如, 最近的研究表明 ID 蛋白在肿瘤中的致癌特性, 并与恶性特征有关, 包括细胞转化、永生化、增殖增强和转移21, 22,23。然而, ID 家族的每个成员在不同类型的实体肿瘤中发挥着不同的作用, 他们在乳腺癌中的作用仍不清楚 24.在以前的研究中, 通过这种方法探索, 我们发现 ID1 是一个有意义的预后指标乳腺癌25。因此, 该协议将以 ID1 为例, 介绍数据挖掘方法。
分析从查询肿瘤样本中感兴趣的基因与普通样品在 ONCOLIN 中的表达模式开始。然后, 利用 bc-GenExMiner v4.0、GOBO 和 OC纳米进行乳腺癌相关基因表达。其次, 利用上述三个数据库, 根据不同的子群对 ID1 的表达谱进行分层。最后, 利用 bc-GenExMiner v4.0、人体蛋白质图集和卡普兰绘图仪分析了 ID1 表达与生存的关系。操作过程如图 1中的流程图所示。
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Protocol
1. 表达式分析
- 转到 ONCOM内 WEB 界面26。
- 通过在搜索框中键入id1 , 获得不同类型恶性肿瘤中 id1 基因的相对表达水平。
- 从 "主筛选器" 菜单中选择"分析类型"。然后, 选择癌症与正常分析,乳腺癌与正常分析。
- 从"其他视图"菜单中选择"基因摘要视图" 。将p值的阈值设置为0.01。下载数字。
注: 折叠变化的阈值为 2, 如上一研究27所述。
2. 表达式相关分析
- 转到 Bc-genexiner v4.0 web 界面28。
- 从 "分析" 菜单中选择"相关性", 按"退出" 按钮。在搜索框中键入Id1 。按"提交"按钮和"开始分析"按钮。
注: 默认设置显示所有患者的表达式相关分析, 通过按分子亚型过滤器, 可以更准确地治疗乳腺癌的不同亚型。
3. 分组分析
- Bc-GenExMiner v4.0 中的子群分析
- 转到 Bc-genexiner v4.0 web 界面28。
- 从"分析" 菜单中选择"表达",按"退出"按钮。在搜索框中键入Id1 , 然后按"提交"按钮和"开始分析"按钮。
- 单击"节点状态 " (Ln)和"稀缺绽放" & 理查德森等级状态 (sbr)缩略图可查看完整图像。在 SBR 图像中, 按下面的按钮以可视化图形的p值。下载数字。
- 乳腺癌在线 (GOB) 基因表达结果的亚群分析
- 转到 GOBO web 界面14。
- 类型基因符号感兴趣Id1到屏幕上上传基因集。
- 将定义基因探针标识符的搜索范围设置为基因符号。在肿瘤选择中设置所有。在多元参数中选择节点状态和等级分层。其他项目仍然是默认值。提交查询并下载数字。
4. 生存分析
- Bc-GenExMiner v4.0 的生存分析
- 转到 Bc-genexiner v4.0 web 界面28。
- 从"分析" 菜单中选择"支持",按"退出" 按钮。在搜索框中键入Id1 , 然后按"提交"按钮和"开始分析"按钮。
- 在排气预测分析中, 选择 "人口和事件标准" 中的Nm、ERM、mr , 然后按"提交"按钮以获取更多信息。按卡普兰-梅耶尔曲线缩略图导出完整的图形。
注: N (+,-, m): 节点状态 (+: 正,-: 负数, m: 混合);ER (+,-, m): 雌激素受体状态 (+: 阳性,-: 阴性, m: 混合);MR: 转移性复发
- 人类蛋白质地图集 (HPA) 中的生存分析
- 转到人类蛋白质地图集网络界面 29。
- 在搜索框中键入Id1 , 然后单击 "搜索" 按钮。选择病理子地图集。
注: 在 RNA 表达概述部分显示了17种癌症类型的 mRNA 表达水平。盒子图的每个癌症组织标签都可以点击, 以获得一个详细的页面, 提供生存分析数据和 RNA 表达水平。 - 点击乳腺癌的标签, 然后详细的页面显示交互式生存散点图和生存分析。下载数字。
- 卡普兰-梅埃绘图仪生存中的生存分析
- 转到卡普兰-meier Plotter 网页界面 30。单击 "启动 mRNA 绘图仪", 用于 mRNA 基因芯片区中的乳腺癌。
- 在搜索栏中键入Id1 , 然后在候选菜单中选择绿色项目。
- 选择Rfs作为生存类型, "其他项目" 保持为默认值。单击 "绘制卡普兰-梅耶尔" 绘图并下载图形。
注: 生存类型、截止类型和后续阈值的设置以及探测集选项可以根据需要进行更改。通过将 "限制分析"中的设置更改为 "限制" 框 1, 可以获得包括 er、pr、her-2、淋巴结、分级、tp53 状态和分子亚型在内的亚群预后分析。同样, 治疗的过滤限制也可以在"限制对选定队列的框" 中进行设置。
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Representative Results
利用 ID1 对乳腺癌生物标志物进行了有代表性的数据挖掘和综合分析, id1 是 dna 结合家族成员的抑制剂之一, 在此前的研究 25中已经报告了这一结果。
如图 2所示, 利用 oncomin 数据库分析了多种类型癌症中肿瘤和正常组织之间 Id1 mrna 表达的差异, 该数据库共包含445独特的分析。有5项研究表明, 在正常组织中, ID1 的 mRNA 表达水平明显高于乳腺癌组织。这些数据表明 ID1 在乳腺癌中的表达失调。图 3显示了 id1 在 bc-genexminer V4.0 中进行的分析中最好的正相关基因和负相关基因。为了确定 ID1 mRNA 表达与 BC 患者临床病理参数之间的相关性, 采用 bc-GenExMiner v4.0 数据库进行了分析。如图 4所示, 与淋巴结转移的乳腺癌患者相比, 没有淋巴结转移的乳腺癌患者的 Id1 mrna 水平显著升高 (p= 0.0005)。此外, 在 GOB 中的分析表明, ID1 mRNA 水平的增加与肿瘤等级降低有关 (图 5, p& lt;0.00001)。这些结果表明, ID1 表达的增加与 bc 转移电位降低和病理分级降低有关。Bc-genexiner v4.0 数据库的分析表明, 较高的 Id1 mRNA 水平与乳腺癌患者较远的无转移生存率 (Dmfs) 有关 (图 6, Hrcuce0.82, 95% Ci:0.73-0.92, p= 0.001)。来自人类蛋白质地图集的分析表明, ID1 蛋白水平升高与乳腺癌患者更好的生存结果有关 (图 7, p= 0.0389)。Kaplan-Meier 绘图仪的生存分析还显示, 较高的 Id1 表达 MRNA 水平预测乳腺癌患者可获得更好的无复发生存率 (RFS) (图 8, hrc应从 0.81, p= 0.00023)。
图1。探索不同乳腺癌生物标志物和在线数据库选择的表达模式和预后价值综述。在各种数据库中逐步对不同的乳腺癌生物标志物进行了系统分析。首先, 在癌变样本中感兴趣的基因与正常样本的表达模式。然后, 对乳腺癌感兴趣的基因进行表达相关性研究。其次, 根据不同的不同, 对 ID1 的表达谱进行了分层。最后, 分析了 ID1 表达与生存结果的关系。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。ID1 在不同类型人类癌症中的 mRNA 表达模式。用 ONCOMMINE 数据库分析了 ID1 的 mRNA 表达。该图显示了具有统计学意义的 mRNA 过度表达 (红色) 或目标基因下调表达 (蓝色) 的数据集的数量。每个单元中的数量表示在这些分析和癌症类型中达到阈值的分析数量。在每项研究中测量的所有基因的顶部, 通过目标基因的百分位数对基因排名进行了分析。细胞颜色是由细胞内分析的最佳基因等级百分位决定的。P 值设置为 0.01, 折叠更改定义为 2, 如红色帧所示。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。Bc-genexemer v4.0 中 ID1 的基因相关性分析.在 bcGenExMiner v4.0 中分析了36例乳腺癌患者 ID1 和相关基因的 mRNA 表达相关性。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图4。ID1 表达与淋巴结转移状态的关系.在 bcGenExMiner v4.0 中分析了 4, 307 例不同淋巴结 (LN) 状态的乳腺癌患者 ID1 的 mRNA 表达水平。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图5。ID1 基因表达水平与肿瘤分级的关系。在 GOB 中分析了不同病理分级乳腺癌患者 ID1 的 mRNA 表达水平。评估组之间的全球显著差异以产生p值, p& lt;0.05 被认为表明存在统计上的显著差异。1, 2, 3 在 x 轴立场的分组患者在不同病理等级 1, 2级, 3级。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图6。ID1 对乳腺癌患者远缘无转移生存的预后价值.在 bcGenExMiner v4.0 中分析了 ID1 mRNA 水平与远离无转移生存率估计之间的关系。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图7。乳腺癌患者 ID1 的生存概率. 在人类蛋白质图集 (HPA) 中分析了 ID1 蛋白水平对乳腺癌患者生存的影响。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图8。根据无复发生存率 (RFS) 对乳腺癌 ID1 的预后价值。在所有 3, 951 例乳腺癌患者中, 不同的 ID1 mRNA 水平进行了分析。这一数字已与以前的研究25作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
对公共数据库的综合分析可以揭示感兴趣基因的潜在功能, 并揭示该基因与特定癌症的临床病理参数之间的潜在联系 27,31。基于单一数据库的探索和分析可能会提供有限或孤立的视角, 原因是潜在的选择偏差, 或在一定程度上, 可能是由于数据质量的多样性, 包括数据收集和分析算法数据库19。该议定书最重要的步骤是选择适当的数据库, 这些数据库应得到更多具有充分代表性的科学家的广泛承认。调查员应使用多个数据库来检验这一假设, 并证实从不同数据库得出的结果, 而不是使用单一的数据库。
这里描述的协议是一个调查员友好的操作程序。这种方法的优点是, 它可以快速可视化和解释基因在乳腺癌中的潜在作用。此外, 通过这一程序获得的所有结果都可以通过简单地查询相应的网站立即进行测试和重复。这种方法的局限性在于, 从数据库的综合分析中得出的结论可能不能准确反映临床环境中的实际功能或关系。这可能源于数据库的系统偏差, 在某些情况下, 也可能是由于样本容量 32、33不足。利用多个数据库对同一研究问题进行查询, 可以相互确认结果, 提高结论的可信度。强烈建议使用调查人员机构的样本来核实结果, 或在可行的情况下进行相关的基本实验, 以测试结果。
越来越多的在线癌症基因组学或蛋白质组学数据库将提供给35、36 的研究人员。该协议可以通过深入分析在线数据库, 利用基因组学、转录组学和表观基因组学, 为研究人员确定潜在的目标基因和相关的信号通路提供一种有效而经济的方法方法。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
这项工作得到了中国广东省自然科学基金 (编号: 2018A030313562)、广东临床教学基地教学改革项目 (NO。 2016JDB092), 国家自然科学基金 (81600358), 广东省高校青年创新人才项目 (编号: 2017KQNCX073)
Materials
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