Summary
Amas de protéines récepteurs germinant dans « germinosomes » dans la membrane interne de spores de Bacillus subtilis . Les auteurs décrivent un protocole utilisant des protéines de super-résolution microscopie et fluorescentes de journaliste pour visualiser germinosomes. Le protocole précise également domaines de membrane interne de spores qui sont préférentiellement souillées avec le colorant de membrane FM4-64.
Abstract
La petite taille des spores et la relativement faible abondance des protéines de la germination, causer des difficultés dans leurs analyses microscopiques à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Super-résolution microscopie de Illumination structurée en trois dimensions (3D-SIM) est un outil prometteur pour surmonter cet obstacle et de révéler les détails moléculaires du processus de la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis). Nous décrivons ici l’utilisation d’un SIMcheck modifié (ImageJ)-processus d’imagerie 3D assistant et protéines fluorescentes journaliste pour la microscopie SIM de germinosomes des spores de b. subtilis , grappes des protéines de la germination. Nous présentons également une procédure d’imagerie 3D (standard)-SIM pour FM4-64 la souillure des membranes de spores de b. subtilis . Grâce à ces procédures, nous avons obtenu une résolution inégalable pour la localisation de germinosome et montrent que > 80 % des KGB80 de b. subtilis spores dormantes obtenues après la sporulation sur milieu minimal défini de MOPS ont un ou deux GerD-GFP et GerKB-mCherry foyers. Foyers lumineux ont été également observés dans FM4-64 colorées des images 3D-SIM des spores suggérant qu’il existe des domaines de lipides de membrane interne de fluidité différente susceptible. D’autres études qui utilisent double étiquetage des procédures avec des colorants de la membrane et germinosome protéines de journaliste pour évaluer la co-localisation et ainsi obtenir un aperçu optimal de l’organisation des protéines de la germination de bacille dans la membrane interne de spores sont possible.
Introduction
Les spores de l’ordre des Bacillales et Clostridiales sont métaboliquement inactives et extraordinairement résistant à des régimes sévères de décontamination, mais à moins qu’elles germent, ne causent pas des effets délétères dans les humains1. En éléments nutritifs germinant déclenchée la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis), l’événement d’initiation est germinant liant aux récepteurs germinant (GRs) situé dans la membrane interne de la spore (IM). Par la suite, les GRs transmettre des signaux à la protéine de canal de SpoVA que se trouve également dans le IM. Cela se traduit par l’apparition de l’échange de spore noyau pyridine-2, 6-dicarboxylique (acide dipicolinique ; DPA ; composée de 20 % du poids sec de la spore core) pour l’eau via le canal de SpoVA. Par la suite, la libération DPA déclenche l’activation de l’hydrolyse du peptidoglycane cortex et l’absorption d’eau supplémentaire suit2,3,4. Ces événements conduisent à un stress mécanique sur les couches du manteau, sa rupture ultérieure, l’apparition de l’excroissance et, enfin, la croissance végétative. Toutefois, les détails moléculaires exacts de la germination sont encore loin d’être résolues.
Une question majeure pour la germination des spores concerne les propriétés biophysiques des lipides qui entourent les protéines de germination IM ainsi que les protéines de canal IM SpoVA. Cette couche lipidique en grande partie immobile IM est la barrière de perméabilité principal pour beaucoup de petites molécules, y compris des conservateurs chimiques toxiques, dont certains exercent leur action dans la base de spores ou de la cellule végétative cytoplasme5,6. La bicouche lipidique IM est probablement dans un état de gel, mais il y a une fraction importante des lipides mobiles dans l’IM5. IM de la spore a également le potentiel d’expansion considérable5. Ainsi, la superficie de la messagerie instantanée augmente de 1,6 fois à la germination sans synthèse membranaire supplémentaires et s’accompagne de la perte de cette membrane caractéristique faible perméabilité et lipides immobilité5,6.
Alors que les détails moléculaires de l’activation des protéines de la germination et organisation des lipides IM dans les spores sont des sujets attrayants pour l’étude, la petite taille des spores de b. subtilis et la relativement faible abondance des protéines de la germination, posent un défi analyses microscopiques. Griffiths et al une épifluorescence microscope preuve concluante, à l’aide de reporters fluorescents fusionnés aux protéines de la germination, donne à penser que dans les spores de b. subtilis , la protéine d’échafaudage GerD organise trois sous-unités GR (A, B et C) de GerA, B et K GRs, dans un cluster7. Ils a inventé le terme « germinosome » pour ce cluster des protéines de la germination et les structures qualifiées de ~ 300 nm grand IM protéine foyers8. Au début de la germination des spores, fluorescent germinosome foyers en fin de compte transforment en plus disperser modèles fluorescents, avec > 75 % des populations de spores affichant ce modèle dans les spores germent pendant 1 h avec la L-valine,8. Notez que le document mentionné ci-dessus utilisés en moyenne des images depuis des dizaines d’images fluorescentes consécutives, pour gagner la puissance statistique et surmonter l’obstacle des faibles signaux fluorescents observées en imagerie. Cette visualisation de ces structures dans les spores bactériennes était au bord de ce qui est techniquement faisable avec les outils classiques de microscopiques et ni une évaluation du montant des foyers dans une seule spore ni leur localisation subcellulaire plus détaillée possible avec cette approche.
Ici, nous montrons l’utilisation de microscopie de Illumination structurée (SIM) pour obtenir une visualisation détaillée et la quantification de le germinosome(s) dans les spores de b. subtilis, ainsi que de leurs IM lipides domaines9. Le protocole contient également des instructions pour la sporulation, la préparation et l’analyse d’image par SIMcheck (v1.0, un plugin d’imageJ) ainsi que de ImageJ10,11,12.
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Protocol
1. b. subtillis Sporulation (Timing : 7 jours avant l’Observation microscopique)
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Jour 1
- Ensemencer une culture bactérienne sur un bouillon Luria-Bertani (LB) agar plaque (tryptone 1 %, extrait de levure 0,5 %, 1 % de NaCl, 1 % d’agar)13 et incuber une nuit à 37 ° C pour obtenir des colonies individuelles. Utiliser la souche de b. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry chat, gerD-gfp kan) et sa souche de fond parent b. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) comme décrit plus haut7.
Remarque : L’utilisation des spores avec le fond de ΔcotEΔgerE est indispensable à la visualisation de germinosome, afin de minimiser l’autofluorescence des spores couche couches7. - Stériliser tous les médias, tubes, pipettes et autres matériaux de la culture pour être utilisée avec les méthodes appropriées.
- Ensemencer une culture bactérienne sur un bouillon Luria-Bertani (LB) agar plaque (tryptone 1 %, extrait de levure 0,5 %, 1 % de NaCl, 1 % d’agar)13 et incuber une nuit à 37 ° C pour obtenir des colonies individuelles. Utiliser la souche de b. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry chat, gerD-gfp kan) et sa souche de fond parent b. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) comme décrit plus haut7.
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Jour 2
- Ensemencer une seule colonie dans 5 mL de milieu LB tôt dans la matinée et incuber la culture sous agitation continue dans un tube avec bouchon à vis à 200 tours/minute et 37 ° C jusqu'à ce que l' OD600 atteint 0,3-0,4 (environ 7 h).
- Faire 500 mL de milieu MOPS (pH 7.5) contenant 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2SO4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM VADROUILLES, la Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucose-monohydrate de 4 mM et 10 mM NH4Cl.
- Préparer à bouchon à vis tubes 10-1- 10-7 série de dilutions de la culture de la LB dans 5 mL milieu de MOPS chaque et incuber les cultures du jour au lendemain sous agitation continue à 200 tours/minute et 37 ° C.
Remarque : La série de dilutions préparées ici vise à obtenir une dilution en phase exponentielle tôt le lendemain. Cette étape et l’étape suivante sont nécessaires pour permettre les cellules de s’adapter au milieu de croissance mises en mémoire tampon MOPS.
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Jour 3
- Sélectionnez l’une des dilutions MOPS avec un OD600 de 0,3 à 0,4. Inoculer 0,2 mL de la culture à préchauffé (37 ° C) 20 mL de milieu MOPS dans une fiole conique de 250 mL et incuber en agitant continuellement jusqu'à ce que l' OD600 atteint 0,3-0,4 (~ 7 h).
- Ensemencer le milieu de sporulation base de MOPS (250 mL) avec 1 % (v/v) de pré-culture étape 1.3.1 et incuber pendant 3 jours à 37 ° C dans une fiole conique litre sous agitation continue. FM4-64 la coloration des spores PS4150, ajouter 2 µg/mL FM4-64 sonde (voir Table des matières) à la sporulation moyen 1 ou 2 h après avoir atteint le sommet valeur600 OD de la croissance végétative (généralement environ 2) et permettent la culture de par la suite sporuler tout en les protégeant de la lumière5.
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Jour 7 : Récolte de spores
- Déterminer le rendement de la sporulation (cellules végétatives de spores vs) à l’aide de microscopie à contraste de phase à un grossissement de 100 X à distinguer les spores lumineux de phase de cellules en phase sombre et éventuellement non-mures spores. Un rendement de spore lumineux phase 90 % est attendue.
- Les spores à 4 270 x g pendant 15 min à 4 ° C dans des tubes à centrifuger fond rond a granulé. Laver le culot de spore 2 - 3 fois avec 40 mL d’eau ultra pure stérile de Type 1 déminéralisée dans les tubes à centrifuger coniques 50 mL (voir Table des matières). Spin down à chaque lavage à 4 270 x g pendant 15 min (4 ° C).
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Jour 7 : Purification de spore
- La purification des spores : suspendre le culot de spore dans 750 µL de milieu gradient de densité non ioniques 20 % (voir tableau des matériaux) et chargez à 800 µL de milieu dégradé densité non ioniques de 50 % dans des tubes de microcentrifuge stérilisé. Centrifuger pendant 60 min à 21 500 x g. Le culot obtenu contient les spores libres. Suspendre le culot de spore dans 200 µL de milieu dégradé de 20 % densité non ioniques et charger sur 1 mL de milieu de gradient de densité non ioniques 50 % dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 21 500 x gpendant 15 minutes.
- Laver la préparation finale de spore et stockage : le culot obtenu contient les spores dormantes purifiées. Laver le culot de spore 2 - 3 fois avec 1,5 mL d’ultra pure stérile Type 1 de l’eau (voir Table des matières) et spin down dans l’intervalle à 9 560 x g pendant 15 min à 4 ° C. Enfin, suspendre le culot dans eau ultra pure stérile de Type 1 à un final de l’OD600 environ 30. Aliquotes des spores peuvent être stockées à-80 ° C pendant 8 semaines14.
2. décapage
- Traiter les spores de PS4150 avec 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% sodium dodecyl sulfate (SDS) / 0,1 M le dithiothréitol (DTT) à 70 ° C pendant 1 h. laver les spores 10 fois avec stérilisé ultra pure Type 1 eau15,16. Ce faisant, toute adsorbé sonde FM4-64 dans la membrane externe de spore et couches extérieures seront supprimés.
3. lamelle et préparation11 (Timing : 1 H avant l’Observation)
- Lamelles en pré nettoyage haute précision (voir Table des matières) avec du 1 HCl M pendant 30 min dans un bain d’eau secouer doucement. Laver les lamelles couvre-objet deux fois dans l’eau ultra pure Type 1 et rangez-les dans 100 % (vol/vol) EtOH. Laissez-les sécher et vérifier leur clarté avant utilisation. Un nettoyage préalable des lames de verre dans 70 % EtOH. Laissez-les sécher et vérifier leur clarté avant utilisation.
4. l’échantillonnage des microsphères fluorescentes ou Spores dans le cadre du gène diapositive10 (calendrier 15 Min)
- Préchauffer les deux 70 % EtOH nettoyé et lames de verre séchées (voir Table des matières) de l’air pendant quelques secondes sur un bloc de chauffage de 70 ° C, déposer 65 μL de stérilisé 2 % d’agarose qui s’est tenue à 70 ° C au sommet d’une lame et placer l’autre lame de verre sur le dessus pour répandre l’agarose b ntre les diapositives. Le patch d’agarose sèche en environ 5 min.
- Découpez le gel d’agarose dans une section de 1 x 1cm après avoir enlevé une des diapositives verre, ajouter 0,4 μL d’échantillon (microsphères fluorescentes ou spores de 10 ~8/ml) et transférer le patch sur la lamelle de haute précision en plaçant la lamelle sur le patch et glisser.
- Fixer un gène Frame (1,5 x 1.6 cm2, 65 µL) sur la lame séchée, sur lequel la lamelle est placée la fermeture de tous les coins du cadre, complétant ainsi la diapositive pour utilisation en microscopie.
5. imagerie11,17(Timing : 1 H)
- Capturer les images de transmission et de la fluorescence des spores ainsi qu’un mélange de rouge et de jaune-vert carboxylate-modification des microsphères fluorescentes sur un Microscope à éclairage structuré (voir Table des matières) équipée d’un 100 x (objective) huile Ouverture numérique = 1,49), un logiciel d’analyse CCD caméra et l’image (voir la Table des matières). Générer toutes les images à température ambiante sans la perturbation de la lumière ambiante. Veillez à toujours nettoyer 100 x objectif et la lame avec de l’éthanol 75 % avant l’imagerie.
- Mettre l’accent sur des microsphères fluorescentes 100 nm (diamètre) et d’optimiser la fonction de point propagation (psf) en ajustant la bague de correction sur l’objectif 100 x jusqu'à l’obtention d’un psf symétrique, minimisant ainsi le flou de l’image. La psf est la réponse impulsionnelle ou la réponse d’un système d’imagerie à une source ponctuelle ou un objet point.
- Sélectionnez un champ de vision avec des microsphères fluorescentes rondes environ 10. Appliquer une grille de concentrer l’ajustement pour les deux 561 nm et 488 longueurs d’onde nm excitation comme le guide pour le logiciel d’analyse de l’image.
- Concentrer les spores avec la lumière de la transmission et de capturer une image lumineuse de transmission en mode moyenne 16 × 200 ms après exposition pour chaque image.
- Capturer les images fluorescentes raw 3D-SIM des spores avec le mode d’éclairage « 3D-SIM », les paramètres de la caméra au mode de lecture électronique multipliant (EM) Gain 10MHz à 14 bits et le gain de EM à 175. Exciter la sonde FM4-64 dans les spores de PS4150 à 561 nm laser à la puissance de laser de 20 % et un temps d’illumination de 400 ms.
- Exciter la GerKB-mCherry et des spores de GerD-GFP dans KGB80 avec, respectivement, 561 nm lumière laser à la puissance de laser de 30 % pour 1 s et 488 nm laser lumière à 60 % puissance du laser pour 3 s. Z-pile paramètres se trouvent dans le haut en bas mode, 0,2 µm / step, 7 étapes et 20 étapes pour germinosome et Analyse de l’IM, respectivement.
Remarque : Ces paramètres de laser ont été appliqués afin d’assurer une luminosité maximale de la fenêtre d’histogramme d’environ 4 000.
6. reconstruire les Images Raw 3D-SIM de FM4-64 teinté PS4150 Spores
- Effectuer la Reconstruction de tranche N-SIM FM4-64 colorées des données brutes des spores de PS4150. Cliquez sur le bouton de Param pour Reconstruire tranche sur la feuille d’onglet bloc N-SIM pour ouvrir la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM.
- Définissez les paramètres de reconstruction dans la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM . Pour obtenir des images reconstituées parfaites, suivre la suggestion de la notice N-SIM et cliquez sur les contrôles appropriés dans la fenêtre de Reconstruction tranche N-SIM pour l' Illumination Modulation contraste (IMC) la valeur Auto, haute Suppression de bruit de résolution (HRNS) à 1,00 et Hors de la répression flou Focus (EF) à 0,05 comme points de départ.
- Cliquez sur le bouton de Tranche de reconstruire dans la fenêtre de N-SIM tranche de Reconstruction pour reconstruire l’image. Évaluer la qualité des images reconstituées par les images de Fast Fourier transforme (FFT) et le score de reconstruction, qui affiche après reconstruction12.
- Régler le HRNS de 0.10 à 5.00 et ef de 0,01 à 0,50 en cliquant sur les contrôles appropriés dans la fenêtre N-SIM tranche Reconstruction jusqu'à obtient les meilleurs réglages de paramètre.
- Cliquez sur le bouton appliquer dans la fenêtre de N-SIM tranche reconstruire pour appliquer les paramètres modifiés. Cliquez sur le bouton fermer pour fermer la fenêtre.
- Faire un FM4-64 teinté PS4150 image raw spores active et cliquez sur le bouton Reconstituer tranche sur l’onglet Pad N-SIM pour exécuter la Reconstruction de la tranche. Enregistrez l’image reconstruite.
7. image Analysis
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Convertir des images de Pseudo-Widefield de la germinosome de KGB80
- Convertir les images raw 3D-SIM de KGB80 Pseudo-Widefield images en activant d’un simple clic gauche le plugin ImageJ SIMcheck utilitaire Raw Data SI au Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield moyenne des images à partir des données brutes de SIM et assemble, à titre de comparaison, une image équivalente à widefield classiques éclairage12. Pour ImageJ elle-même voir https://imagej.net/Welcome. Choisir au hasard les spores ~ 25 dans chaque image transmission inversée pour une analyse ultérieure de germinosome dans les images de Pseudo-Widefield fluorescents.
- Sélectionnez dans les spores KGB80 total environ 350 (dans cet exemple, 346) 14 champs de vision des deux lames. Le nombre de foyers fluorescents GerD-GFP et GerKB-mCherry dans les spores de KGB80 sélectionnés devrait être compté indépendamment par deux chercheurs. Le chercheur peut renvoyer les images raw 3D-SIM quand dans le doute de la présence de foyers distincts germinosome fluorescent dans les spores.
- Évaluer les intensités maximales de chaque concentration de GerD-GFP et GerKB-mCherry et de l’intensité intégrée d’image 3D de chaque spore KGB80 avec ImageJ.
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Analyser les images de Pseudo-Widefield de la germinosome de KGB80
- Utiliser la valeur de moyenne intensité intégrée de 7 piles comme l’intensité du signal intégré de la spore KGB80. Déterminer les intensités de l’arrière-plan par imagerie de la souche de fond PS4150 à l’aide des paramètres identiques. Jugeaient taches fluorescentes dans les spores de KGB80 individuels germinosome foyers quand ils sont distinguent nettement de l’arrière-plan.
- Appliquer unidirectionnels ANOVA-essais pour la détermination de l’importance avec le logiciel origine 9.0. compte tenu des valeurs de P < 0,05 comme statistiquement significative. De grade coefficient de corrélation de Spearman18 permet d’évaluer la corrélation entre le nombre de foyers de GerD-GFP et GerKB-mCherry et les mesures de l’intensité du signal intégrée.
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Representative Results
Le protocole actuel présente une procédure d’imagerie de microscope SIM pour les spores bactériennes. Les procédures de préparation de la sporulation et la glissière ont été effectuées tel qu’indiqué dans la Figure 1 avant l’imagerie. Plus tard, les procédures d’imagerie et d’analyse ont été appliquées pour dim (protéine fluorescente étiqueté protéines de germination) et lumineux spore (sonde lipophiles coloré IM) échantillons comme indiqué dans le texte suivant.
Localisation de germinosomes dans les spores de b. subtilis
Niveaux de RGO et GerKB sont signalés comme étant des molécules ~ 3 500 et ~ 700 par spore, respectivement, d’après les analyses de Western blot des extraits des spores préparés dans une moyenne de sporulation riche19. Le RGO-gfp et gerKB-mCherry de gènes chez la souche KGB80 sont sous le contrôle de leur promoteur natif. La faible abondance des protéines de fusion a conduit à un faible signal fluorescent au cours de l’image, alors qu’il était difficile de reconstituer ces dim images raw de SIM par l’algorithme de reconstruction de SIM. Toutefois, le microscope SIM était toujours appliqué pour l’acquisition d’images de germinosome, bien que les images brutes de SIM ont été converties en images Pseudo – Widefield par SIMcheck (plugin ImageJ). En outre, une imagerie 3D sept pile a été mis en œuvre pour obtenir une meilleure vue d’ensemble de ce foyer IM. Comme indiqué dans le panneau de gauche de la Figure 2, deux foyers de GerD-GFP est apparu en piles différentes. Le, au total, trois foyers de GerD-GFP sont indiqués par les flèches blanches dans pile de Z3 de la composition de la colonne. Le panneau de droite de la Figure 2 montre une spore avec seulement un point focal de GerD-PIB dans la spore, comme en témoigne la flèche blanche à pile Z4 de la colonne composite. Au total, environ 40 % et 50 % de spores avaient deux ou cluster un RGO-GFP et GerKB-mCherry, respectivement (tableau 1). Parmi les 346 spores examinés, deux avaient 4 foyers de GerD-GFP, et une spore même eu 5 foyers de GerD-GFP. Visiblement, dans nos mains, le nombre de foyers de GerD-GFP et GerKB-mCherry dans la spore même n’était pas toujours les mêmes18. Comme le microscope SIM n’avait aucune option de contraste de phase, nous avons utilisé la microscopie transmission pour la localisation de la spore. Ainsi, les spores apparaissent avec un noyau sombre et dense entouré d’un halo lumineux.
L’intensité de fluorescence intégrée des spores de KGB80 a été mesurée par ImageJ. Les spores, qui avaient 0, 4 ou 5 foyers n’étaient pas inclus dans notre analyse statistique en raison de leur faible fréquence. Il y avait une forte corrélation positive entre GerD-GFP et les intensités de GerKB-mCherry intégré (le coefficient de corrélation de Spearman rang = 0,73). Alors que l’intensité intégrée de la protéine d’échafaudage de GerD-GFP ne différait pas entre les différentes populations (Figure 3), l’intensité intégrée de GerKB-mCherry a peu près la même chez les différentes populations (Figure 3D). L’intensité de fluorescence maximale des foyers GerD-GFP et GerKB-mCherry a tendance à diminuer, quand la spore avait de multiples foyers (Figure 3 a, B). La fluorescence maximale de tous les points lumineux, considérés comme des foyers de germinosome, était plus élevée que l’auto-fluorescence maximale des spores de PS4150 (les spores de la souche de fond KGB80 ; Figure 3 a B).
Organisation de la membrane interne
Tel que mentionné dans l’introduction, germinosome protéines sont trouvent dans IM de la spore. Cependant, peu de détails est connus sur les propriétés biophysiques de cette membrane en grande partie immobile. Découvrir plus de détails, tels que l’organisation locale de la GI, favoriserait la compréhension de l’organisation des protéines GI, en particuliers GRs et protéines de canal. Les spores de b. subtilis ont une structure formée de plusieurs couches concentriques, et une sonde lipophile ne peut facilement passer à travers ces multiples couches pour souiller l’IM autour du coeur de spore. Le passage de ces sondes est probablement entravé par les couches de la couche riche en protéines et peut-être aussi la membrane externe20,21. Pour contourner ce problème, la teinture de membrane lipophiles FM4-64 a été ajoutée à une culture de PS4150 pendant la sporulation. Ce faisant, PS4150 de la membrane de la cellule végétative a été souillé par FM4-64, et ainsi les membranes en forespores obtenu de cette culture à la division cellulaire asymétrique de la sporulation et la préspore ultérieure d’une durée sont colorées bien5. Par conséquent, les membranes de la spore mature peuvent être visualisées. Une étude antérieure a indiqué que la plupart sinon la totalité des FM4-64 est du im en spores nettoyé5. Au cours d’une période d’environ 2 semaines d’incubation et les traitements de purification de spore, les procédures de lavage appliquées supprimer toute FM4-64 de la membrane externe, ce dernier étant effectivement disparaître après le traitement de décapage et des étapes de lavage 5. Toutefois, la procédure de séparation ne supprime aucune FM4-64 de l’IM, ni a aucun effet sur les foyers de germinosome5,6. Ce qui nous excitait, c’est que plus lumineux FM4-64 taches semblables aux foyers de germinosome est apparu dans les deux intacts (Figure 4 a, B) et stimulation des spores (Figure 4, D) des spores de PS4150. Ces taches FM4-64 plus lumineux pourraient être impliqués dans le regroupement des protéines de germinosome dans la messagerie instantanée.
Figure 1 : vue d’ensemble de préparation de la sporulation et la glissière. Un aperçu affiche les étapes initiales requises avant l’imagerie. Donne des informations détaillées dans le protocole. (A), le schéma de la procédure de sporulation dans MOPS minimales définis moyen. Un PS4150 de b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) ou KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) seule colonie a été mis en culture dans 5 mL de milieu riche LB et adapté en 5 mL et 20 mL de VADROUILLES moyen à son tour et enfin sporule dans 250 mL de milieu MOPS. Une culture de début de la phase exponentielle (OD600, 0,3 à 0,4) est utilisée dans toutes les cultures intermédiaires. FM4-64 (2 µg/mL) a été ajouté au milieu de la sporulation PS4150 pour membrane de spore coloration 1 ou 2 h après avoir atteint la valeur maximale de600 OD. (B) méthode de récolte des spores de la culture de la sporulation de VADROUILLES et purification de spores par centrifugation en gradient de densité. (C) procédure de stabilisation des spores sur 1 % d’agarose pad dans une chambre de trame de gène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Pseudo-Widefield représentatif (PWF) 3D images de foyers de GerD-GFP et GerKB-mCherry dans les images brutes des deux KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) spores dormantes 3D-SIM ont été prises avec excitation bicanal (561nm, puissance de laser de 30 %, 1 s et 488nm, 60 % au laser de puissance, 3 s) à l’aide de 7 étapes de haut en bas Z-stacks. Par la suite, les images raw de SIM ont été converties en Pseudo-Widefield images 3D par le plugin ImageJ SIMcheck. De gauche à droite, 3D images (Z2-Z5) de GerD-GFP (green), GerKB-mCherry (rouge) et les images composites correspondants de deux spores de KGB80 (i et ii) apparaissent dans le panneau. Images en lumière transmission (Trans) de deux spores (i et ii), a indiqué l’emplacement des spores qui apparaissent comme des images denses sombres, entourés d’un halo lumineux. Echelle = 1 µm et tous les panneaux sont au même grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’intensité de fluorescence maximale de GerD-GFP dans KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) les spores dormantes et l’intensité de fluorescence-auto maximum des spores de PS4150 en unités arbitraires. Toutes les spores ont été illuminées par les réglages indiqués le protocole. Panneaux (A) et (B) montrent l’intensité de fluorescence maximale des foyers GerD-GFP et GerKB-mCherry, respectivement, dans KGB80 les spores dormantes ainsi que dans les deux cas l’intensité de fluorescence-auto maximum des spores parent PS4150. Panneaux (C) et (D) montrent l’intensité de fluorescence intégrée des foyers GerD-GFP et l’intensité de fluorescence intégrée des foyers GerKB-mCherry, respectivement, dans les spores dormantes de KGB80 de b. subtilis . Nous avons utilisé unidirectionnels ANOVA-essais pour la détermination de l’importance des différences dans l’intensité maximale de point focal et les intensités de fluorescence de spore intégré avec le logiciel origine 9.0 compte tenu des valeurs de P < 0,05 comme significatif. Les spores avec 4 ou 5 foyers ont été exclues de l’analyse en raison de leur faible abondance. Les données sont représentées dans des boîtes crantés. Les encoches dans les parcelles se trouvent autour des valeurs médianes observées avec leur largeur proportionnelles à l’écart interquartile (IQR). Les moustaches montrés représentent un maximum de 1.5 l’écart Interquartile. Les astérisques indiquent une différence significative des valeurs médianes. GerD-GFP et intensités de fluorescence GerKB-mCherry intégré ont une forte corrélation positive (coefficient de corrélation de Spearman = 0,73)18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Pseudo-Widefield représentatif (PWF) images (A et C) et reconstruit SIM (B et D) de la FM4-64 colorées IM de b. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) spores. FM-464 fut incorporée dans les spores au cours de la sporulation. Images raw 3D-SIM de spores intactes (A et B) et stimulation de spores (C et D) ont été prises avec l’excitation d’un seul canal (561 laser nm, puissance du laser de 20 %, 400 ms) en utilisant une 25 étape de haut en bas Z-pile. Par la suite, les données brutes de la SIM a été reconstruites par le microscope, logiciels d’imagerie (voir Table des matières) en images 3D-SIM, ou convertis en PWF par SIMcheck (plugin ImageJ). Les flèches cyan pointent vers des foyers de FM4-64 dans l’IM dans panneau B et D. Echelle = 1 μm et tous les panneaux sont au même grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Souche | Spores comptés | Foyers | Foyers par spore (%) | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | GerD-GFP | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| GerKB-mCherry | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
Tableau 1 : Présence de foyers dans les spores de KGB80. Le nombre de foyers de germinosome par des spores dans une population de double étiqueté KGB80 de b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry chat gerD-gfp kan) spores dormantes. Fluorescence dans les spores a été compté comme germinosome foyers lorsque l’intensité maximale d’un focus a été supérieure à l’intensité de l’auto-fluorescence, qui était l’intensité maximale de PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) spores dormantes excités par les mêmes paramètres d’éclairage comme les spores de KGB80.
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Discussion
Le protocole présenté contient une procédure standard 3D-SIM pour l’analyse de FM4-64 teinté de spores de b. subtilis qui inclut la sporulation, préparation et processus d’imagerie. En outre, le protocole décrit une mis à jour le SIMcheck (ImageJ)-assistée des processus pour la microscopie SIM de b. subtilis spore germinosomes marqués avec des journalistes fluorescents d’imagerie 3D. Cette dernière procédure nous a permis d’observer cette sous-structure dim avec un contraste amélioré. En couplant deux examens d’imagerie, il est possible de visualiser les sous-structures discrètes dans la spore même avec le même microscope SIM, améliorant ainsi notre base pour une interprétation mécaniste de la germination. Notez que la procédure fonctionne à une résolution latérale de ~ 100 nm et une résolution axiale de ~ 200-250 nm. C’est mieux que l’approche de la microscopie à champ large de contraste d’interférence différentielle (DIC) utilisé par Griffith7. Temps résolu analyse de germinosome apparence lors de l’initiation de germination serait une étape prochaine souhaitée. Malheureusement, bien que la microscopie SIM est en principe compatible avec live-imagerie, en raison de la nature dim de la germinosome des signaux tel SIM résolue dans le temps, analyses ne sont pas possibles en raison de blanchiment rapide des échantillons lors de l’acquisition de l’image. Afin d’obtenir des spores suffisantes pour l’analyse, il est crucial de s’assurer que la sporulation est efficacement en cours. Les chercheurs doivent donc contrôler l’efficacité de sporulation méticuleusement avec 90 % d’efficacité comme cible. Dans les résultats représentatifs, dans les spores dormantes, respectivement environ 50 % et 40 % de toutes les spores ont un ou deux GerD-GFP et GerKB-mCherry foyers (tableau 1). Le pourcentage des spores avec deux foyers est beaucoup plus élevé que celui rapporté par Griffiths précédemment7. Il y a plusieurs raisons qui pourraient expliquer le résultat différent dans les travaux en cours. Tout d’abord, la 3D imagerie processus pourrait faciliter la détection de plusieurs foyers. Différents foyers dans la spore même sont situés à différents endroits dans le sens vertical comme illustré à la Figure 1. Deuxièmement, la caméra CCD (Table des matières) et l’unité laser équipé pour le microscope SIM déterminant dans les résultats de l’imagerie. Troisièmement, semblable à approche7 à moyennes plusieurs dizaines d’images consécutives pour une meilleure analyse de l’image de Griffiths, l’image de Pseudo-Widefield de la germinosome était aussi une image moyenne à partir des images raw de SIM (5 phases et 3 orientations images). Enfin, le milieu de sporulation et les conditions de la sporulation, une variable importante dans la détermination des propriétés de la spore, sont différentes dans notre travail de celle utilisée précédemment. Griffiths et al7 utilisé riche 2 x de Schaeffer-glucose (2 x SG) moyen pour la sporulation, tout en un MOPS minimal défini milieu tamponné travaillait ici. Plusieurs études ont démontré que conditions et milieu de sporulation ont des effets significatifs sur la composition en protéines, résistance, et de b. subtilis , la germination des spores de22,23,24 , 25. en effet, il a été démontré que les niveaux des sous-unités GR sont 3 à 8 fois plus bas dans les spores obtenues sur un milieu pauvre par rapport à celles obtenues sur milieu riche en. GerD niveaux étaient également environ 3,5 fois plus faibles chez les spores moyennes pauvres, et ces spores ont pris plus de temps pour commencer la germination de spores26. Cependant, c’est ne pas clair si les conditions de la sporulation influencent également le nombre des foyers observés germinosome.
Ramirez-Peralta et coll..' s résultats26 a indiqué que les taux de nutriments germination des spores à des niveaux de population sont influencés de façon significative par les niveaux de protéines de germination et GerD. Si les intensités fluorescentes intégrées par des spores de journalistes fluorescents sont directement proportionnels aux niveaux des protéines de fusion de RGO et GerKB, niveaux des deux protéines de fusion sont très différent dans les spores de KGB80, qui est en accord avec les travaux antérieurs 7. cette hétérogénéité de niveau de protéine pourrait être liée à l’hétérogénéité de la germination de spores observée au niveau des spores simples, et nombre de foyers germinosome pourrait être un autre facteur contribuant à l’hétérogénéité de la germination des spores. D’autres expériences mettra l’accent sur une analyse de l’effet possible que nombre de foyers germinosome et composition en protéines germination foyers (pas tous les germinosomes peut être égales dans la composition en protéines germination) pourrait avoir sur l’hétérogénéité de la germination. Les données ont donné lieu à un certain nombre de questions de recherche actuel y compris : J’ai) Quel est le rôle du RGO dans le regroupement des ressources génétiques dans l’IM ; et ii) Comment sont les deux autres ressources génétiques, le GerA et le GerB, organisé dans la spore IM ?
Le protocole présenté pour les échantillons de spores sombre et lumineux permet de visualiser les sous-structures discrètes dans la spore même par microscopie SIM. Les points lumineux de FM4-64 qui ont été observés dans les spores peuvent être en raison de la vaste plissement des IM27. Par ailleurs, nous émettons l’hypothèse que ces régions sont des zones de la GI où le colorant pourrait avoir plus facilement accès à en raison de la fluidité accrue d’IM locale. Ces régions de fluidité accrue (FRR) peuvent être organisées par l’homologue de l’actine du cytosquelette MreB, bien connu pour sa concentration de fluide acyl courte chaîne lipides28,29. Visiblement, appliquant la même procédure de type sauvage de b. subtilis spores conduit également à un modèle similaire des éclaircies FM4-64 (nos observations non publiées). Dans les cellules végétatives de b. subtilis , un potentiel de membrane s’est effondré entraîne le regroupement des MreB et FRR29. La membrane interne des spores dormantes probables a une relative membrane faible potentiel20,21 et contient des niveaux détectables de MreB30 pouvant déboucher sur le regroupement des FRR en grands domaines de haute fluidité29 . Si ces domaines pourraient coïncider avec la présence de germinosomes est actuellement sous enquête.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Christiaan Zeelenberg pour son aide durant l’imagerie SIM. JW reconnaît le China Scholarship Council pour une bourse de doctorat et remercie Irene Stellingwerf pour son aide pendant la phase principale de l’imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
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