本文介绍了一种在小鼠模型中定量检测血液单核细胞趋化活性的实验方案，用于评估营养、药物和遗传干预对血液单核细胞的影响，并利用单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）负载的基底膜来源凝胶塞来表征小鼠模型中由血液单核细胞衍生的巨噬细胞。
本文内容
摘要
摘要
组织稳态与修复在很大程度上依赖于单核细胞来源的巨噬细胞的募集。单核细胞来源巨噬细胞的募集不足或过度均可能损害伤口愈合。我们已证明，高脂高糖饮食可促进单核细胞的预激活和功能障碍，将健康的血液单核细胞转化为具有过度趋化表型的细胞，并进一步分化为激活谱异常且表型可塑性受损的巨噬细胞。单核细胞来源巨噬细胞的过度募集以及激活谱异常的巨噬细胞的募集，被认为是代谢紊乱相关慢性炎症性疾病（如动脉粥样硬化和肥胖）发生发展的主要因素之一。本实验方案的目标是量化血液单核细胞的趋化活性，作为单核细胞预激活和功能障碍的生物标志物，并表征在这些小鼠模型中血液单核细胞倾向于分化的巨噬细胞表型。通过单细胞Western blot分析，我们发现，在将加载MCP-1的基底膜来源凝胶塞注入小鼠体内后24小时，其中33%的募集细胞为单核细胞和巨噬细胞；第3天时升至58%；但在第5天，单核细胞和巨噬细胞数量显著下降。最后，我们证明该检测方法还可用于从手术取出的基底膜来源凝胶塞中分离出活的巨噬细胞，进而通过单细胞Western blot分析进行后续表征。
引言
单核细胞来源的巨噬细胞的募集对于与代谢紊乱相关的慢性炎症性疾病（如动脉粥样硬化和肥胖）的发展至关重要1,2,3,4。在组织损伤部位，单核细胞来源的巨噬细胞的数量及其可塑性对组织稳态和修复具有关键作用。单核细胞来源的巨噬细胞募集不足或过度均可能损害伤口愈合过程5。局部组织炎症的触发，例如低密度脂蛋白（LDL）在主动脉壁的积聚与氧化，或脂肪酸或经肠道屏障渗漏的细菌脂多糖对脂肪细胞的炎症激活，可导致包括趋化因子在内的炎症介质释放，如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）。MCP-1属于C-C趋化因子家族，是介导单核细胞来源的巨噬细胞向组织炎症和损伤部位募集的关键趋化因子6,7,8,9,10。血管内皮的炎症激活可诱导细胞黏附分子的表达，如细胞间黏附分子1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）11,12，从而使被MCP-1激活的循环单核细胞沿内皮滚动、牢固黏附，并随后迁移至内皮下间隙12。浸润的单核细胞分化为巨噬细胞，可被激活为促炎表型，推动急性炎症反应。在微环境的驱动下，促炎型巨噬细胞可转化为抗炎/炎症消退型巨噬细胞，后者在清除炎症细胞、消除促炎信号以及完成组织修复和伤口愈合过程中发挥关键作用12,13。
慢性代谢应激会使单核细胞对趋化因子的反应性显著增强，并促进单核细胞的募集；我们已证明，被致敏的单核细胞会分化为巨噬细胞，其活化程序和极化状态均出现失调14,15,16。单核细胞致敏可促进动脉粥样硬化、肥胖的发生，以及可能与其他与代谢紊乱相关的慢性炎症性疾病，如脂肪性肝炎、肾脏疾病甚至癌症。为了在人类疾病的小鼠模型中评估和量化单核细胞的致敏状态，我们开发了一种新技术，通过在体内测量趋化活性来评估血液单核细胞的致敏状态14,15,16,17。该方法包括将含有趋化因子（我们通常使用MCP-1）或对照溶剂的基底膜来源凝胶分别注射至小鼠左右侧腹部皮下。当精确进行皮下注射时，基底膜来源凝胶会形成一个完整的凝胶栓，趋化因子可从中扩散，形成明确的趋化梯度，且该梯度不受周围组织或受体小鼠自身代谢或炎症状态的影响。
我们实验所用的基底膜来源凝胶是一种从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜制剂，该肿瘤富含此类细胞外基质（ECM）蛋白。这种复杂的蛋白质混合物包含层粘连蛋白（60%）、IV型胶原蛋白（30%）、连接分子entactin（8%）以及多种生长因子。基底膜基质塞实验最初是为研究不同生长因子诱导的血管生成而开发的18,19。然而，为了研究单核细胞趋化性，必须使用去除了生长因子的基底膜来源凝胶，以最大限度减少内皮细胞募集和血管生成。Matrigel（此后统称为基底膜来源凝胶）的独特且特别有用之处在于：在低于10 °C的温度下呈液态，便于趋化因子溶解；而在高于22 °C的温度下，基底膜来源溶液会迅速发生相变，形成水凝胶。这些凝胶塞可通过手术切除，清洗后用芽孢杆菌来源的中性金属蛋白酶消化，获得单细胞悬液，可用于荧光激活细胞分选（FACS）、RNA测序、单细胞RNA分析以及多种其他组学技术。本文描述了采用单细胞Western blot分析方法，对注射后第1、3或5天被募集至基底膜来源凝胶塞中的细胞群体进行表征。
方案
本方案中描述的所有方法均已获得维克森林医学院机构动物照护与使用委员会的批准。
1. 制备负载MCP-1的生长因子减少型基底膜来源溶液
注意：此为无菌操作。
- 在准备基底膜来源溶液（例如Matrigel）之前，使用消毒剂清洁细胞培养操作台。
- 准备单独包装的无菌1 mL注射器，并在将基底膜来源溶液小瓶装入注射器前，用酒精棉片擦拭瓶盖顶部。
- 将低生长因子含量的基底膜来源溶液置于冰上完全解冻。
注意：若在室温（RT）下解冻基底膜基质，需确保残留少量冰粒，以防止溶液发生凝胶化。 - 解冻后，在细胞培养操作台内打开小瓶，将MCP-1或含0.1% BSA的1×PBS进行混合。
- 准备一支带26 G针头的无菌1 mL注射器，并置于冰上预冷。
- 通过将MCP-1溶解于含0.1% BSA的1×PBS中，配制终浓度为50 µg/mL的MCP-1储存液。
- 将MCP-1加入5 mL冷的基底膜来源溶液中，稀释至终浓度为500 ng/mL。同时配制等量仅含载体（含0.1% BSA的1×PBS）的基底膜来源溶液作为对照。
- 将500 µL基底膜来源溶液（含或不含MCP-1）装入预冷的1 mL注射器中。
- 在注射前，务必从装有基底膜来源溶液的注射器中排除所有气泡，以确保形成均匀的凝胶栓。
2. 基底膜来源溶液的注射
- 在注射前及注射过程中，使用70%乙醇喷洒操作区域周围，以对环境进行消毒。
- 为诱导麻醉，将小鼠放入麻醉舱内，设置O2流量计至1升/分钟，然后调节蒸发器至2%异氟烷。
- 通过监测呼吸频率（次/分钟）、角膜反射及胡须运动来评估麻醉深度。
- 在整个操作过程中，使用鼻罩维持麻醉状态。
- 操作期间持续监测呼吸频率（次/分钟）、角膜反射和胡须运动，以确认麻醉深度。
- 确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，缓慢地（约100 μL/s）将基底膜来源溶液皮下注射至小鼠右侧（不含MCP-1）和左侧（含MCP-1） flank部位。若注射速度过慢，基底膜来源凝胶可能形成不规则形状，甚至发生碎裂，导致难以取出。
- 注射后保持注射器静置20–30秒，以防止溶液泄漏，并促使形成单一光滑的凝胶栓。
- 注射完成后，将小鼠置于加热垫上，并持续监测直至其恢复意识。
- 待小鼠完全恢复后，将其放回原笼中。
3. 收集基底膜来源的凝胶塞
- 为每只小鼠称量两个独立的 1.5 mL 微型离心管，并做好标记。
- 在注射基底膜来源溶液三天后，将小鼠放入麻醉室，使用 3% 异氟烷麻醉，随后实施颈椎脱位处死。
- 使用毛发剪去除小鼠背部毛发，或用棉签涂抹脱毛膏 5 分钟后擦去。
- 用镊子夹住小鼠下胸部和上腰部椎体周围的皮肤，做一道长约 2 mm 的皮肤切口。
- 使用手术剪从该切口沿背部中线向上剪至颈椎，向下剪至尾椎连接处（尾部连接处）上方 1 cm 处。
- 将皮肤与肌肉层分离，并将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫板上。
- 用精细镊子小心夹住包裹基底膜来源凝胶栓的纤维囊，再用精细剪刀剪除纤维囊，以清理凝胶栓。
- 取出清理后的基底膜来源凝胶栓，并转移至 1.5 mL 微型离心管中（见 3.1）。
- 称量装有清理后基底膜来源凝胶栓的微型离心管，计算基底膜来源凝胶栓的重量。
4. 消化基底膜来源的凝胶小块
- 将dispase（10 mL）置于冰上解冻。
- 使用洁净的精细剪刀在微量离心管中剪碎基底膜来源的凝胶块。
- 向每个含有基底膜来源凝胶块的微量离心管中加入800 µL dispase。
- 以最大速度涡旋振荡10秒，以破坏凝胶块。
- 将微量离心管置于37 °C、1,400 rpm的恒温混匀仪中孵育2小时，以完全溶解基底膜来源的凝胶块。
- 孵育2小时后，在室温下以400 ×g离心10分钟。小心移除并弃去上清液。
- 通过倒置或轻弹将沉淀重悬于1 mL 1× PBS中。
- 在室温下以200 ×g再次离心10分钟。小心移除并弃去上清液。
- 将沉淀重悬于300 µL PBS中。
- 取50 µL细胞悬液至另一微量离心管中。
- 向细胞悬液中加入0.5 µL calcein AM（1 M）。
注意：calcein AM是一种绿色荧光细胞活力染料，仅在活细胞中积累。 - 将细胞置于37 °C的CO2培养箱中孵育10分钟。
- 使用自动细胞计数仪计数绿色荧光（活细胞）和无荧光（死细胞）的细胞。
5. 使用单细胞Western印迹（scWB）分析确定细胞悬液中的细胞组成
- 使用前，在培养皿中加入15 mL 1×悬浮缓冲液，于室温下对scWB芯片进行至少10分钟的再水合处理。
- 将1 mL稀释后的单细胞悬液（10,000–100,000 个细胞/mL）加入已再水合的芯片中。将芯片表面置于10 cm培养皿底部，并确保其放置平整。
- 用培养皿盖盖住培养皿以防止干燥，通过梯度沉降使细胞沉降5–15分钟。
- 将芯片置于明场显微镜下，以10倍物镜检查微孔。
注意：约15–20%的微孔应含有单个细胞，含两个或更多细胞的微孔应少于2%。 - 将含有芯片的10 cm培养皿倾斜45度。
- 使用1×悬浮缓冲液轻轻从芯片顶部到底部进行移液，清洗芯片表面以去除未被捕获的细胞，重复3次。
- 准备单细胞Western仪器。
- 设置裂解时间、电泳时间和紫外捕获时间。若要分析从基底膜来源凝胶塞中回收的募集巨噬细胞，请使用以下参数：裂解时间：0 s；电泳时间：160 s；紫外捕获时间：240 s。
- 小心将芯片装入单细胞Western仪器的电泳槽中，使凝胶面朝向正确方向。注意避免损伤芯片的凝胶面。
- 向电泳槽中加入裂解/运行缓冲液，完全覆盖整个单细胞Western芯片，启动细胞裂解程序。
- 按照步骤5.8中列出的设置运行scWB仪器。
- 运行完成后，将芯片转移至10 cm培养皿中，用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤2次，每次10分钟。
- 在80 µL抗体稀释液中配制一抗稀释液（抗vinculin：1:10；抗CD45：1:15；抗CD11b：1:20；抗F4/80：1:10）（混合8 µL一抗1 + 8 µL一抗2 + 64 µL稀释液）。
- 向抗体孵育室中加入80 µL一抗溶液，并将芯片凝胶面朝下放置，使抗体溶液沿芯片毛细扩散。
- 在室温下避光孵育一抗溶液2小时。
- 在摇床上用1×洗涤缓冲液洗涤芯片3次，每次10分钟。
- 在摇床上用去离子水洗涤芯片1次，每次10分钟，以去除凝胶中的盐分。
- 在80 µL总体积中配制1:20稀释的二抗溶液（混合2 µL二抗 + 78 µL稀释液）。
- 在室温下避光孵育二抗1小时。
- 在摇床上用1×洗涤缓冲液洗涤芯片3次，每次10分钟。
- 使用载玻片离心机旋转芯片，去除残留的洗涤缓冲液。
- 使用双激光微阵列扫描仪，在5 µm分辨率下，于与二抗偶联的荧光染料对应的光谱通道扫描芯片。
- 使用scWB专用软件分析数据。
6. 剥离 scWB 芯片
- 将扫描后的芯片保存在洗涤缓冲液中，直至准备进行剥离。
- 将水浴锅置于通风橱内。
- 在水浴锅中放置一个50 mL试管架，加水至水面高出试管架约1 cm，并将水温设定为60 °C。
- 配制剥离缓冲液。取900 mL去离子水，溶解9.85 g Tris-HCl（pH 6.8）和20 g SDS，调节pH后定容至1 L。每次使用前立即加入0.8%（v/v）的β-巯基乙醇（β-ME；14.3 M）。
- 完成初始扫描后，将芯片放入一个10 cm的培养皿中，准备进行剥离。
- 每张芯片取40 mL剥离缓冲液，并加入320 µL β-ME。
注意： β-ME具有毒性，对人和环境有害。以下操作应在通风橱中进行。 - 将芯片放入容器中，并用封口膜密封容器，防止水渗入容器内。
- 将密封好的容器放入预热的水浴锅中的试管架内。
- 孵育90分钟。
- 小心地将芯片从容器中取出，并转移至一个新的培养皿中。
- 用1×洗涤缓冲液短暂清洗芯片一次，然后向培养皿中加入15 mL 1×洗涤缓冲液。
- 在摇床上清洗芯片15分钟，重复该洗涤步骤四次。
注意： 芯片现已准备好用于下一轮一抗孵育（参见步骤5.12–5.21）。
结果
为了评估血液单核细胞对趋化因子的反应性，我们将载有溶剂和载有MCP-1的基底膜来源溶液分别注射到每只小鼠的左右两侧背部。注射后第1、3和5天取出基底膜来源的凝胶塞，将其溶解并计数每块凝胶中募集的细胞数量（图1A）。通过从载有MCP-1的凝胶塞中的细胞数（实心柱）减去载有溶剂的凝胶塞中的细胞数（空心柱），得到特异性响应MCP-1而募集的细胞数量（Δ 细胞数，图1B）。我们观察到在5天期间内，MCP-1特异性的细胞募集和累积速度加快，募集速率从第1天的31,000个细胞/天增加到第3天的78,000个细胞/天，第5天达到136,000个细胞/天（图1B）。
为了鉴定进入基底膜来源凝胶塞的细胞类型，我们对从每个凝胶塞中分离出的细胞进行了单细胞Western印迹分析（scWB），检测CD45、CD11b和F4/80的表达，以识别单核细胞（CD11b+F4/80-）、巨噬细胞（CD11b+F4/80+ 以及 CD11b-F4/80+）和残留的非单核系白细胞（CD45+CD11b-F4/80-）（图2）。随后，使用抗vinculin抗体探测scWB芯片，以确定每个凝胶上的总细胞数，并确认scWB芯片微孔中为单细胞占据。在MCP-1负载的基底膜来源凝胶塞中，单核细胞的比例在第1天较低，为20%，第3天达到峰值，为47%，随后在第5天下降至14%（图2D）。在MCP-1负载的基底膜来源凝胶塞中，巨噬细胞的比例从第1天的13%稳步上升至第3天的22%和第5天的23%。对于MCP-1负载的凝胶塞，分离细胞群体中单核细胞与巨噬细胞合计比例在第3天达到最高，载药对照凝胶塞中为31%（图3A），MCP-1负载凝胶塞中为58%（图3B），表明在3天后，由MCP-1依赖性趋化作用募集的绝大多数细胞为单核细胞和巨噬细胞。尽管第5天单核细胞与巨噬细胞的总数高于第3天（图3C和D），但由于第3天时单核细胞和巨噬细胞在总细胞群体中所占比例显著更高（图3A 和B），因此第3天的细胞计数更能准确反映血液单核细胞的趋化与募集情况。因此，我们通常在处死动物前3天注射基底膜来源溶液。本研究未确定由MCP-1募集的所有巨噬细胞是否均为单核细胞来源，或是否有来自邻近组织的驻留巨噬细胞参与。
本文所示数据的统计学分析采用分析软件（例如，SigmaPlot 14）进行。组间均值比较采用单因素方差分析（ANOVA）后接Fischer LSD检验。所有数据均以至少3次独立实验的均值±标准差（SD）表示。当P < 0.05时，认为差异具有统计学意义。
图 1： 皮下基底膜来源凝胶塞中募集细胞的定量分析。（A）载对照剂（空心柱）和载 MCP-1 基底膜来源凝胶塞（实心柱）中的绝对细胞数。（B）MCP-1 诱导募集至基底膜来源凝胶塞中的细胞数量，计算方法为载 MCP-1 与载对照剂凝胶塞之间细胞数的差值。结果以均值 ± 标准差表示（n=4）请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 通过单细胞Western印迹分析鉴定基底膜来源凝胶塞中募集的细胞群体。（A+B）显示了从注射后第三天的小鼠体内分离的载有溶剂的凝胶塞（对照）和含MCP-1的凝胶塞（MCP-1）的单细胞Western印迹（scWB）分析代表性结果。芯片使用针对CD45、CD11b和F4/80的抗体进行标记，随后使用荧光二抗，具体步骤见实验方案。每个单个细胞标记条带的荧光强度以峰面积表示。（C+D）细胞群体被鉴定为单核细胞（CD11b+F4/80-，
）、巨噬细胞（CD11b+F4/80+ 以及 CD11b-F4/80+，
）或非单核系白细胞（CD45+，
）。其余细胞标记为“其他”（
）。结果以均值±标准差表示（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：基底膜来源凝胶塞中单核细胞和巨噬细胞的含量。 对注射后第 1、3 和 5 天取出的空白对照组和 MCP-1 负载凝胶塞中募集的单核细胞和巨噬细胞含量进行定量分析。结果以总细胞群的百分比（A + B）和每枚凝胶塞中的绝对细胞数（C + D）表示。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们开发了一种体内趋化性检测方法，利用了基底膜来源基质的独特物理特性，并可将趋化因子加载至该基质后注射入小鼠体内。该检测方法能够在活体小鼠中评估单核细胞（及巨噬细胞）对趋化因子的反应性，本文以MCP-1为例进行了展示，同时可用于研究基因操作、药物干预、饮食及其他环境暴露因素对单核细胞趋化功能的影响。由于我们在小鼠体内建立的趋化因子梯度基本不受基因、药物、饮食或环境因素的影响，因此单核细胞趋化活性的变化真实反映了这些细胞的功能改变，正如我们先前研究所示，这也包括蛋白质水平和转录水平上的重编程。17,20我们报道了小鼠在代谢应激条件下单核细胞对趋化因子的反应性增强，且这种高趋化活性与蛋白质水平的增加相关 S谷胱甘肽化，一种可逆的、依赖氧化还原的蛋白质翻译后修饰，多数情况下会导致酶活性和蛋白质功能丧失21,22，而在某些情况下甚至会促进蛋白质降解16,23.
要成功实施本实验并获得最佳检测结果，关键在于缓慢注入准确体积的基底膜来源溶液，以形成单一、形态完整的凝胶栓；在收获基底膜来源凝胶栓时，应完全去除纤维囊，以获得干净的凝胶栓，这有助于凝胶栓在dispase溶液中完全溶解。我们的数据显示，将凝胶栓在动物体内留置三天可实现以下优化：1）信号强度，即募集至每个凝胶栓中的单核细胞和巨噬细胞数量；2）信号的选择性，即总细胞群体中单核细胞和巨噬细胞所占比例；3）信号的特异性，即与对照载体相比，MCP-1诱导的单核细胞和巨噬细胞数量增加更为显著。最后，我们展示了如何结合前沿的单细胞分析方法与基底膜来源凝胶栓实验，用于表征募集至凝胶栓中的单核细胞，从而获取在特定小鼠模型中，针对特定遗传、药物、饮食或环境干预下，募集至损伤部位的单核细胞来源巨噬细胞潜在表型的快照信息。
该实验方法存在若干需要考虑的局限性。首先，小鼠操作（包括麻醉、基底膜来源溶液的注射以及手术解剖）需要经过练习，才能获得单个凝胶栓并生成可重复的数据。其次，尽管被招募到MCP-1加载凝胶栓中的大多数细胞为单核细胞和巨噬细胞，但仍有相当数量的其他细胞类型存在。这可能会影响对这些细胞群体进行的其他非单细胞水平分析实验的结果解读。最后，由于scWB的细胞裂解条件较为温和，蛋白质的迁移距离可能与标准WB不同，且不一定与蛋白质大小相关。因此，对于每一种新检测的蛋白质以及每一种一抗，都必须验证细胞裂解条件和电泳时间。
披露
本文的开放获取费用由Bio-Techne旗下品牌ProteinSimple提供。
致谢
本项目获得了美国国立卫生研究院（NIH，资助号：AT006885）向 R.A. 提供的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | griner bio-one | 664 160 | |
| 10x 悬浮缓冲液 | proteinsimple | R101 | |
| 15 cm 培养皿 | Falcon | 353025 | |
| 2-巯基乙醇 | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
| 5% 洗涤缓冲液 | proteinsimple | R252 | |
| 抗体稀释液 | proteinsimple | 042-203 | |
| 台式离心机 | Beckman Coulter | Microfuge 22R 离心机 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| 钙黄绿素 AM | ThermoFisher | C3099 | 1 mL |
| CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| CD45 (D4H7K) 兔单克隆抗体 | Cell Signal Technologies | 727987S | |
| CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
| Cellometer Vision 细胞计数仪 | Nexcelom | ||
| 中性蛋白酶 | BD | 354235 | 100 mL |
| 解剖剪 | |||
| 驴抗兔 IgG 二抗 [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 偶联物 |
| 驴抗大鼠 IgG (H+L) 二抗 [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 偶联物 |
| F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
| 加热块 | effendorf | 22331 | Thermomixer |
| 裂解/运行缓冲液 | proteinsimple | R200 | |
| Matrigel 基质胶（生长因子减少型） | BD | 354230 | 10 ml |
| 微阵列扫描仪 | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 显微镜 | ThermoFisher | Evos fl | |
| Milo | proteinsimple | 单细胞 Western | |
| 针头 | BD | 305111 | 26 G |
| 封口膜 | |||
| 探针室 | proteinsimple | 035-020 | |
| 重组小鼠 CCL2/JE/MCP-1 蛋白 | R&D | 479-JE-050 | |
| scWEST 芯片 | proteinsimple | C300 | |
| 摇床 | Bioexpress | Gene mate 轨道摇床 | |
| 单细胞 Western 芯片罐 | proteinsimple | 035-118 | |
| 玻片旋转器 | Labnet | C1303-T | |
| 十二烷基硫酸钠 (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
| 注射器 | BD | 309602 | 1 mL |
| Tris-盐酸 | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
| 镊子 | proteinsimple | 035-020 | |
| 水浴锅 | ThermoFisher |
参考文献
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