Summary
In vitro-cell invasion analysen används för att mäta potentialen av cancermetastaser genom att kvantifiera den cellulära potentialen för invasion och migration med hjälp av cellkultur infogar som innehåller protein Matrix. Celler utmanas att migrera genom proteinet matrisen och ett poröst membran, mot en Chemoattractant, och sedan kvantifieras av ljus mikroskopi.
Abstract
In vitro-invasions analysen använder en proteinrik matris i en Boyden-kammare för att mäta förmågan hos odlade celler att passera genom matrisen och ett poröst membran i en process som motsvarar de initiala stegen av cancercellmetastaser. De testade cellerna kan ändras för genuttrycket eller behandlas med hämmare för att testa för förändringar i invasions potentialen. Detta experiment testar den aggressiva fenotypen av mus brösttumör celler att upptäcka och karakterisera de potentiella onkogener som främjar cell invasion. Denna teknik kan dock vara mångsidig och anpassad till många olika tillämpningar. Experimentet i sig kan göras på en dag och resultaten förvärvas av ljusmikroskopi på mindre än en dag. Resultaten omfattar antalet invaderande celler för jämförelse och analys. In vitro-invasions analysen är en snabb, billig och entydig metod för att bestämma cellens beteende i en kultur som kan användas som en första bedömning innan mer involverade i vivo-analyser.
Introduction
In vitro-invasions analysen kan vara ett användbart verktyg vid mätning av en cells förmåga att migrera genom ett proteinbelagt membran, analogt med de första stegen i metastaser. En viktig egenskap hos maligna cancerceller är deras förmåga att migrera genom och invadera närliggande vävnader. Cancer som har spridit sig eller metastaserat innebär mer behandling utmaningar och har lägre priser på långsiktig överlevnad, medan lokaliserade tumörer är lättare att behandla och har högre priser på långsiktig överlevnad. För att metastasera, cancerceller måste lämna den primära tumören och migrera in i cirkulations-eller lymfsystemet, en process som kräver passerar genom den extracellulära matrisen och basalmembranet1. I den process som kallas epitelial mesenkymala övergången (EMT), tumörcellerna måste bryta cell-Cellkontakter, migrera directionally, och invadera närliggande blod-eller lymfkärlen. De första stegen i denna metastaser kaskad är av stort intresse eftersom dessa steg är vad som kan göra cancer dödligare. De genetiska och epigenetiska faktorer som är involverade i de tidiga stegen av metastaser är i fokus för en stor mängd forskning, men noggranna och pålitliga experimentella verktyg behövs för att testa dessa tidiga steg både in vivo och in vitro.
Verktyg för att mäta förändringar i cell migration såsom sårläkning (scratch) analyser eller tillväxt i 3D-miljöer såsom Soft agar analyser kan delvis ta itu med behovet av experimentella metoder för att mäta tidiga steg av metastaser, men ett test för att mäta invasionen är mer utmanande eftersom processen sker i kroppen inom en komplex tumör mikromiljö. Vid screening av läkemedel eller genförändringar för att fastställa viktiga faktorer vid invasion och metastaser är ett system som kan användas in vitro med odlade celler och som imiterar de utmaningar som metastatiska celler utsätts för in vivo invasions analysen2, 3. Bröstcancer är den vanligaste diagnosen typ av cancer hos kvinnor och den näst vanligaste orsaken till cancer död hos kvinnor, så förstå de gener som ansvarar för bröstcancer cell invasion och metastaser är av avgörande betydelse för folkhälsan. Dessutom, musceller är ett användbart modellsystem för att studera bröstcancer och dess progression.
In vitro-invasions analysen är baserad på Boyden kammar församlingen där två kammare av tillväxtmedia skiljs åt av ett poröst membran3. För att efterlikna tumören mikromiljö, en proteinrik Gel ingår också att separera celler i en kammare från en Chemoattractant i den andra och fungera som en basalmembran barriär. För att migrera mot Chemoattractant, celler måste först passera genom den proteinrika barriären sedan passera genom det porösa membranet-en process som motsvarar hur metastatiska celler migrerar genom stroma. Den proteinrika gelen kan ändras baserat på experimentets behov, men består vanligtvis av kollagen, eller basalmembran extrakt (t. ex. Matrigel)4. Det är en komplex blandning av proteiner, proteoglykaner och tillväxtfaktorer, men mestadels består av lamininer och kollagen IV 4,5. Cellerna måste sedan passera genom ett poröst membran typiskt tillverkade av polykarbonat, polyester, eller polytetrafluoreten (PTFE). Membran kan köpas kommersiellt med eller utan en protein gel (typiskt kollagener), eller gelen kan köpas separat och tillsättas. Porstorleken kan justeras baserat på cellstorleken. Medan porstorlekar finns tillgängliga från 0,4-8,0 μm, är endast porer från 3,0-8,0 μm tillräckligt stora för cell migration. Invasionen analysen har använts för att bestämma effektiviteten av hämmare på förmågan hos celler att migrera och invadera. Samtidigt saknar den exakta tumör mikromiljö som finns i vivo, in vitro-invasion analysen är fördelaktigt att screening många villkor på kort tid och samtidigt minimera behovet av djurmodeller. Målet med dessa experiment är att jämföra genuttryck för misstänkta onkogener och bestämma effekterna på cancercellens beteende och sjukdoms aggressivitet med hjälp av in vitro-invasions analysen och andra tester. Sammantaget ger invasions analysen konsekventa, kvantitativa och snabba resultat för bestämning av metastatisk potential samtidigt som den är en relativt billig, okomplicerad och anpassningsbar metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment och metoder utfördes som godkänts av Villa Nova University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. genuttryck i odlade mus mammary tumörceller
- Förbered först de cellinjer som ska testas.
-
Använd en häcknings koloni av BALB/cV-möss. Dessa möss bär Balb/CV stam av mus brösttumör virus, överförs till valpar i mjölk6,7. 50 procent av avelshonor utvecklar brösttumörer med 10 månaders ålder.
- För att upprätta en tumör cellinjer, offra en tumör-bärande dammen med ett IACUC-godkända protokoll. Blötlägg buk huden i 70% EtOH och ta bort tumören under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Tumörer är subkutan, så var noga med att undvika punktera peritoneum.
- Placera tumörfragment från icke-nekrotiska områden i en petriskål med en liten mängd sterila Hanks balanserad saltlösning (HBSS) och finhacka mycket fint med en steril rakblad.
- Överför dispergerade cell klumpar till en T25 cellkultur kolv innehållande 5 mL Dulbecco modifierade Eagle medium eller DMEM (4,5 g/L glukos, fenol röd och L-glutamin) kompletteras med 50% foster bovint serum eller FBS och 1% antibiotika/antimykotisk lösning. Odla celler i behandlade cell odlingsflaskor i en inkubator med 5% CO2 och 100% luftfuktighet vid 37 ° c.
- Tvätta bort icke-adherenta celler efter 24-48 h och ersätt DMEM med 50% FBS och 1% antibiotika/antimykotisk lösning. Returnera cellerna till inkubatorn.
- Byt ut flytande odlingsmedier var tredje dag.
- Dela eller passage cellerna när de är 90% confluent. Ta bort odlingsmedier och tvätta anhängare celler med HBSS (utan kalcium eller magnesium). Inkubera celler med 0,25% trypsin-EDTA lösning för 1-5 min vid 37 ° c tills cellerna är rundade och lossnar. Späd ut cellerna 1:10 i friska odlingsmedier och tillsätt i en ny kolv. En T-25 cell odlings kolv kräver 5-8 mL odlingsmedium, 5 mL HBSS att tvätta och 1 mL trypsin-EDTA till passage. Returnera kolven till inkubatorn.
- Minska FBS koncentrationen till 40% efter den första passagen, sedan 30% efter den andra passagen, sedan 20% efter den tredje passagen, och slutligen 10% för alla efterföljande passager. Processen för att etablera tillväxt i standard DMEM medium med 10% FBS kräver fyra passager och 2-8 månader.
-
När cellinjer har upprättats, ändra uttrycket av misstänkta onkogener genom transfektion av shRNA inriktning mRNA eller CRISPR för icke-väsentliga gener.
- Etablera antibiotikaresistenta stabila cellinjer med enskilda kloner som verifieras av Western blot och/eller RT-qPCR för konsekventa resultat, men övergående transfektioner kan fungera lika bra eftersom analysen endast kräver 22 h. Kontrollera cellinjer med icke-specifika målsekvenser krävs också.
2. in vitro-invasions analys
- Odla anhängare mus brösttumör celler i en T25 kolv tills 70-90% konfluenta för dag 1 av experimentet.
Anmärkning: Andra cellinjer eller experimentella förhållanden kan kräva olika cell odlingsmedier. Till exempel, om hormon-lyhörd bröstcancerceller testas, kol-filtrerat serum kan behövas för att avlägsna föreningar som aktiverar östrogen eller andra hormonreceptorer. - Förbered Boyden kammaren infogar genom att värma dem till rumstemperatur (från-20 ° c lagring) för ca 20 min i en cellkultur huva. Undvik frys-Thaw cykler för oanvända skär. Använd tre infogar (replikat) för att generera statistiskt giltiga data för varje cell linje för varje experiment.
- Lägg till pre-warmed 37 ° c serum fria DMEM-media till brunnen och sedan skäret. För skär avsedda för 24-bra rätter, tillsätt 500 μL serumfritt DMEM till brunnen och sedan 500 μL av serumfritt DMEM till skäret så att det porösa membranet och gelen är hydrerade på båda sidor.
Anmärkning: För större skär avsedda för en 6-bra maträtt, Använd 2 mL serumfritt DMEM på båda sidor.
- Lägg till pre-warmed 37 ° c serum fria DMEM-media till brunnen och sedan skäret. För skär avsedda för 24-bra rätter, tillsätt 500 μL serumfritt DMEM till brunnen och sedan 500 μL av serumfritt DMEM till skäret så att det porösa membranet och gelen är hydrerade på båda sidor.
- Placera skålen med skär i en 37 ° c cellkultur inkubator med 5% CO2 och 100% luftfuktighet för minst 2 h att grundligt hydrera och acclimate.
- Förbered cellerna genom att ta bort tillväxt mediet och skölja cellerna med 5 mL HBSS.
- Ta bort HBSS och tillsätt 1 mL 0,25% trypsin-EDTA-lösning för 1-5 min vid 37 ° c eller tills cellerna är avrundade eller uppvisar tecken på avlossning från kolven.
- Knacka försiktigt på kolven för att lossa alla celler. Omsuspendera cellerna i 5 mL DMEM + 10% FBS och överför till ett sterilt 15 mL centrifugeringsrör.
- Centrifugera cellerna vid 1 000 x g i 5 min för att försiktigt pelleten cellerna. Ta bort mediet och Ersätt med 5 mL serumfritt DMEM för att Omsuspendera cellerna.
- Upprepa centrifugering och suspension i serum fria medier två gånger för totalt 3 tvättar.
- Grundligt Omsuspendera cellerna i den slutliga 5 mL av serum fria DMEM och se till att det inte finns några klumpar av celler.
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer. Räkna endast livskraftiga celler. Späd ut cellsuspensionen till 5 x 104 celler/ml i 5 ml SERUMFRITT DMEM.
Anmärkning: Denna koncentration ger 2 500 celler per insats i en 24-bra maträtt. Detta antal celler är tillräckligt för aggressiva cancerceller med hög migration och invasion. Mindre aggressiva cellinjer kan kräva fler celler, upp till 10 000 celler per skär för observerbara invaderande celler. Om minskad cell invasion förväntas, Överväg att maximera invaderande celler genom att öka cell nummer. Om ökad cell invasion förväntas, börja med färre celler. - Ta bort cellkultur skålen från inkubatorn och aspirera försiktigt mediet från skäret. Lyft insatsen och aspirera media från brunnen. Arbeta snabbt, tillsätt Chemoattractant till nedre kammaren. För en 24-väl skålen, tillsätt 750 μL av DMEM med 5% FBS.
- Placera skäret i brunnen och tillsätt cellerna till skäret. För en 24-bra maträtt, Använd 500 μL cellsuspension. För en 6-väl skålen Infoga, använda 2,5 mL av chemoattract och 2 mL celler. Se till att inga luftbubblor finns på endera sidan av membranet.
- Returnera skålen till cellkulturen inkubator för 22 h.
- Efter 22 h, fixera och färga cellerna. Bered en lösning på 1% PARAFORMALDEHYD i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för fixering.
- I en ren 24-brunn cellkultur skålen, tillsätt 1 mL fixativ till enskilda brunnar så det finns en väl för varje skär.
- Förbered färgningslösningen (nytillverkad) av 0,1% Crystal Violet (w/v) i en lösning av PBS med 10% etanol (v/v). Likaså, tillsätt 1 mL Färgnings lösning till en ren brunn i en 24-brunn kultur skålen för varje skär.
- Ta bort varje skär en i taget med tång och placera en steril bomullstuss inuti skäret och Svabb den övre sidan av membranet för att ta bort icke migrerade celler.
- Upprepa med en andra bomullspinne. Membranet är ganska stark, så mjukt tryck medan badda inte äventyrar integriteten av membranet.
- Ta bort eventuella kvarvarande media från insidan av skäret och tillsätt 750 μL PBS för att tvätta bort lossna celler.
- Ta bort PBS och upprepa tvätten. Placera skäret i en brunn som innehåller fixativ för att fixera de migrerade cellerna på undersidan av membranet. Upprepa för alla skär.
- Fixera skären i 15 min vid rumstemperatur.
- Ta bort skäret efter fixering. Tvätta insatsen igen med 750 μL PBS.
- Placera skäret i brunnen med infärgnings lösningen för att fläcka alla migrerade och fasta celler. Färga cellerna i 15 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: För 6-väl skålen skär, Använd 2 mL fixativ lösning, 2 mL Färgnings lösning, och 2 mL PBS tvätta.
- Använd en bägare med destillerat vatten för att Avfärga skär. Ta bort skär och doppa i destillerat vatten tills vattnet rinner av insatsen är klar.
- Ta bort eventuella överskott vattendroppar och placera skär på ett filterpapper sidewise att lufttorka (vanligtvis över natten).
- Förbered membranet för avbildning genom att märka ett rent glas Mikroskop Slide för varje skär och placera en liten droppe Mikroskop nedsänkning olja i mitten av bilden.
- Lossa membranet från skäret med en skalpell för att skära runt membranets omkrets på insidan av plastinsatsen.
- Ta bort membranet med hjälp av tång och placera på toppen av olje droppe på bilden för att hålla den på plats.
Anmärkning: Membranen är mycket tunna och mycket lätta, så att de lätt kan förloras genom skonsam luftflöde.
3. avbildning och analys
- Eftersom de porösa membranen är tydliga och färgning celler med kristall violett ge dem kontrast, använda ett sammansatt ljusmikroskop för att Visa cellerna. Använd en kamera och/eller programvara för att kvantifiera för många prover, men är inte nödvändigt. Visa celler vid 5x, 10X eller 20x förstoring. För kvantifiering, Använd flera, icke-överlappande bilder vid 10X förstoring. Du kan också räkna alla migrerade celler på membranet vid 10X förstoring.
- Bestäm det totala antalet invaderande celler eller celler per område för alla prover. För varje experiment, utför varje villkor i analysen med tre replikerad infogar och upprepa flera gånger för statistiskt användbara resultat.
- När man jämför olika cellinjer med olika tillväxttakt och migrations grad, gör ett parallellt experiment för att jämföra celler som invaderar genom en proteinmatris och jämför med en Boyden kammare församling utan protein Matrix (endast migrerade celler). Beräkna procent invasion för varje cellinje (antal invaderade celler/Antal migrerade celler x 100%).
Anmärkning: Den här metoden kan hjälpa dig att jämföra invasions frekvensen med migreringshastigheter. Om man jämför olika villkor som tillämpas på samma cellinjer, är beräkningen av invasionen ensam mer relevanta beräkningar. Membranets ytterkant har ibland ett högre antal celler än de centrala områdena och är därför mindre exakt. Om detta inträffar utesluter du dessa celler från kvantifieringen och ser till att alla celler tas bort av en bomullspinne i ett upprepnings experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod för in vitro-invasion genom en protein matris användes för att bedöma de aggressiva fenotyper och onkogena cell beteenden av mus brösttumör celler med förändrat uttryck av zink finger protein ZC3H88. I samband med andra metoder som också undersöker cell migration och tillväxt i 3D-miljöer, det konstaterades att högre nivåer av uttryck av Zc3h8 i tumör cellinjer, eller genom promotor-medierade uttryck från en Plasmid, resulterade i snabba nivåer av cell spridning, snabb migration, tillväxt i 3D-miljöer och ökad invasion i in vitro-invasions analysen8. Omvänt, minskat uttryck av shRNA konstruktioner resulterade i mindre aggressiv spridning, migration, och invasion8. Dessa resultat bekräftades in vivo där högre uttryck av Zc3h8 producerade större tumörer som dök upp snabbt, medan minskat uttryck producerade färre tumörer som var mindre och mindre frekvent8.
För att expandera att detta arbete, Expression plasmider som kan rädda shRNA-medierad knockdown av Zc3h8 uttryck var stabilt transfekterade i mus bröst celler att utvärdera om aggressiv celltillväxt och beteende kan återupprättas i dessa celler. All knockdown och räddning av uttryck har verifierats av Western blot eller RT-qPCR8. En invasions analys användes med 5 000 celler per kammare i en 24-välskål och dokumenterades med fotografier som visas i figur 1 och figur 2. Figur 3 visar resultatet av invasions analysen som visar hur cell invasion minskade på shRNA knockdown av Zc3h8 Expression, men att invasionen räddas när uttrycket räddas. Dessa data visar att invasions analysen kan ge en snabb metod för att testa cellinjer in vitro innan de inleder dyrare och långdragna metoder.
Figur 1: komponenter för invasions analys. (A) Boyden kammare infoga för en 24-och vävnad kultur skålen. Ben 24-och vävnadskultur rätt som används för fixering, färgning och tvättning efter 22 h inkubation med celler. Numren 1, 2 och 3 replikeras av en enda cellrad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: invasions analys flödesschema med tidsskalan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: prov invasion analysresultat av en mus brösttumör celler ändras för uttryck av Zc3h8, som ändrar onkogena fenotyp. (a, B) Celler isolerade från mus brösttumörer var stabilt transfekterade med shRNA inriktning en kontroll sekvens av mRNA eller inriktning Zc3h8 mRNA. (C) senare cellinjer räddades sedan genom att uttrycka rekombinant Zc3h8 utformad för att påverkas av shRNA. Celler färgas med kristall violett och fångas på 10X förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop. Skalstapel = 500 μm.Dkvantifiering som visar att minskat uttryck av Zc3h8 minskat antalet invaderande celler och potentialen för metastaser. Räddning av genuttryck räddar högre frekvenser av cell invasion. Värden representerar det totala antalet invaderande celler från en 24-brunn invasion assay INSERT. För varje replikat i experimentet beräknades det genomsnittliga antalet invaderande celler. Detta upprepades för tre experiment. Felstaplar indikerar standardfel för medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-invasionen analysen är en billig, snabb, kvantitativ och enkel metod för att studera de faktorer som främjar cancer cell invasion. Bröstcancer är den vanligaste diagnosen cancer bland kvinnor. Av de tre stora subtyperna av bröstcancer, Triple Negative, (eller ER-, PR-, HER2/Neu-), är den mest aggressiva, mest sannolikt att metastasize, och mest dödliga9. Därför, förstå de gener och uttryck som leder till metastaser kan hjälpa till att hitta nya terapeutiska mål och genetiska markörer för sjukdomen. Medan många av de gener som är viktiga för cancer cell invasion och metastaser har identifierats och karakteriserats, uttrycks nivåer och aktivitet av metastaser förare kontra metastaser suppressorer kan vara en kritisk aspekt av sjukdomsprogression9, 10.
Utöver genuttryck, har in vitro-invasions analysen också använts för att studera rollen av mikroRNA och andra tillsynsmyndigheter i antingen främja eller förhindra cancer cell invasion11,12. In vitro-invasions inställningsmetod kan användas för studiet av hämmare, multi-celltyp tumör miljöer, CRISPR-redigerade celler, eller kortsiktiga förändringar i cellulära tillväxt miljöer. Mångsidigheten och anpassningsförmågan gör denna analys mycket fördelaktigt.
Invasions analysen kan användas i ett första steg i analysen av gener och faktorer som bidrar till eller förebygger tumörprogression. Till exempel, Yan et al. (2010) använde in vitro-invasionen analyser för att definiera rollen av GATA-3 i undertrycka EMT av den mycket aggressiva bröstcancer cellinjer MDA-MB 23113. De kunde sedan Visa att denna dämpning korrelerade med en minskad förmåga att bilda metastaser i en in vivo-analys13. Potentiella terapeutiska strategier kan initialt kännetecknas av förmågan hos väg hämmare att begränsa invasionen genom Matrigel, även korrelering med effekten av dessa hämmare på tumör bildning i djurmodeller. In vitro-invasions analysen kan användas för mer djupgående analys av kända och potentiella onkogener och samverkande partners. Till exempel kan molekylär dissektion av kända funktionella motiv av en onkoprotein eller snabb analys av mutationer göras med in vitro-invasions analysen som en initial skärm eller bedömning av signifikans. Detta kan ge värdefull insikt i kritiska domäner samt en funktionell förståelse av cellfenotyper på molekylär nivå.
Medan Boyden Chamber invasion analysen har många fördelar, det finns begränsningar. Till exempel, invasionen analysen bara tittar på intravasation, en av de första stegen av metastaser, men inte de senare stegen när cancerceller kolonisera sekundära platser. Därför kan endast en partiell syn på potentialen för metastaser slutföras. Den 22 h längden av analysen, medan flexibel, kan inte utesluta vissa celldelning som kan skeva subtila förändringar i mätningen av invasionen av asynkrona cellpopulationer. Hämmare som mitomycin C kan användas för att förhindra celldelning när det gäller snabbt dykning celler. Slutligen, användningen av 5% FBS lösning för chemotaxis kommer långsamt diffus över tiden och jämvikt mellan både övre och nedre kammare. Tätheten av proteinet gel saktar denna diffusion och presenterar cellerna med möjlighet att migrera sidled över gelen och membranet (haplotaxis) eller genom proteinet matrisen och genom porerna mot högre koncentrationer av FBS (chemotaxis). Alternativa chemotaxis agenter kan ersättas eller kortare tids ersättningar för invasion kan användas för att mäta endast de celler som invaderade före jämvikt. Det är flexibiliteten, inte styvhet, av in vitro-invasions analysen som möjliggör anpassning som gör denna analys så användbar. Framtida anpassningar av denna analys omfattar en storskalig screening av föreningar, förändringar av genuttryck, och bedömning av allelespecifika läkemedels effektivitet. Dessutom kan ett Dual Chamber system med cirkulerande Media utmana celler att invadera genom en protein matris, korsa en flytande miljö, och återupprätta på en andra protein matris på en sekundär plats. Slutligen, en mer utmanande membran kan användas med in vitro-systemet invasions analys som en enskiktslager av icke-invasiva celler som skulle vara svårare för cancerceller att korsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Grant R15CA169978 från National Institutes of Health. Ytterligare finansiering kom från universitetet i Villa Nova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
