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通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

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DOI：

10.3791/59465

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2019年6月17日

 ,  , 
1Department of Experimental Medical Sciences and Lund Stem Cell Center, BMC, Lund University

本文内容

摘要

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。

摘要

将脑内常驻胶质细胞在体内直接转化为具有功能且特定亚型的神经元，为开发替代性细胞替代疗法提供了新的方向，同时也为原位研究细胞命运转变创造了工具。迄今为止，已可通过体内重编程获得神经元，但这些神经元的精确表型及其成熟过程尚未被详细分析。本实验方案中，我们采用基于腺相关病毒（AAV）的病毒载体系统，描述了一种更高效的转化方法以及对体内重编程神经元进行细胞特异性鉴定的技术。同时，我们还提供了一套用于评估重编程细胞神经元功能成熟度的实验方案。通过注射包含重编程因子基因及突触素启动子驱动的报告基因的翻转-切除（FLEX）载体，可靶向特定脑区细胞类型以实现细胞重编程。该技术可便捷地识别新生成的重编程神经元。结果表明，所获得的重编程神经元随时间推移逐步功能成熟，能够接收突触连接，并表现出多种中间神经元类型的电生理特性。利用转录因子 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1，大部分重编程细胞表现出快速放电、含小白蛋白的中间神经元特征。 向大脑中作为细胞重编程靶标的特定细胞类型进行转导。该技术可轻松识别新重编程的神经元。结果表明，所获得的重编程神经元随着时间推移在功能上逐渐成熟，接收突触连接，并表现出不同类型中间神经元的电生理特性。通过使用转录因子 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1，大多数重编程细胞具有快速放电、含小清蛋白的中间神经元特性。

引言

本方法的总体目标是高效地将脑内固有的胶质细胞在活体中转化为功能性且亚型特异性的神经元，例如表达小清蛋白的中间神经元。这为开发无需外源细胞来源的脑疾病替代细胞替代疗法提供了新的进展，同时也创建了一种用于原位研究细胞命运转换的工具。 

大脑生成新神经元的能力有限。因此，在神经系统疾病中，需要外源性细胞来源以实现脑组织修复。为此，多年来研究人员已对多种细胞来源进行了深入研究，包括原代组织来源的细胞、干细胞衍生的细胞以及重编程细胞。1,2,3将脑内常驻细胞直接重编程为神经元是一种新兴方法，有望为脑修复提供一种极具吸引力的策略，因为它利用患者自身的细胞在脑内生成新的神经元。迄今为止，已有多个研究报告通过病毒载体递送在脑内实现体内重编程。4,5,6,78,9 在大脑的不同区域，如皮层、脊髓、纹状体和中脑5,10,11，以及在完整和损伤的脑组织中5,8,11,12已获得抑制性和兴奋性神经元4,8但这些细胞的精确表型或功能尚未得到详细分析。 

在本方案中，我们描述了一种更高效的重编程方法及对体内重编程神经元的细胞特异性鉴定，并提供了用于评估重编程神经元成熟度与表型的功能分析方案。 基于功能及免疫组织化学特征的表征 

我们采用了一种 Cre 诱导型 AAV 载体和 GFP 报告基因来鉴定体内重编程神经元。这种病毒载体的优势在于能够感染脑内分裂和非分裂细胞，从而增加靶向细胞的数量，可作为逆转录病毒使用的替代方案7,8。通过使用神经元特异性的突触素驱动的 FLEX 报告系统（GFP），我们能够特异性地检测新生成的神经元。以往的研究采用亚型特异性启动子进行体内重编程7,9，这些启动子也可实现重编程基因和报告基因在特定细胞类型中的表达。然而，该方法需要通过死后分析报告基因与神经元标记物的共表达来进一步鉴定重编程神经元。而使用神经元特异性报告基因（如本文所述）则可实现直接鉴定，从而为重编程成功提供直接证据，并支持活细胞鉴定，这对于膜片钳电生理实验至关重要。

方案

所有实验操作均依照欧盟指令（2010/63/EU）进行，并经隆德大学实验动物使用伦理委员会及瑞典农业部（Jordbruksverket）批准。小鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水。

1. 病毒载体

  1. AAV 载体的克隆
    1. 为构建 Cre 诱导型 AAV5 载体，将 GFP、Ascl1、Lmx1a 和 NR4A2（Nurr1）的 cDNA 以反向插入方式置于两对异型、反向排列的 LoxP 翻转切除（FLEX）序列之间（材料表）。cDNA 插入可使用如 pAAV-Cba-FLEX 或具有类似结构（包含 FLEX 序列和鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子）的载体骨架。
    2. 通过聚合酶链式反应（PCR）和限制性内切酶，将每个单独的 cDNA（例如 Ascl1）插入载体骨架中。GFP 在突触素（synapsin）启动子控制下表达，而 Ascl1、Lmx1a、Nurr1 则在广泛表达的 CBA 启动子控制下表达。
      注意：使用特定的无内毒素质粒 DNA 提取试剂盒，确保获得无内毒素的 DNA。
    3. 在使用前对构建体进行测序和限制性酶切分析，以确认克隆步骤的成功。
  2. AAV5 病毒载体的制备
    注意：操作腺相关病毒（AAV）时，请遵循当地的生物安全指南。在瑞典，本方案中使用的 AAV 需要达到生物安全二级（BSL-2）标准。
    1. 使用标准培养基（DMEM+Glutamax + 10% FBS + 青霉素（100 U/mL）链霉素（100 μg/mL），参见 材料表）在 T175 培养瓶中接种 HEK293T 细胞，接种密度为每瓶 3 × 106 个细胞。每批 AAV 需准备 5 个培养瓶，建议每次同时进行 6 批。
    2. 当细胞融合度达到 50–70% 时，为每个 175 cm2 培养瓶准备以下转染混合液：
      1. 在 50 mL 离心管中，加入等摩尔量的载体质粒和 pDG 系列辅助质粒（pDP5、pDP6），每 175 cm2 培养瓶总质粒量为 72 µg。
      2. 加入 TE 缓冲液（Tris-EDTA 缓冲液，10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA），定容至 144 μL。
      3. 加入超纯水，使总体积达到 1296 μL，并混匀。
      4. 加入 144 μL 的 2.5 M CaCl2 并混匀。将 1.92 μL HEPES 缓冲盐水（HBS）（1.5 mM Na2HPO4，140 mM NaCl，50 mM HEPES）加入 DNA 溶液中，并立即涡旋混匀。
      5. 室温（RT）孵育恰好 60 秒。将溶液转移至 28 mL 新鲜细胞培养基中并混匀。
    3. 将培养瓶中的培养基更换为含有转染混合液的细胞培养基。
    4. 转染后三天，将培养瓶中的培养基倾倒至一次性废液容器中，然后向每个培养瓶中加入 5 mL 收获缓冲液（在磷酸盐缓冲液（DPBS）中加入 EDTA，终浓度为 5 mM，参见 材料表），以促进细胞脱落。
    5. 将细胞悬液倒入 50 mL 离心管中。向每个培养瓶中再加入 4 mL DPBS 冲洗残留细胞，并将冲洗液与初次收集的细胞悬液合并。在 4 °C 条件下，以 1,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞。
    6. 离心后弃去上清液，通过涡旋将沉淀溶解于 15 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM NaCl，1 mM MgCl2）中。
    7. 将裂解液在 CO2-冰/乙醇浴中冷冻 15 分钟，随后储存于 -20 °C 冰箱中。使用前在 37 °C 水浴中解冻收获的细胞裂解液。
  3. AAV5 病毒载体的纯化
    1. 采用碘克沙醇梯度超速离心法进行 AAV 纯化13，使用超速离心密封管，在室温下以 350,000 × g 离心 1 小时 45 分钟。
    2. 使用 10 mL 注射器配 18G 针头，将针尖斜面朝上，插入 40/60% 相界面下方约 2 mm 处，以提取含 AAV 的相。当提取量达到 5–6 mL 时，应在触及蛋白条带前停止操作。
    3. 将梯度提取物储存在经高压灭菌的玻璃瓶中，4 °C 保存。避免储存时间超过过夜。
    4. 通过缓慢吹打加入 12 mL 碘克沙醇洗脱（IE）缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，15 mM NaCl），同时轻轻旋转，使碘克沙醇梯度提取物稀释 3 倍。
    5. 通过阴离子交换滤膜对稀释后的碘克沙醇梯度液进行纯化和浓缩。推动速度应缓慢，不超过 1 滴/秒。再缓慢推动 3 mL IE 缓冲液通过滤膜以洗涤。
    6. 用 1–2 mL 洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0；250 mM NaCl）将目标物洗脱至离心过滤装置中。向装置中加入 DPBS 至终体积为 4 mL。在室温下以 2,000 × g 离心，直至滤膜中剩余液体少于 0.5 mL。从管底移除液体，重新加入 4 mL DPBS 并再次离心。重复此步骤两次。确保最后一次离心后，滤膜上浓缩的载体体积约为 200 µL。
    7. 用移液器吸取 200 µL 浓缩载体，并通过 0.22 μm 滤膜过滤以实现无菌化。分装 200 µL 至带互锁内插件的 9 mm 玻璃小瓶中（材料表）。
      注意：AAV5 载体储备液可长期储存在 -80 °C 冰箱中，若在两周内使用，可暂时存放于 4 °C。
  4. AAV5 病毒载体滴度测定
    1. 使用标准定量聚合酶链式反应（qPCR）测定 AAV5 滴度，引物针对反向末端重复序列（ITR），并使用 5´FAM / 3´BHQ1 标记的 ITR 探针（材料表）。使用已知含量的含 ITR 质粒建立标准曲线。若以 ITR 序列进行滴度测定，每种 AAV 载体的滴度应在 1E+14 – 1E+15 拷贝/毫升范围内。
      注意：成功的 AAV5 病毒制备所得储备液滴度应至少达到 3E+13 – 7E+13 单位/毫升。

2. 将重编程因子注射入脑内

  1. 动物准备、立体定位放置与钻孔
    注意： 本方案重点介绍利用 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1（ALN）将 NG2 胶质细胞重编程为中间神经元的方法。根据我们的经验，使用其他因子组合也可获得表型相似的中间神经元。11.
    1. 手术前，准备含有 Cba-FLEX-Ascl1、Cba-FLEX-Lmx1a、Cba-FLEX-Nurr1 载体及报告基因载体 Syn-FLEX-GFP 的病毒混合液。将第1节中制备的各储存液按比例加入最终混合液中，使终末病毒溶液中每种重编程因子（Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1）各占5%，报告基因构建体占10%（即5% A、5% L、5% N 和 10% GFP）。
      注意： AAV5 载体混合物可保存于 4 °C 并在体内保存以供未来使用。
    2. 使用含 2% 异氟烷的空气与一氧化二氮（N₂O）混合气体麻醉小鼠2O) 按 4:1 的比例混合。通过观察膈肌运动监测动物的呼吸。手术过程中，使用 1–1.5 % 异氟烷维持麻醉。
      注意： 此处描述的小鼠模型为一种在NG2胶质细胞中特异性表达Cre的转基因小鼠品系。利用在其他胶质细胞群体（例如星形胶质细胞）中表达Cre的不同小鼠品系，也可实现体内重编程。14).
    3. 待实验动物完全麻醉后 （例如., 完全肌肉松弛且对足垫捏压无反应），剃除切口周围区域的毛发，并将动物固定于立体定位仪上。
    4. 为维持动物在手术期间的体温，将加热垫连接至立体定位仪的底座。将小鼠置于一张洁净、干燥的纸巾上。
    5. 将小鼠头部小心放入耳杆中。若位置正确，则不应观察到头部有侧向移动。在将小鼠放入立体定位仪之前，先将左侧耳杆设定为4 mm。
    6. 固定齿栏，然后拧紧鼻栏。确保头部在任何方向上均无移动，且正向前方（中线垂直于耳杆平面）。涂抹眼膏以保护眼睛。
    7. 手术开始前，给予适当的镇痛药物（如, 0.05 mg/kg 的布托啡诺（皮下注射）。
    8. 用浸有70% EtOH的棉纱布或擦拭垫清洁切口区域，避免接近眼部区域。
      注意： 用于颅内病毒注射时，使用5或 10 μL 使用连接了拉制玻璃毛细管的注射器。玻璃毛细管通过微玻管拉制仪拉制而成，获得尖端极为细小的毛细管，以最大限度降低操作的侵入性。将毛细管与注射器连接时，可在注射器针头与玻璃毛细管之间套接一段橡胶管，并用热源（如打火机）加热熔接。确保两者之间形成紧密连接，以防止注射过程中出现液体泄漏。在开始手术前，可通过向注射器内注入生理盐水并推动液体排出的方式进行测试。
    9. 沿头部正中线做一个长约0.5–0.8 cm的切口。使用手术刀切开皮肤及皮下组织层。
    10. 扩大切口两侧的皮瓣。清除切口处的血液，并用棉签刮除皮下组织层。
    11. 将立体定位仪的内侧/外侧-背侧/腹侧（M/L-D/V）臂移至动物上方并固定。
      注意： 立体定位仪可沿前后（A/P，Y轴）、内外（M/L，X轴）和背腹（D/V，Z轴）方向调节注射器。
    12. 沿立体定位仪框架的不同轴向移动注射器，使玻璃毛细管尖端恰好位于前囟（bregma，即颅骨各骨板交汇的接合点）上方。
    13. 确保毛细管尖端在前后方向和内外侧方向上完全平直。若前囟位置不明确，取外侧缝线与中线缝线的平均值。
    14. 当毛细管尖端准确定位于前囟上方时，在数字坐标计数器上将内侧/外侧（M/L）和前侧/后侧（A/P）值均重置为 0.0。
    15. 为确保动物头部处于完全水平的位置，当 A/P 臂位于 +2.0 和 -2.0（M/L = 0.0）时，以及当 M/L 臂位于 +2.0 和 -2.0（A/P = 0.0）时，使用数字坐标计数器测量 D/V 坐标值，并相应调整门齿杆和耳杆的高度。
    16. 将注射器移至纹状体内病毒载体注射的预定坐标位置（A/P = +1.0；M/L = -2.0，相对于前囟）。
    17. 将注射器略微抬起，通过显微镜观察注射位点，使用牙科钻在注射坐标处钻孔。从该位点开始，以环形且轻柔的方式进行钻孔。
      注意： 不要施加过大的向下的压力，因为钻头应足够锋利，无需额外用力即可穿透骨骼。避免长时间持续钻孔，以免产生热量。
    18. 钻孔结束后，检查硬脑膜是否保持完整 完整暴露以进行注射。
  2. 注射器装置准备
    1. 在开放切口上放置一块纱布，用生理盐水冲洗注射器。
    2. 灌注后，吸取1–2 μL，随后 1 μL 避免产生意外气泡，注入含有病毒载体的溶液。确保在注射过程中，病毒溶液位于气泡下方并能清晰可见。
  3. 病毒注射
    1. 移除切口部位上方的棉纱，使用立体定位仪的腹背向（D/V）臂降低注射器。当接近颅骨表面时，通过显微镜仔细观察，并测量硬脑膜的腹背向（D/V）水平——在轻微压力下，硬脑膜应略微隆起。
    2. 用毛细管尖端接触硬脑膜时，将背腹向（D/V）坐标设为0.0。
    3. 将注射器缓慢下放至目标深度（D/V = -2.7，相对于硬脑膜）。确保进针路径无骨碎片阻碍，避免针头/毛细管发生弯曲。
      注意： 所提供的坐标系对应于将重编程因子注射至NG2-Cre小鼠纹状体。也可使用对应于其他脑区的坐标系。在将重编程因子注射至新的小鼠品系脑内之前，务必首先使用染料（如台盼蓝）、有色微珠或携带报告基因的病毒载体对注射坐标进行验证。若使用台盼蓝注射，动物需在手术后立即处死并取出脑组织。新鲜脑组织可在冷冻后使用切片机进行切片，并通过观察染料在脑内的位置确定注射位点。若使用有色微珠验证坐标，可在注射一周后通过灌注固定并切片的脑组织确定注射位点。 alternatively，可注射携带报告基因的病毒载体，并在灌注固定后切片的脑组织中确定注射位点。
    4. 注射 1 μL 病毒溶液的注射速率为 0.4 μL/min注射完全部体积后，留出 2 分钟的扩散时间，再撤出注射器。
    5. 扩散后，缓慢回撤移液管，直至毛细管尖端完全离开脑组织。
    6. 在伤口上放置一块纱布，用生理盐水冲洗注射器。
    7. 将立体定位仪的内侧/外侧-背侧/腹侧（M/L-D/V）臂移出工作区域。
  4. 伤口闭合与术后操作
    1. 使用缝合线仔细缝合切口。
      注意： 注射动物所使用的全部缝合线应弃置于含有抗病毒洗涤剂溶液的杯子/试管中。该溶液同样用于清洁手术区域周围所有接触过手术材料的表面。所有手术器械在每次手术日结束时均需彻底清洗并高压灭菌。
    2. 将动物从立体定位仪上取下，置于术后观察区，该区域应包括一个洁净的加热笼具，并提供食物和水，动物需留在此处直至完全清醒。在此期间，需密切监测动物状态，直至其意识恢复。
    3. 手术动物在完全恢复前不得与未手术动物同笼饲养。
    4. 每天监督手术动物的状况。根据所使用的缝线类型，必要时确保将其拆除。 所有动物均在术后皮下注射布托啡诺（Temgesic，1 ml/kg）作为术后护理。
      注意： 若使用同一注射器连续操作两天，需先用水冲洗，再用70%乙醇冲洗，最后再次用水冲洗。将注射器内留置水过夜，以溶解可能残留的物质。

3. 电生理记录

  1. 用于电生理学的组织切片制备
    注意： 良好的组织制备是获得优质电生理记录的必要条件。应仔细准备房间，并将灌注和解剖所需的工具置于冰上。
    1. 准备冰冻且充氧（95% O₂, 5% CO₂）的切割液2 和 5% CO₂2) Krebs 灌注、解剖与切片用溶液（于当日用10倍浓缩液配制，将浓缩液用超纯水稀释，并加入NaHCO₃）3 和葡萄糖）。Krebs 液中的成分 （稀释至1×后，单位为 mM）溶液成分如下：126 NaCl，2.5 KCl，1.2 NaH2PO4·H2O, 1.3 MgCl2·6H2O₂ 和 2.4 CaCl₂2·6H2O₂, 22 NaHCO₃3，10 葡萄糖。将溶液的 pH 值调节至 7.4。
    2. 使用新刀片对振动切片机进行校准（Vibracheck）。
    3. 启动振动切片机的冷却块（或在周围腔室中加入冰），并向切片腔内加入 Krebs 溶液 供氧溶液 含 95 % O₂2 和 5% CO₂2 至少在使用前30分钟。
    4. 将培养皿置于冰上，并加入充氧的Krebs溶液。将刀片、剪刀和固定板也放在冰上。
      注意： 将装有小鼠的笼子提前至少1小时移至操作房间，以适应环境。应激会对脑组织切片的状态产生负面影响。
    5. 通过注射过量戊巴比妥使小鼠深度麻醉并进入睡眠状态。  当角膜反射消失且动物对疼痛刺激无反应时，用冰冻的 Krebs 溶液对动物进行经心脏灌注，持续 2–3 分钟（灌注速率为 10–20 mL/min）。
    6. 迅速但小心地解剖出脑组织，将其倒置放入置于冰上的培养皿中（含Krebs溶液）。
      注意： 为比较重编程神经元的功能成熟过程，应在病毒注射后的不同时间点处死动物以进行电生理记录。根据现有文献评估不同亚型神经元的放电特性。15 .
    7. 沿小脑中部进行冠状切面切割，并将此侧粘附于冰冻的切片机载物板上，用于振动切片。
    8. 将粘好的脑组织小心浸入切片机振动刀的缓冲 chamber 中。
      警告： 为确保安全，请勿触碰剃刀刀片，以免刀片受损 校准。
    9. 从大脑最前部开始高速切割至纹状体水平，然后在纹状体水平进行冠状切面切割。 275 μm 以慢速（0.10 mm/s）进行。
    10. 每次切割后，仔细移除未注射的纹状体一侧（例如，使用弯针），并将注射侧转移至另一装有底部网筛的水浴瓶中，瓶内盛有已通氧的克雷布斯溶液（室温），并将该瓶置于水浴环境中。所有切片完成前，始终保持样本处于室温条件下。
    11. 缓慢升高水浴的温度至 37 °C 静置30分钟。然后关闭加热器，冷却至室温。
      注意：此时可以暂停，直到开始记录。各节持续 4–6 小时。
  2. 全细胞膜片钳记录
    1. 将第一片组织切片转移至记录室，浸入持续流动的Krebs溶液中。使用轻质重物固定切片，并将物镜浸入溶液。
    2. 在显微镜下识别纹状体区域，并寻找GFP阳性（重编程）神经元。选择形态广泛且未被纤维束或血管覆盖的神经元。
    3. 准备硼硅酸盐玻璃移液管（3–7 MΩ）Ω用于膜片钳并用以下细胞内溶液灌注（单位：mM）：122.5 葡萄糖酸钾，12.5 KCl，0.2 EGTA，10 HEPES，2 MgATP，0.3 Na3GTP 和 8 NaCl，用 KOH 调至 pH 7.3。
    4. 对于生物胞素填充，将1 mg生物胞素盐加入1 mL内液中并涡旋混匀。
      注意： 务必用含有生物胞素的内液过滤，否则可能会堵塞电极。
    5. 将玻璃移液管连接至记录电极，并浸入溶液中。再次检查电极的电阻。然后缓慢移动移液管接近细胞，同时在电极内保持轻微正压，以防止尖端堵塞。
      注意： 在下降电极时需密切注意细胞位置，避免细胞荧光发生漂白（即在不需要时关闭荧光灯）。
    6. 使用电极的正压小心冲洗周围组织，并将电极靠近细胞。将电极准确定位于细胞正上方，缓慢下降直至电极接触细胞膜。形成吉欧（Giga）封接。Ω 在电极与细胞膜之间形成封接，并通过负压脉冲破裂膜片，形成全细胞记录模式。
      警告： 重编程的神经元具有敏感性。在进行膜片钳操作时需格外小心，当阻抗接近吉欧姆时，避免施加过大的负压。Ω 封接或穿刺细胞膜。此外，对年龄较大的动物进行膜片钳操作需要更多的练习和耐心，因为它们的结缔组织更厚，神经元更难观察。
    7. 在电流钳模式下破膜后立即检测静息膜电位，并记录用于分析。
    8. 在电流钳模式下，将细胞膜电位维持在 -60 mV 至 -80 mV 之间，注入持续时间为 500 ms、范围从 -20 pA 到 +90 pA、以 10 pA 为增量的电流，以诱导产生动作电位。
    9. 转入电压钳模式，以10 mV的去极化阶跃测量内向钠电流和延迟整流钾电流。
      注意： 电压钳记录更适合使用另一种内部溶液进行评估，该溶液所含化学成分可更有效地钳制膜电位。然而，对于重编程神经元而言，可记录的细胞数量较少，含有这些神经元的组织切片数量也有限。因此，从同一个细胞同时进行电流钳和电压钳记录具有明显优势。
    10. 在电压钳模式下，于 -70 mV 记录自发性突触后活动。在 0 mV 膜电位下区分抑制性突触后事件，于 -70 mV 下区分兴奋性事件。
    11. 在达到稳定基线后，加入GABA受体拮抗剂印防己毒素（Picrotoxin）A 在流入记录室的克雷布斯溶液中加入受体拮抗剂，以分离兴奋性事件（将匹克罗汀原液加入连接灌流系统的独立缓冲液注射器中，使终浓度达到50 mM。将记录室缓冲液的流出端连接至真空收集袋，以便安全处理）。
    12. 孵育 20 分钟后，向流入记录室的 Krebs 溶液中加入 CNQX（20 mM），即 AMPA 受体拮抗剂，以阻断抑制性事件（操作步骤与 Picrotoxin 相同）。继续孵育 20 分钟后，再用 Krebs 溶液冲洗洗脱。 溶液。从孵育腔中取出组织切片。
    13. 记录完成后，使用阈值事件检测法对自发性兴奋性突触后电流（EPSC）和抑制性突触后电流（IPSC）进行离线分析>5 pA）在分析程序中。
    14. 在整个记录过程中，细胞将被含有生物胞素的内液缓慢填充。为确保细胞完全填充，需保持膜片钳状态至少20分钟，然后缓慢撤出电极。
      警告： 注意不要让电极产生正压，以免破坏后续对细胞的连续形态学分析。
    15. 对于生物胞素显色，将组织切片置于4%多聚甲醛（PFA）中，4℃过夜 4 °C用含0.1%吐温-20的0.02 M磷酸钾缓冲液（KPBS）冲洗切片，随后加入链霉亲和素-Cy3（1:600，溶于KPBS-T，孵育2 h），用于标记生物胞素填充的细胞，并实现重编程神经元的形态学可视化。
      注意： 生物素填充可用于 patched 神经元的形态学分析及图示。

4. 免疫组织化学、体视学及定量分析

注意：请为免疫组织化学实验专门设置一组小鼠，因为用于电生理学的组织切片不适合用于免疫组织化学。

  1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥麻醉小鼠，并将动物固定以进行灌注。
  2. 对小鼠进行经心脏灌注，先用生理盐水冲洗以去除血液，随后用冰冻的4% PFA灌注。
  3. 解剖取出脑组织，并在4% PFA中后固定至少12小时。
  4. 将脑组织置于25%蔗糖溶液（用于冷冻保护）中约12小时。
    注意：当脑组织在25%蔗糖溶液中下沉时，表明蔗糖已完全渗透整个小鼠脑组织，此时脑组织即可用于切片。
  5. 在小脑处进行冠状面切割，利用脑组织最尾端平坦的部分将其固定于切片机上，并使用最佳切割温度化合物（OCT）固定位置。
  6. 将脑组织切成厚度为35 μm的冠状切片，并将切片按连续序列分装至含有0.02 M KPBS的试管或孔板中。
  7. 根据标准方案，使用抗GFP及中间神经元标志物（如GAD65/67、PV、Chat（胆碱乙酰转移酶）和NPY（神经肽Y））抗体对切片进行免疫组织化学处理16, 17。
    注意：脑切片可在抗冻溶液中长期保存于4 °C或-20 °C。
  8. 染色完成后，将切片转移至载玻片上，用封片剂加盖盖玻片并固定。将加盖后的载玻片过夜晾干。
    注意：在本研究中，整个脑组织被切割为1:8系列（即每个试管或孔板中的切片包含小鼠脑组织的八分之一11）。
  9. 使用倒置荧光显微镜和/或共聚焦显微镜分析切片。
    注意：荧光显微镜适用于结果的整体观察及获取图像以计算重编程效率。若需通过观察双阳性细胞对表型身份进行更详细的分析，则应使用共聚焦成像。
  10. 为定量纹状体内GFP+神经元中不同标志物的表达情况，需在每张纹状体切片的至少两个视野中，统计双阳性细胞数量占GFP+细胞总数（即重编程神经元）的比例。
  11. 为估算每只小鼠脑内重编程神经元的近似总数，可计数此前切割的某一脑切片系列中纹状体内存在的GFP+神经元数量，再乘以总切片系列数。
    注意：可采用多种定量方法来表示重编程效率、每只动物中重编程神经元的数量，以及表达特定表型标志物的神经元百分比。更多信息请参见先前发表的研究11。
  12. 使用Graph Pad Prism或类似软件分析不同实验条件之间的差异。
    注意：在效率计算中，我们向NG2-Cre小鼠注射了CRE依赖的ALN转化载体及GFP报告基因。为估算转化效率，我们还向动物注射了在普遍表达的cba启动子下驱动的CRE依赖性GFP，使所有靶向细胞均表达GFP+。通过此比较，我们估算出 66.81% ± 38.38%的靶向细胞转化为神经元。为验证各基因的表达，可进行GFP/Ascl1、GFP/Lmx1a和GFP/Nurr1的互补性双重免疫荧光染色。此外，还可通过单细胞RNA测序等基因组测序技术揭示重编程细胞中各基因的存在情况。

结果

通过注射 AAV 载体，可在 NG2-Cre 小鼠纹状体中成功将内源性 NG2 胶质细胞重编程为神经元（图 1A）。为了特异性靶向 NG2 胶质细胞，将携带重编程/报告基因的 FLEX 载体以反义方向插入，并由两对反向平行、异型的 loxP 位点侧翼包围（图 1B）。三个重编程基因（Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1）分别位于独立的载体上，均由普遍存在的 cba 启动子驱动表达。为了确保 GFP 的表达仅限于源自 Cre 表达细胞的重编程神经元，GFP 被置于神经元特异性突触素启动子的调控之下（同样位于 FLEX 载体中）。

联合使用重编程因子与报告基因构建体可在小鼠纹状体中生成GFP阳性神经元（图1C，C’）。仅使用报告基因构建体而无重编程基因时，则无法产生GFP阳性神经元（图1D）。

重编程后被生物胞素（biocytin）填充的神经元在死后免疫染色后可见（图2A）。若转分化成功，应可观察到广泛的神经元形态。重编程神经元的电生理记录显示存在具有自发活动特征的功能性突触后连接（图2B、C）。该自发活动可被离子型GABA能或谷氨酸能阻断剂（Picrotoxin或CNQX）抑制，表明重编程神经元接受了兴奋性和抑制性突触输入。自发活动的发生率随病毒感染后时间的延长而增加（图2D），提示其逐渐成熟。

功能性神经元中存在电流诱导的动作电位。转化后随着时间推移，动作电位数量逐渐增加图2E）。这进一步表明神经元功能的成熟。在未成熟的神经元中，电流将引发极少或完全不引发动作电位（图 2F).

神经元的放电模式具有细胞类型特异性，因为它取决于细胞形态和通道表达等因素。15体内重编程神经元中记录到的放电模式可被区分为不同组别，并与内源性神经元亚型进行比较，例如快速放电型中间神经元（细胞类型B， 图3B）或其他细胞类型（图3A，C，D）。观察到的电生理学差异可通过特定亚型标志物的存在及其与GFP的共表达来证实（图3E- H综上所述，这些数据表明纹状体中重编程产生的神经元具有多种类型中间神经元的特性，例如表达小清蛋白（Parvalbumin）、胆碱乙酰转移酶（ChAt）和神经肽Y（NPY）的中间神经元，同时也具有纹状体中等棘状神经元的特征（DARPP32+）图 3E- H).

基因重编程的AAV注射过程示意图；NG2-Cre小鼠模型；GFP荧光。
图1：体内将原位NG2胶质细胞重编程为神经元。（A）通过AAV病毒介导的纹状体NG2胶质细胞体内重编程示意图。（B）用于体内重编程的AAV5 FLEX载体示意图，其中目标细胞中Cre的表达调控基因表达。（C 和 C’）将Syn-GFP + ALN注射至纹状体后产生的体内重编程神经元。（D）当病毒混合物中未加入重编程因子，仅注射报告基因载体时，无重编程神经元产生。比例尺 = 100 μm（C）、25 μm（C’）、25 μm（D）。请点击此处查看该图的放大版本。

神经元活动、突触记录、饼图；电生理学、突触功能分析。
图 2：体内重编程神经元具有功能活性，并随时间推移表现出成熟特征。（A）经生物胞素标记的重编程神经元，显示出成熟的神经元形态，包括树突棘。图中记录显示（B）抑制性（GABA能）活动，该活动可被GABAA受体拮抗剂毕叩毒素（picrotoxin）阻断；以及（C）兴奋性活动，该活动可被AMPA受体拮抗剂CNQX阻断。（D）具有突触后活动的神经元数量随时间逐渐增加。（E）在注射后5周（w.p.i.）时，膜片钳记录的神经元已能产生重复性放电，并在8周和12周时持续表现出该特性。（F）由电流诱导的未成熟神经元动作电位及突触后活动，与B和D相比，其突触事件和动作电位数量均较少。比例尺 = 25 μm 请点击此处查看该图的放大版本。

神经元细胞类型的电生理分析及GFP表达；数据图与荧光图像。
图3：体内重编程神经元表现出纹状体中间神经元的免疫组织化学和电生理特性。（A-D）体内重编程神经元的放电模式可呈现不同类型：（A）A型类似于内源性中等棘状神经元（DARPP32+）；（B）类似于快速放电型（PV+）中间神经元；（C）类似于具有明显下垂电位的低阈值放电神经元（NPY+）；（D）具有大幅后超极化放电特性的神经元（Chat+）。（E-H）共聚焦图像显示GFP与中间神经元标志物PV（E）、ChAT（F）、NPY（G）以及投射神经元标志物DARPP32（H）的共定位。所有比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在表达 Cre 的小鼠品系中，可使用 AAV FLEX 载体实现体内直接重编程。需要注意的是，不同小鼠品系在重编程效率方面存在差异。在纹状体中进行体内重编程时，与其他品系相比，NG2-Cre 小鼠品系已被证明效率更高。在开始使用新的动物品系前，应查阅小鼠供应商提供的关于 Cre 随时间表达的指导信息，因为动物年龄常会影响该蛋白表达的特异性。在我们的研究中，未使用超过 12 周龄的动物进行体内重编程，以避免 Cre 在 NG2 胶质细胞以外的细胞中表达。建议持续使用仅注射 Synapsin-FLEX-GFP 构建体的对照动物并进行监测，以便观察是否存在 GFP 阳性细胞；若未使用重编程基因（ALN），则不应出现此类细胞。

为了鉴定新重编程的神经元，采用一种神经元特异性的鉴定方法（例如本方案中所述的方法）至关重要。该方法能够准确识别重编程神经元，并将其与内源性邻近细胞区分开来，这在同源区域进行重编程时尤为重要。

靶向病毒注射的正确脑区结构也非常重要。因此，病毒注射的立体定位手术至关重要，尤其是在靶向较小的脑区结构时，必须确保操作的精确性。

我们先前已证明11，基于相同的重编程因子，在体外重编程实验中无法可靠地预测体内重编程的结果。因此，所有感兴趣的因子都必须在体内进行测试。据我们观察，尽管这些基因被认为参与了其他类型神经元的发育，但多种不同的因子组合在体内均产生相同亚型的神经元（即中间神经元11）。

重编程神经元的全细胞膜片钳记录是一种精细的技术，良好的组织处理对于获得理想结果至关重要。使用冰冻的 Krebs 溶液进行灌流 溶液可改善组织质量。此外，需谨慎处理膜片钳记录的神经元。尽管可通过全细胞膜片钳技术对重编程神经元的成熟度及表型特征进行一定程度的评估，但这些细胞与内源性对应细胞并不完全等同。应结合其他分析方法（如基因组测序，例如RNA测序）进一步确认重编程细胞的身份。

本文所述技术可为未来需要脑内神经元替代的治疗方案提供参考。尽管体内重编程仍处于早期阶段，且尚无预见其向人类应用的转化，但该技术可提供一种在脑内评估外源基因功能以及研究细胞体内成熟过程的方法。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Marcella Birtele 获得了欧洲联盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2015）下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络及资助协议编号676408的资助。Daniella Rylander Ottosson 获得了瑞典研究理事会（2017-01234）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AAV5 克隆与病毒载体制备试剂
pAAV-CA-FLEXAddGene38042
Ascl1AddGene67291NM_008553.4
Lmx1aAddGene33013NM_0033652.5
Nurr1AddGene35000NM_013613.2
GFP-synAddGene30456
LoxP（FLEX）序列1GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac
gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc
accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg
acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa
gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga
agaggctctaga
LoxP（FLEX）序列 2tactagtataacttcgtataggatactttatac
gaagttatcattgggattcttcctattttgatc
caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct
caccatcgacccataacttcgtatagcatacat
tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa
ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC
pDP5质粒工厂PF435
pDP6质粒工厂PF436
磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技10010023
FBS（胎牛血清）Thermo Fisher Scientific10500064
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140122
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）+ GlutamaxThermo Fisher Scientific61965026
DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）Thermo Fisher Scientific14190094
HEK293细胞赛默飞世尔科技85120602-1VL
烧瓶BD Falcon10078780175 cm²
Tris H-ClSigma Aldrich10812846001 TE 缓冲液使用 10 mM，pH 8.0；裂解缓冲液使用 50 mM，pH 8.5；IE 缓冲液使用 20 mM，pH 8.0；洗脱缓冲液使用 20 mM，pH 8.0
EDTAEDTA：InvitrogenEDTA: AM9260G 使用含 1 mM EDTA 的 TE 缓冲液
超纯水 参见超纯水系统
CaCl2SigmaAldrichC50802.5 M
杜尔贝科´s 磷酸盐缓冲液（DPBS）Thermo Fisher Scientific14190136
NaClSigma-AldrichS3014 HBS 使用 140 mM；裂解缓冲液使用 150 mM；IE 缓冲液使用 15 mM；洗脱缓冲液使用 250 mM
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G 裂解缓冲液：1 mM
超速离心密封管Beckman CoulterQuick-Seal® 聚丙烯管
OptiPrep™ 密度梯度介质Sigma AldrichD1556-250ML
10 mL 注射器-18G 针头BD305064
实验室玻璃瓶VWR?
阴离子交换滤膜PALL 实验室MSTG25Q6 带Mustang Q膜的Acrodisc装置
离心过滤装置默克Z740210-24EA Amicon Ultra-4 装置
内毒素去除型质粒DNA提取试剂盒Thermo Fisher ScientificA33073
Na2PO4Sigma-AldrichS7907
HEPESSigma-AldrichH752315 mL
Falcon管Thermo Fisher ScientificCorning 352196
Falcon管赛默飞世尔科技Corning 352070
玻璃小瓶Novatech30209-1232 CGGCCTCAGFGAGCGA
反转录终端重复序列（ITR）的上游引物 GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
反向引物用于反转末端重复序列（ITR） CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
5´FAM / 3´BHQ1 探针Jena Bioscience
0.22 mm 滤膜默克SLGV004SLMillex-GV 滤器
AAV5 病毒载体准备设备
冰箱 -20 °C
冷冻柜 -80 °C
冰箱 +4 °C
AAV病毒室
超纯水系统默克Milli-Q® IQ 7000
涡旋混合器VWR444-0004
超速离心机Beckman CoulterBeckman Optima LE-80K 超速离心机
高压灭菌Tuttnauer2540 EL
聚合酶链式反应（PCR）BioRadC1000 Touch 梯度PCR仪
定量聚合酶链式反应（qPCR）罗氏LightCycler® 480 系统
离心赛默飞世尔科技Sorvall ST16
水浴赛默飞世尔科技TSGP02
动物模型
NG2-Cre 小鼠JacksonNG2-CrexB6129，货号 #008533
脑内注射重编程因子所需试剂
水
生理盐水Apoteket AB70%
乙醇Solveco
异氟烷Apoteket AB 用温水稀释至1%溶液。
VirkonViroderm7511 
戊巴比妥Apoteket ABP0500000 腹腔注射，剂量为60 mg/ml，用于终末实验操作。
蔗糖默克S0389-500G
台盼蓝Thermo Fisher Scientific15250061
逆行标记微球LumafluorR170
布托啡诺Apoteket AB
脑内注射重编程因子所需设备 来自 RSG Solingen。
剪刀VWR233-1552来自生物化学
镊子VWR232-0007
镊子VWR232-0120
手术刀柄VWRRSGA106.62120号
手术刀VWRRSGA106.200
立体定位仪Stoelting Europe51500D
小鼠耳杆Stoelting Europe516485 μl
带可拆卸针头的注射器Hamilton Company65 内径0.75，外径1.5
玻璃毛细管Stoelting50811
玻璃毛细管拉制仪Sutter公司P-1000
牙科钻头Agnthos AB1464
ShaverAgnthos ABGT420
异氟烷麻醉舱及泵Agnthos AB83231012 mL
注射器MerckZ118400-30EA25G
针头默克Z192414 Aldrich
小鼠和新生大鼠立体定位框架适配器Stoelting51625
加热垫Braintree scientific, inc53800M 来自 Covidien 2187。
棉纱布Fisher Scientific22-037-902
橡胶管Elfa DistrelecHFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150
棉签Fisher Scientific18-366-473
全细胞膜片钳记录试剂
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9333
NaH2PO4- H2OSigma-AldrichS9638
MgCl₂2-6 H2OSigma-AldrichM2670
CaCl2-6 H2OSigma-AldrichC8106
MgSO4-7 H2OSigma-Aldrich230391
NaHCO₃3Sigma-AldrichS5761
葡萄糖Sigma-AldrichG7021 参见超纯水系统
超纯水制备 1 或 2 M。
KOHSigma-AldrichP5958-500G
K-D-葡萄糖酸盐Sigma-AldrichG4500 Sigma
KClSigma-AldrichP9541
KOH-EGTA（乙二醇双四乙酸）Sigma-AldrichE3889 Sigma
KOH-HEPES 酸（N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)Sigma-AldrichH7523
NaClSigma-AldrichS3014
Mg2ATPSigma-AldrichA9187
Na₃GTPSigma-AldrichG8877
生物胞素Sigma-AldrichB4261
Picrotoxin默克P1675 Sigma
CNQX默克C239 Sigma
冰
全细胞膜片钳记录设备
硼硅酸盐玻璃移液管Sutter公司B150-86-10
玻璃毛细管拉制仪Sutter公司P-1000
振动切片机LeicaLeica VT1000 S
水浴Thermo Fisher ScientificTSGP02
Clampfit 软件Molecular Devices
多钳位软件Molecular Devices
免疫组织化学试剂 使用浓度为4%。 警告： PFA 是一种强效固定剂，避免摄入和接触皮肤。
多聚甲醛（PFA）默克密理博1040051000 使用浓度为0.1%。
Triton X-100Fisher Scientific10254640 驴抗血清。使用浓度为 1 : 400。
血清默克密理博S30-100ML 用 Milli-Q 水将粉末重悬至 1 mg/mL。分装后于 -80 °C 保存。20°C, 对光敏感。使用浓度为 1 : 500。
4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）Sigma AldrichD9542 1: KPBS-T 中 600
链霉亲和素-Cy3赛默飞世尔科技4343151:5000，兔
抗GAD65/67Abcam1:2000，小鼠。
抗-PVSigmaP30881:200，山羊
反聊天MerkAB1431:5000，兔
抗NPYImmunostar22940
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
NaClSigma-AldrichS3014
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B1:1000，鸡
抗GFPAbcamab13970
封片液默克10981 含 DABCO 的聚乙烯醇封片剂®, 抗荧光淬灭
OCTAgar Scientific
甘油Sigma-AldrichG9012-100ML
去离子水
抗冻溶液Tissue Pro TechnologyAFS05-1000N，1000 mL/件
免疫组织化学设备
倒置荧光显微镜LeicaDMI6000 B
共聚焦显微镜LeicaTCS SP8 激光扫描共聚焦显微镜
PrismGraphPad
切片机LeicaSM2010R

参考文献

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