Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد كمية النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الجسم الحي وتوصيف الضامة المشتقة من خلايا الدم

Published: August 12, 2019 doi: 10.3791/59706
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, Section on Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Wake Forest School of Medicine

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لقياس النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية الدم في نماذج الماوس، لتقييم آثار التدخلات الغذائية والدوائية والوراثية على خلايا الدم وتوصيف خلايا الدم المستمدة من الضامة في نماذج الماوس باستخدام monocyte-chemoattractant البروتين-1 (MCP-1) محملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام.

Abstract

يعتمد توازن الأنسجة وإصلاحها بشكل حاسم على توظيف الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية. يمكن أن يؤدي كل من التجنيد الناقص والإفراطي في استخدام الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية إلى إعاقة التئام الجروح. أظهرنا أن الوجبات الغذائية عالية الدهون والسكر عالية تعزز فتيلة أحادية الخلايا وخلل وظيفي، وتحويل خلايا الدم الصحية إلى النمط الظاهري الكيميائي المفرط تستعد للتمييز إلى الضامة مع ملامح التنشيط dysregulated وضعف phenotypic اللدونه. ويعتقد أن الإفراط في توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية وتوظيف الضامة مع ملامح التنشيط dysregulated أن يكون مساهما رئيسيا في تطوير الأمراض الالتهابية المزمنة المرتبطة بالاضطرابات الأيضية، بما في ذلك تصلب الشرايين والسمنة. الهدف من هذا البروتوكول هو قياس النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الدم كعلامة حيوية لفتيلة الخلايا الأحادية واختلال وظيفي وتوصيف الخلايا الأحادية الدم النمط الظاهري الضامة تستعد للتمييز في هذه النماذج الماوس. باستخدام تحليل وصمة عار خلية واحدة الغربية، ونحن نظهر أنه بعد 24 ح 33٪ من الخلايا التي تم تجنيدها في MCP-1 المحملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام حقن في الفئران هي الخلايا الأحادية والضامة. 58% بعد اليوم الثالث. ومع ذلك، في اليوم 5، انخفضت بشكل ملحوظ في عدد الخلايا الأحادية والضامة. وأخيرا، نبين أن هذا الاختبارات يسمح أيضا لعزل الضامة الحية من المقابس هلام الطابق السفلي المستمدة من الغشاء يدويا جراحيا، والتي يمكن بعد ذلك أن تخضع لتوصيف لاحق من قبل خلية واحدة الغربية تحليل وصمة عار.

Introduction

توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية أمر ضروري لتطوير الأمراض الالتهابية المزمنة المرتبطة بالاضطرابات الأيضية، بما في ذلك تصلب الشرايين والسمنة1،2،3، 4. عدد الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية في مواقع إصابة الأنسجة وكذلك اللدونة لها حاسمة لتوازن الأنسجة وإصلاحها. كل من نقص والإفراط في توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية يمكن أن يضعف التئام الجروح5. إثارة التهاب الأنسجة المحلية، على سبيل المثال، عن طريق تراكم وأكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) في الجدار الأبهري أو التنشيط الالتهابي للخلايا الدهنية من الأحماض الدهنية أو الليبوليساكاريد البكتيري ة التي تتسرب من خلال الأمعاء الحاجز، يؤدي إلى إطلاق الوسطاء الالتهابية، بما في ذلك chemokines مثل البروتين الكيميائي monocyte-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 هو عضو في عائلة C-C chemokine والكيميائية الرئيسية المسؤولة عن توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية لمواقع التهاب الأنسجة والإصابة6،7،8، 9،10. التنشيط الالتهابي للبطانة الوعائية يؤدي إلى التعبير عن جزيئات التصاق مثل جزيء التصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) وجزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1)11،12، مما يسمح تعميم الخلايا الأحادية المنشطة من قبل MCP-1 للفة على طول، والتمسك بحزم وترحيل في وقت لاحق إلى الفضاء تحت البطانة12. التسلل الخلايا الأحادية تميز إلى الضامة، والتي يمكن تفعيلها في النمط الظاهري proinflammatory ، مما يؤدي إلى عملية التهابية حادة. مدفوعا بالبيئة الدقيقة، يمكن أن تتحول الضامة المؤيدة للالتهابات إلى الضامة حل التهاب، والتي تلعب أدوارا حاسمة في إزالة الخلايا الالتهابية، وإزالة الإشارات المؤيدة للالتهابات واستكمال إصلاح الأنسجة والجرح الشفاء12,13.

الإجهاد الأيضي المزمن رئيس الخلايا الأحادية لتعزيز كبير للاستجابة لجاذبية العلاج الكيميائي وزيادة تجنيد الخلايا الأحادية، وأظهرنا أن الخلايا الأحادية تستعد تؤدي إلى الضامة مع برامج التنشيط dysregulated والاستقطاب الولايات14،15،16. يعزز فتيلة Monocyte تصلب الشرايين والسمنة، وربما الأمراض الالتهابية المزمنة الأخرى المرتبطة بالاضطرابات الأيضية مثل التهاب الكبد الفكي وأمراض الكلى وربما السرطان. لتقييم وقياس فتيلة الخلايا الأحادية في نماذج الماوس من الأمراض البشرية، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم الحالة فتيلة من خلايا الدم عن طريق قياس النشاط الكيميائي في الجسم الحي14،15،16، 17. نهجنا ينطوي على حقن هلام الغشاء الطابق السفلي المستمدة محملة إما chemoattractant - ونحن عادة استخدام MCP-1 - أو مركبة في الجناح الأيسر والأيمن، على التوالي، من الفئران. عندما حقن بعناية تحت الجلد، فإن هلام الطابق السفلي الغشاء المستمدة من تشكيل قابس واحد، والتي يمكن أن تنتشر chemokines وخلق التدرج الكيميائي المحدد الذي لا يتأثر الحالة الأيضية أو الالتهابية من المحيطة الأنسجة أو الماوس المتلقي.

الجل المشتق من الغشاء في الطابق السفلي الذي نستخدمه في اختبارنا هو إعداد غشاء الطابق السفلي المنسع المستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)، وهو ورم غني ببروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). يحتوي خليط البروتين المعقد هذا على اللامينين (60٪)، الكولاجين الرابع (30٪)، وجزيء الإنأكتين (8٪)، وعدد من عوامل النمو. تم تطوير الغشاء السفلي مصفوفة المكونات في الأصل للتحقيق في تكوين الأوعية استجابة لمختلف عوامل النمو18،19. ومع ذلك، من أجل دراسة الخلايا الكيميائية أحادية، من المهم استخدام عامل النمو المنضب في الطابق السفلي هلام الغشاء المستمدة من البطانية للحد من تجنيد الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية. ما يجعل Matrigel (يشار إليها باسم هلام الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الآن فصاعدا) فريدة من نوعها ومفيدة بشكل خاص هو أنه في درجات الحرارة أقل من 10 درجة مئوية فإنه تسييل، مما يسمح لchemokines أن يذوب. في درجات حرارة أعلى من 22 درجة مئوية، الحل السفلي الغشاء المستمدة يخضع بسرعة مرحلة الانتقال ويشكّل بسرعة هيدروجيل. المقابس يمكن استئصالها جراحيا، وتنظيفها وحلها مع العصوية المستمدة من metalloprotease محايدة لإنتاج تعليق خلية واحدة، والتي يمكن تحليلها على فارز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، من قبل RNAseq، RNA خلية واحدة ومجموعة متنوعة من غيرها من تقنيات omics. هنا نقوم بوصف استخدام تحليل اللطخة الغربية أحادية الخلية لتوصيف مجموعات الخلايا التي تم تجنيدها في الطابق السفلي المقابس هلام المستمدة من الغشاء واحد أو ثلاثة أو خمسة أيام بعد الحقن.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية ويك فورست للطب على جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول.

1. إعداد MCP-1-تحميل عامل النمو خفض الطابق السفلي غشاء المستمدة من الحل

ملاحظة: هذا إجراء معقم.

  1. نظيفة غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية مع مطهر قبل إعداد الغشاء الطابق السفلي المستمدة الحل (على سبيل المثال، Matrigel).
  2. إعداد معبأة بشكل فردي حقنة معقمة 1 مل ومسح الجزء العلوي من غشاء الطابق السفلي المستمدة من قارورة الحل مع مسحة الكحول قبل تحميلها في المحاقن.
  3. إذابة تماما عامل النمو خفض الطابق السفلي غشاء المستمدة من الحل على الجليد.
    تحذير: إذا تم إذابة مصفوفة غشاء الطابق السفلي في درجة حرارة الغرفة (RT)، تأكد من بقايا جسيمات جليدية صغيرة لمنع الحل من الهلام.
  4. مرة واحدة إذابة، فتح القارورة ومزيج MCP-1 أو 1xPBS مع 0.1٪ BSA في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
  5. إعداد 1 مل من حقنة معقمة مع إبرة 26 G وبارد على الجليد.
  6. إعداد حل الأسهم من MCP-1 عن طريق حل MCP-1 إلى تركيز نهائي من 50 ميكروغرام / مل في 1X PBS مع 0.1٪ BSA.
  7. تمييع MCP-1 في 5 مل الباردة الطابق السفلي الغشاء المستمدة من حل لتركيز نهائي من 500 نانوغرام / مل. إعداد كمية متساوية من الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الحل مع السيارة فقط (1X PBS تحتوي على 0.1٪ BSA).
  8. تحميل 500 درجة مئوية من الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الحل (مع أو بدون MCP-1) في حقنة 1 مل الباردة.
  9. إزالة جميع فقاعات الهواء من الطابق السفلي غشاء المستمدة من محلول محملة حقنة قبل إجراء الحقن لضمان تشكيل المكونات موحدة.

2. حقن الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الحل

  1. رش 70٪ الإيثانول حول منطقة الإجراء قبل وأثناء الحقن لتطهير البيئة.
  2. للحث على التخدير، ضع الماوس في غرفة التخدير وتعيين O2 تدفق متر إلى 1 لتر / دقيقة ثم ضبط المرذاذ إلى 2٪ isoflurane.
  3. مراقبة عمق التخدير عن طريق مراقبة معدل التنفس (معدل / دقيقة)، رد فعل القرنية وحركة شعيرات.
  4. خلال العملية بأكملها، والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف.
  5. خلال الإجراء الحفاظ على رصد معدل الجهاز التنفسي (معدل / دقيقة)، رد فعل القرنية وحركة شعيرات للتحقق من عمق التخدير.
  6. بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم، حقن ببطء (ما يقرب من 100 درجة مئوية / ثانية) الحل السفلي الغشاء المستمدة تحت الجلد في اليمين (لا MCP-1) واليسار (مع MCP-1) الجناح من الماوس، على التوالي. إذا كانت الحقنة بطيئة جداً، يمكن أن تصبح المقابس هلام المستمدة من غشاء الطابق السفلي شكل غير منتظم، أو حتى مجزأة، ويصعب إزالتها.
  7. عقد حقنة لمدة 20-30 s بعد الحقن لمنع تسرب الحل والسماح واحد على نحو سلس هلام المكونات لتشكيل.
  8. بعد الحقن، ووضع الماوس على لوحة الاحترار مع الرصد حتى الانتعاش.
  9. إرجاع الماوس إلى القفص الأصلي بمجرد استرداد الماوس بالكامل.

3. حصاد الطابق السفلي غشاء المستمدة هلام المقابس

  1. وزن اثنين من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل منفصلة لكل فأر وتسمية لهم.
  2. بعد ثلاثة أيام من حقن الحل المشتق من غشاء الطابق السفلي، قتل الفأر في غرفة التخدير باستخدام 3٪ isoflurane تليها خلع عنق الرحم.
  3. قم بإزالة فرو الفأر الظهري باستخدام كليبرز الشعر أو ضع كريم مزيل الشعر بالعصي ذات الرؤوس القطنية لمدة 5 دقائق ثم امسحها.
  4. أمسك جلد الفأر باستخدام الملقط حول الفقرات القطنية السفلية والعلوية ولإجراء شق بطول 2 مم في الجلد.
  5. قطع خط الوسط من الجزء الخلفي من الماوس من شق يتكون إلى فقرات عنق الرحم ووصولا إلى 1 سم فوق تقاطع الفقرات الكاوية (تقاطع الذيل) باستخدام مقص الجراحية.
  6. افصل الجلد عن طبقة العضلات وثبت أسفل الجلد على منصة رغوة البوليسترين.
  7. عقد بعناية كبسولة ليفية التي تحتوي على الطابق السفلي الغشاء المستمدة من هلام المكونات باستخدام ملقط غرامة وإزالة كبسولة ليفية باستخدام مقص غرامة لتنظيف المكونات.
  8. قم بإزالة قابس الجل المشتق من الغشاء في الطابق السفلي ونقله إلى أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بـ 1.5 مل (انظر 3-1).
  9. وزن أنبوب الطاردة الدقيقة مع تنظيف الطابق السفلي غشاء المستمدة هلام المكونات وحساب وزن المكونات هلام الغشاء المستمدة من الطابق السفلي.

4. هضم الطابق السفلي غشاء المستمدة هلام المقابس

  1. ذوبان ديسباس (10 مل) على الجليد.
  2. Mince المكونات هلام الغشاء السفلي المستمدة في أنبوب microcentrifuge باستخدام مقص غرامة نظيفة.
  3. إضافة 800 درجة مئوية من ديسباس في كل أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على الطابق السفلي الغشاء المستمدة هلام المكونات.
  4. دوامة مع السرعة القصوى لمدة 10 s لتعطيل المكونات.
  5. احتضان أنابيب الطرد المركزي الصغير لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية في 1400 دورة في الدقيقة في خلاط حراري لإذابة تماما المكونات هلام الغشاء السفلي المستمدة.
  6. بعد 2 ح، الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة بعناية وتجاهل supernatant.
  7. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من 1X PBS عن طريق عكس أو التنصت.
  8. كرر الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقائق في RT. إزالة بعناية وتجاهل supernatant.
  9. إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من PBS.
  10. خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق.
  11. إضافة 0.5 ميكرولتر من الكالسين AM (1 M) إلى تعليق الخلية.
    ملاحظة: Calcein AM هو صبغة قابلة للحياة خلية الفلورسنت الخضراء التي تتراكم فقط في الخلايا الحية.
  12. حضانة الخلايا في حاضنة CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. عد الخلايا الفلورية الخضراء (الحية) وغير الفلورية (الميتة) باستخدام عداد خلية تلقائي.

5. تحديد تكوين الخلية في تعليق الخلية باستخدام خلية واحدة الغربية اللطخة (scWB) تحليل

  1. إعادة ترطيب رقاقة scWB قبل استخدامها في 15 مل من 1X تعليق العازلة في طبق بيتري لمدة 10 دقيقة على الأقل في RT.
  2. أضف 1 مل من تعليق الخلية الواحدة المخففة (10,000-100,000 خلية/مل) إلى الشريحة المعاد ترطيبها. وضع السطح على الجزء السفلي من طبق بيتري 10 سم. تأكد من أن السطح ثابت.
  3. غطي طبق بيتري بغطاء لمنع التجفيف ودعي الخلايا تستقر لمدة 5-15 دقيقة بالتدرج.
  4. وضع رقاقة تحت المجهر حقل مشرق وفحص الآبار في التكبير 10X.
    ملاحظة: يجب أن تشغل ما يقرب من 15-20٪ microwells من قبل خلية واحدة، وأقل من 2٪ من الآبار يجب أن تحتوي على 2 أو أكثر من الخلايا
  5. إمالة طبق بيتري 10 سم التي تحتوي على رقاقة من قبل 45 درجة.
  6. اغسل الرقاقة مع المخزن المؤقت للتعليق 1x لإزالة الخلايا غير الملتقطة من سطح الشريحة عن طريق الأنابيب لطيف من أعلى إلى أسفل الشريحة. كرر 3 مرات.
  7. إعداد صك خلية واحدة الغربية.
  8. تعيين وقت lysis، وقت الكهربائي، والأشعة فوق البنفسجية التقاط الوقت. لتحليل الضامة المجندة المستردة من المكونات هلام الغشاء السفلي المستمدة، واستخدام الإعدادات التالية: lysis الوقت: 0 ق. الكتروفوريس الوقت: 160 ق؛ الأشعة فوق البنفسجية التقاط الوقت 240 s.
  9. تحميل بعناية رقاقة في الخلية الكهربائي من جهاز الخلية الغربية خلية واحدة، هلام الجانب التي تواجه. توخي الحذر من الإضرار الجانب هلام من رقاقة.
  10. صب الليساس / تشغيل العازلة في الغرفة وتغطي تماما كامل رقاقة الخلية الغربية واحدة. بدء تشغيل الlysis الخلية.
  11. تشغيل أداة scWB باستخدام الإعداد المدرج في 5.8.
  12. بمجرد الانتهاء من تشغيل، نقل رقاقة إلى طبق بيتري 10 سم وغسل رقاقة مرتين مع 1X الغسيل العازلة لمدة 10 دقيقة في RT.
  13. إعداد تمييع الأجسام المضادة الأولية (المضادة للفينكولين: 1:10؛ المضادة CD45: 1:15، المضادة CD11b: 1:20، المضادة لF4/80: 1:10) في حجم إجمالي 80 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة (مزيج 8 ميكرولتر من الأجسام المضادة 1 زائد 8 ميكرولتر من الأجسام المضادة 2 بالإضافة إلى 64 ميكرولتر من مخفف).
  14. إضافة 80 درجة مئوية من الحل الأساسي للجسم المضاد إلى غرفة فحص الأجسام المضادة وخفض رقاقة هلام الجانب إلى أسفل بحيث الحل الأجسام المضادة الفتيل عبر رقاقة.
  15. احتضان مع الحل الأساسي للجسم المضاد لمدة 2 ساعة في RT.
  16. غسل رقاقة ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في 1X الغسيل العازلة على شاكر.
  17. غسل رقاقة مرة واحدة لمدة 10 دقيقة في الماء على شاكر لإزالة الملح هلام.
  18. إعداد تخفيف 1:20 من الأجسام المضادة الثانوية في حجم إجمالي من 80 درجة مئوية (مزيج 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى 78 ميكرولتر من مخفف).
  19. احتضان رقاقة مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT محمية من الضوء.
  20. غسل رقاقة ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع 1X العازلة الغسيل على شاكر.
  21. تدور رقاقة باستخدام الدوار الشريحة لإزالة أي المخزن المؤقت الغسيل المتبقية.
  22. مسح رقاقة على الماسح الضوئي microarray الليزر المزدوج في 5 درجة مئوية القرار في القناة الطيفية للفلوروفور إلى جانب الأجسام المضادة الثانوية.
  23. تحليل البيانات باستخدام برامج خاصة بـ scWB.

6. تجريد رقاقة scWB

  1. تخزين رقاقة ممسوحة ضوئيا في العازلة غسل حتى على استعداد لتجريد.
  2. وضع حمام الماء في غطاء الدخان.
  3. وضع رف أنبوب 50 مل في حمام المياه مع الماء فقط 1 سم فوق الرف وتعيين درجة حرارة المياه في 60 درجة مئوية.
  4. إعداد المخزن المؤقت تجريد. ل1 لتر من تجريد الحل العازلة، حل 9.85 غرام من تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8) و 20 غرام من SDS في 900 مل من الماء المقطر وضبط درجة الحموضة. ثم املأ بالماء المقطر إلى 1L. إضافة 0.8٪ (v/v) من β-mercaptoethanol (β-ME; 14.3 M) مباشرة قبل كل استخدام.
  5. بعد الفحص الأولي، ضع الرقاقة في طبق بيتري 10 سم قبل تجريده.
  6. لكل رقاقة، واتخاذ 40 مل من تجريد العازلة وإضافة 320 ميكرولتر من β-ME.
    تحذير: β-ME سامة وخطرة على الإنسان والبيئة. يجب أن يتم الإجراء التالي في غطاء الدخان.
  7. ضع الرقاقة في العلبة وأغلق العبوة ببارافيلم لمنع تسرب المياه إلى العبوة.
  8. ضع العلبة داخل رف الأنبوب في حمام الماء المُسخّن مسبقاً.
  9. حضانة لمدة 90 دقيقة.
  10. إزالة رقاقة بعناية من العلبة ووضعها في طبق بيتري الطازجة.
  11. غسل لفترة وجيزة رقاقة مرة واحدة مع 1X غسل العازلة. ثم إضافة 15 مل من 1X الغسيل العازلة إلى طبق بيتري.
  12. اغسل الرقاقة لمدة 15 دقيقة على الهزاز. كرر خطوة الغسيل أربع مرات.
    ملاحظة: رقاقة جاهزة للجسم المضاد الأساسي التالي (انظر الخطوات 5.12 -5.21).

Representative Results

للوصول إلى استجابة خلايا الدم إلى المواد الكيميائية، قمنا بحقن مركبة محملة وMCP-1 تحميل الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الحل في الجناحين الأيسر والأيمن من كل فأر. تمت إزالة المقابس هلام المستمدة من غشاء الطابق السفلي 1, 3 و 5 أيام بعد الحقن, حل والخلايا التي تم تجنيدها في كل المكونات تم عد (الشكل1A). عن طريق طرح عدد الخلايا في المكونات المحملة بالمركبات (القضبان المفتوحة) من عدد الخلايا في قابس MCP-1 المحملة (القضبان المغلقة)، حصلنا على عدد الخلايا التي تم تجنيدها على وجه التحديد استجابة لMCP-1 (Δ رقم الخلية، الشكل 1B). وقد لاحظنا تسارعا ً في توظيف وتراكم الخلايا على مدى فترة الخمسة أيام، مع زيادة المعدلات من 000 31 خلية في اليوم (اليوم 1) إلى 000 78 خلية في اليوم (اليوم 3) و000 136 خلية/يوم في اليوم 5 (الشكل1باء).

لتحديد أنواع الخلايا التي دخلت المقابس هلام الغشاء المستمدة من الطابق السفلي، وضعنا الخلايا المعزولة من كل المكونات إلى خلية واحدة تحليل وصمة عار الغربية (scWB)، والتحقيق في CD45، CD11b و F4/80 التعبير لتحديد الخلايا الأحادية (CD11b+F4/80 -)، الضامة (CD11b+F4/80+ زائد CD11b-F4/80+) والكريات البيض غير أحادية (CD45+CD11b-F4/80-) (الشكل 2). ثم تم فحص رقائق scWB لvinculin لتحديد أرقام الخلايا الإجمالية على كل هلام وتأكيد شغل خلية واحدة من microwells على رقاقة scWB. كانت النسبة المئوية للخلايا الأحادية داخل المقابس هلامية من نوع MCP-1 المحملة بالغشاء السفلي منخفضة في اليوم الأول، 20%، وبلغت ذروتها في اليوم الثالث عند 47%، على التوالي قبل أن تنخفض إلى 14% في اليوم 5 (الشكل2D). زيادة أعداد الضامة داخل MCP-1 المحملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من هلام المقابس بشكل مطرد من 13٪ في اليوم 1، إلى 22٪ في اليوم 3 و 23٪ في اليوم 5. بالنسبة للسدادات المحملة MCP-1، كانت النسبة المئوية للخلايا الأحادية بالإضافة إلى الضامة داخل مجموعة الخلايا المعزولة أعلى في اليوم 3، و31% في المقابس المحملة بالمركبات (الشكل3A)و58% في المقابس المحملة MCP-1 (الشكل3B)،مما يشير إلى أنه بعد 3 أيام الغالبية العظمى من الخلايا التي تم تجنيدها من قبل MCP-1 تعتمد chemotaxis هي الخلايا الأحادية والضامة. على الرغم من أن العدد الإجمالي للخلايا الأحادية بالإضافة إلى الضامة كان أعلى في اليوم 5 مقارنة باليوم 3 (الشكل3C وD)، ويرجع ذلك إلى نسبة أعلى بكثير من الخلايا الأحادية والضامة في مجموع سكان الخلايا (الشكل3A وB)،وعدد الخلايا في اليوم 3 أكثر دقة يعكس العلاج الكيميائي للخلايا الدموية والتوظيف. لذلك، نحن، حقن بشكل روتيني الحل السفلي الغشاء المستمدة قبل ثلاثة أيام من التضحية الحيوانات. لم يتم تحديد ما إذا كانت جميع الضامة التي تم تجنيدها من قبل MCP-1 هي الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية أو المقيمة التي تم توظيفها من الأنسجة المجاورة التي ساهمت.

Figure 1
الشكل 1 : تكميم الخلايا التي تم تجنيدها في الطابق السفلي تحت الجلد المقابس هلام المستمدة من الغشاء. (أ) أرقام الخلايا المطلقة للمركبات المحملة (القضبان المفتوحة) وMCP-1 المحملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام (القضبان المغلقة). (ب) عدد الخلايا التي تم توظيفها في المقابس هلامية مشتقة من الغشاء في الطابق السفلي بواسطة MCP-1 محسوبة كالفرق في أرقام الخلايا بين MCP-1 المحملة والمقابس المحملة بالمركبات. وتظهر النتائج على أنها يعني ± SD (n = 4) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 2
الشكل 2 : تحليل مجموعات الخلايا التي تم تجنيدها في الطابق السفلي المقابس هلام المستمدة من الغشاء عن طريق تحليل وصمة عار خلية واحدة الغربية. (ألف+باء) تظهر أمثلة تمثيلية لتحليل scWB للمركبةالمحملة (التحكم) وقابس MCP-1 الرصاص(MCP-1)معزولة عن الماوس بعد ثلاثة أيام من الحقن. رقائق تحمل علامات على الأجسام المضادة الموجهة ضد CD45 وCD11b وF4/80 متبوعة بأجسام مضادة ثانوية فلورية كما هو موضح في البروتوكول. وتظهر كثافة الفلورة للنطاق المسمى لكل خلية على حدة كمنطقة ذروة. (C+D) تم تحديد مجموعات الخلايا على أنها خلايا أحادية (CD11b Image 1 +F4/80-، ، الضامة (CD11b+F4/80+ زائد CD11b-F4/80+، Image 2 ) أو ككريات بويleukocytes غير أحادية (CD45+ , Image 3). ووصفت الخلايا المتبقية "أخرى" ( ).Image 4 وتظهر النتائج على أنها متوسط ± SD (n = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 3
الشكل 3 : محتوى الخلايا الأحادية والضامة من المقابس هلام الغشاء المستمدة من الطابق السفلي. تحليل كمي لمحتوى الخلايا الأحادية والضامة في المقابس المحملة بالمركبات وMCP-1 المحملة التي تمت إزالتها في اليوم 1 و 3 و 5 بعد الحقن. تظهر القيم كنسبة مئوية من إجمالي عدد الخلايا (A+B) وفي أرقام الخلايا المطلقة لكل قابس (C+D). وتظهر النتائج على أنها متوسط ± SD (n = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Discussion

قمنا بتطوير اختبار chemotaxis في الجسم الحي، والاستفادة من الخصائص الفيزيائية الفريدة للمصفوفة المستمدة من الغشاء الطابق السفلي والقدرة على تحميل هذه المصفوفة الفريدة مع chemokines وحقنه في الفئران. يسمح لنا الفحص بتقييم استجابة الخلايا الأحادية (والضامة) إلى الكيماويات في الفئران الحية (والضامة) إلى الكيماويات، كما هو موضح هنا بالنسبة MCP-1، وآثار التلاعب الوراثي أو التعرض الدوائي والغذائي وغير ذلك من التعرض البيئي على الخلايا الأحادية العلاج الكيميائي. لأن التدرج الكيميائي الذي نخلقه في هذه الفئران لا يتأثر أساسا بالتعرض الوراثي أو الدوائي أو الغذائي أو البيئي، فإن التغيرات في النشاط الكيميائي الأحادي تعكس في الواقع التغيرات الوظيفية في هذه الخلايا الأحادية، وكما أظهرنا سابقا، أيضا إعادة برمجة على حد سواء على مستوى البروتين والنسخ17،20. أبلغنا أن الإجهاد الأيضي في الفئران يزيد من استجابة الخلايا الأحادية للجاذبية الكيميائية وأن هذا النشاط الكيميائي المفرط يرتبط مع زيادة البروتين S-glutathionylation، عكسها، ردوإكس تعتمد على ما بعد الترجمة تعديل البروتين، مما يؤدي في معظم الحالات إلى فقدان وظيفة الأنزيمية والبروتين21،22، وفي بعض الحالات حتى يعزز تدهور البروتين16،23.

لتنفيذ هذا الإجراء بنجاح والحصول على النتائج المثلى مع هذا القول من الأهمية بمكان أن يتم حقن كميات دقيقة من الحل المستمدة من غشاء الطابق السفلي ببطء لخلق المكونات فريدة من نوعها شكلت بشكل جيد وينبغي إزالة كبسولات ليفية تماما للحصول على المقابس نظيفة عند حصاد الطابق السفلي المقابس هلام المستمدة من الغشاء، ويسهل حل المكونات بأكملها في حل dispase. تظهر بياناتنا أن ترك المكونات في الحيوانات لمدة ثلاثة أيام يحسن 1) كثافة الإشارة، أي عدد الخلايا الأحادية والضامة التي تم تجنيدها في كل قابس، 2) انتقائية الإشارة، أي محتوى الخلايا الأحادية والضامة داخل مجموع مجموعات الخلايا و 3) خصوصية الإشارة، أي الزيادة في الخلايا الأحادية والضامة استجابة لMCP-1 مقارنة مع السيارة. وأخيرا، نبين كيف يمكن استخدام أحدث المناهج القائمة على خلية واحدة جنبا إلى جنب مع مسح المكونات هلام المستمدة من غشاء الطابق السفلي لتوصيف الخلايا الأحادية التي تم تجنيدها في المقابس وبالتالي الحصول على لقطة من النمط الظاهري المحتمل لل الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية التي يتم تجنيدها في مواقع الإصابة في أي نموذج ماوس معين استجابة لتدخلات وراثية أو دوائية أو غذائية أو بيئية محددة.

وهناك عدد من القيود على التبيّن الذي يتعين النظر فيه. أولا، التعامل مع الماوس، بما في ذلك التخدير، وحقن الحل السفلي الغشاء المستمدة، وتشريح الجراحية يتطلب ممارسة لتوليد المقابس واحدة والبيانات القابلة للاستنساخ. ثانيا، في حين أن معظم الخلايا التي تم تجنيدها في المقابس المحملة MCP-1 هي الخلايا الأحادية والضامة، وعدد كبير ليست كذلك. وقد يؤثر ذلك على تفسير الاختبارات التحليلية الأخرى غير القائمة على خلية واحدة التي أجريت على هذه الخلايا. وأخيراً، بما أن ظروف تحليل الخلايا لـ scWB خفيفة، فقد تختلف مسافات الهجرة من البروتينات عن البنك الدولي القياسي وقد لا ترتبط بحجم البروتين. لذلك، كل من تحليل الخلية وأوقات التشغيل يجب التحقق من صحة لكل بروتين جديد ليتم اختباره واستخدام كل الأجسام المضادة الأساسية.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا المشروع بمنح إلى R.A. من المعاهد الوطنية للصحة (AT006885).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm petri dish griner bio-one 664 160
10x suspension buffer proteinsimple R101
15 cm petri dish Falcon 353025
2-Mercaptoethanol MP BIOMEDICALS 2194705
5% washing buffer proteinsimple R252
Antibody diluent proteinsimple 042-203
Bench Top Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Centrifuge
Bovine Serim Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Calcein AM ThermoFisher C3099 1 mL
CD11b Novus Biologicals NB110-89474
CD45 (D4H7K) rabbit mAb Cell Signal Technologies 727987S
CD68/SR-D1 (FA-11) Novus Biologicals NBP2-33337SS
Cellometer Vision Nexcelom
Dispase BD 354235 100 mL
Dissecting sissor
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] Novus Biologicals NL004 NL 557 conjugate
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] Novus Biologicals NBP1-75655 DyLight 650 conjugate
F4/80 (CI-A3-1) Novus Biologicals NB600-404SS
Heat Block effendorf 22331 Thermomixer
Lysis/Running buffer proteinsimple R200
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) BD 354230 10 ml
Microarray scanner PerkinElmer ScanArray Gx
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
Microscope ThermoFisher Evos fl
Milo proteinsimple Single cell western
Needle BD 305111 26 G
Parafilm
Probing chamber proteinsimple 035-020
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein R&D 479-JE-050
scWEST chip proteinsimple C300
Shaker Bioexpress Gene mate orbital shaker
Single cell western chip canister proteinsimple 035-118
Slide spinner Labnet C1303-T
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP 166-500
Syringe BD 309602 1 mL
Tris-Hydrochloride Fisher Scientific BP 153-500
Tweezer proteinsimple 035-020
Water bath ThermoFisher

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, K. J., Tabas, I. Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis. Cell. 145 (3), 341-355 (2011).
  2. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  3. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  4. Akiyama, T., et al. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).
  5. Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction. Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).
  6. Gosling, J., et al. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).
  7. Fantuzzi, L., et al. Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response. Blood. 94 (3), 875-883 (1999).
  8. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).
  9. Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).
  10. Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
  11. Davies, M. J., et al. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis. Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).
  12. Anderson, T. J., et al. The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments). New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).
  13. Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair. Frontiers in Immunology. 2, (2011).
  14. Qiao, M., et al. Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).
  15. Ullevig, S., et al. NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).
  16. Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).
  17. Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis. Scientific Reports. 6, 34223 (2016).
  18. Ponce, M. L. Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay. Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).
  19. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).
  20. Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).
  21. Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).
  22. Tavakoli, S., Asmis, R. Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis. Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).
  23. Ullevig, S. L., et al. Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 150 Matrigel MCP-1 Monocyte Macrophage لطخة أحادية الخلية الغربية نماذج الماوس تصلب الشرايين
تحديد كمية النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الجسم الحي وتوصيف الضامة المشتقة من خلايا الدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, Y. J., Wang, L., Asmis, R.… More

Ahn, Y. J., Wang, L., Asmis, R. Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (150), e59706, doi:10.3791/59706 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter