剪接体snRNA的生成是一个涉及多种细胞区室的复杂过程。在此，我们采用荧光标记的snRNA显微注射技术，以监测其在细胞内的转运过程。
本文内容
摘要
摘要
剪接体snRNA的生物合成是一个复杂的过程，涉及细胞核和细胞质两个阶段，最后一步发生在一种称为卡哈尔体（Cajal body）的核内结构中。然而，直到最近，指导snRNA定位于该核内结构的序列仍不明确。为了确定对snRNA在卡哈尔体中积累至关重要的序列，我们采用了荧光标记snRNA的显微注射技术，并随后观察其在细胞内的定位情况。首先，我们构建了snRNA的缺失突变体，制备了用于体外转录的DNA模板，并在含有与Alexa488偶联的UTP存在下转录生成snRNA。将标记后的snRNA与TRITC偶联的70 kDa葡聚糖混合，显微注射至人HeLa细胞的细胞核或细胞质中。细胞孵育1小时后固定，通过间接免疫荧光法显示卡哈尔体标志蛋白coilin，而snRNA以及作为核或细胞质注射标志的葡聚糖则直接通过荧光显微镜观察。该方法可高效、快速地检测各种序列对RNA细胞内定位的影响。在此，我们展示了Sm结合序列对于snRNA高效定位于卡哈尔体的重要性。
引言
RNA剪接是基因表达中的关键步骤之一，由一种称为剪接体的大型核糖核蛋白复合物催化完成。在整个剪接过程中，超过150种蛋白质和5种小核RNA（snRNA）会在不同阶段整合到剪接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA参与主要的GU-AG内含子的剪接。这些snRNA以预先形成的核小核糖核蛋白颗粒（snRNP）形式进入剪接体，每个snRNP包含snRNA、与snRNA结合的7种Sm蛋白（或与U6 snRNA结合的类似Sm蛋白）以及1至12种特异于该snRNP的蛋白质。
snRNP的组装包括细胞质和细胞核两个阶段。新转录的snRNA被输出至细胞质，在那里结合由七种Sm蛋白组成的环状结构。该Sm环随后作为信号，介导snRNA重新输入细胞核。未能与Sm蛋白结合的有缺陷snRNA则滞留在细胞质中1。新进入细胞核的snRNP首先出现在卡哈尔体（Cajal body）中，在此处与snRNP特异性蛋白结合并完成成熟过程（详见文献2,3综述）。我们近期研究表明，抑制snRNP最终成熟步骤会导致未成熟snRNP在卡哈尔体中被隔离4,5。我们提出一个模型，即snRNP的最终成熟过程受到质量监控机制的调控，该机制监测snRNP特异性蛋白的正确添加以及功能性snRNP的形成。然而，细胞如何区分正确组装的成熟颗粒与异常的未成熟颗粒，其分子机制仍不清楚。
为了确定snRNA中对snRNA在核内卡哈尔体（Cajal bodies）中靶向定位和富集至关重要的序列，我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射技术。显微注射是首选方法，原因如下：1）该方法无需额外添加序列标签即可区分合成snRNA与其内源性对应物，这对于空间有限、难以插入额外标签序列的短RNA尤为重要；2）该方法可用于分析对snRNA生成过程至关重要的序列。例如，Sm序列对于Sm蛋白环的组装以及snRNP重新进入细胞核至关重要6。当snRNA在细胞内表达时，缺乏Sm序列的snRNA会在细胞质中被降解，无法进入细胞核和卡哈尔体7。然而，缺乏Sm序列的snRNA可直接显微注射至细胞核内，从而可检测Sm序列在snRNA定位于卡哈尔体过程中的潜在作用。
本文详细描述了一种我们曾用于确定snRNA序列以将snRNA靶向定位于卡哈尔体所需的微注射方法5。我们证明，Sm结合位点和SMN结合位点共同存在时，足以将snRNA以及多种短链非编码RNA定位至卡哈尔体。基于微注射实验及其他证据，我们提出，组装在Sm结合位点上的Sm蛋白环结构即为卡哈尔体的定位信号。
方案
1. 用于显微注射的snRNA制备
- 使用以下PCR体系，通过PCR制备包含全长或截短/突变版本snRNA的DNA模板：98 °C，60 秒，98 °℃，15 秒，68 °℃，30 秒；72 ℃ °C，1 分钟，98 °C，15 秒，35 个循环，72 °5 分钟，4 ℃
- 正向引物必须在首个转录核苷酸的上游包含用于体外转录的启动子序列。使用含有T7启动子的正向引物和以最后一个转录核苷酸结尾的反向引物扩增U2 snRNA序列（参见 材料表 详情见上文。
- 使用短链RNA合成试剂盒合成snRNA（参见 材料表 for details) 含 T7 RNA 聚合酶。加入 1 mM ATP、1 mM CTP、1 mM GTP、0.8 mM UTP、0.2 mM UTP-Alexa488、1.8 mM 三甲基鸟苷帽类似物 (m32,2,7G(5’)ppp(5’)G), 1 μL RNA抑制剂和500-700 ng DNA模板加入反应体系中，37℃孵育 ˚C 过夜。
- 加入1 µ加入2U DNase至反应体系中，37℃继续孵育15分钟 ˚C.
- 通过酸性酚/氯仿抽提法分离snRNA。移除上层水相，加入相当于原始体积1/10的3 M醋酸钠（pH = 5.2），3 µL 甘油用于更好地观察沉淀，以及 2.5 倍体积的 100% 乙醇。在 -80 ℃ 下孵育 1 小时 ˚C，以14,000 × g离心10分钟 g 和 4 °C.
- 用70%乙醇洗涤沉淀，并溶于12 µ无核酸酶水 L。通常的RNA产量约为600 ng/μL. 在 -80 ℃ 下保存 °C.
- 通过琼脂糖凝胶电泳监测体外转录snRNA的完整性。
- 显微注射前，将RNA稀释至终浓度200 ng/μL。μL 在含有 10 的水中 µg/µ70 kDa L-葡聚糖-TRITC
2. 细胞
- 使用前，将盖玻片用 1 M HCl 处理 1 小时，然后用蒸馏水彻底清洗，并保存在 100% 乙醇中。酸处理可促进细胞黏附，防止注射过程中或之后细胞脱落。为便于识别已注射的细胞，可使用带网格的盖玻片。
- 在微注射前一天，将 HeLa 细胞或其他贴壁细胞接种于 12 mm 盖玻片（编号 1 或 1.5）上，使微注射时细胞融合度达到 50%。
3. 注射
注意：HeLa 细胞的显微注射在 Dulbecco 改良必需培养基（D-MEM，含 4.5 g/L D-葡萄糖、酚红和抗生素）中进行。注射使用显微注射仪和配备无菌针头的显微操作器完成（详见材料表）。整个显微镜/显微操作器系统需预先加热至 37 °C 并持续至少 4 小时，以防止显微镜和显微注射装置各部件发生温度波动。
- 将含有 2 mL 培养基并置于中央的盖玻片的培养皿（30 mm）放入显微镜的载物台上。使用微量移液器吸取 3 µL snRNA 混合物并注入注射针中。将注射针以相对于培养皿表面 45° 的角度安装到显微注射仪的针夹中。
- 使用 10x 长工作距离物镜寻找针尖。首先，在注射仪上设置速度为粗调，缓慢降低针尖直至接触培养基液面。通过显微镜双目镜观察，找到针尖接触培养基时产生的亮斑位置。
- 将速度切换至微调，继续在显微镜下观察的同时缓慢降低针尖，直至观察到针尖末端。将针尖移至视野中央，切换至 40x 长工作距离物镜。
- 更换物镜后，选择目标细胞，并将针尖移至该细胞上方。设置细胞接触所需的压力和时间（详见讨论部分的提示与故障排除）。
- 将针尖向下插入细胞内，随后在显微操作器上设定下限位置。注意避免将针尖移至细胞下方。
- 设定下限后，将针尖退回细胞上方，按下注射仪操纵杆上的注射按钮。针尖将自动进入细胞并到达预设的限位位置，随后注入 RNA 混合物。
- 操作结束后，按下注射仪上的菜单按钮，从针夹中取出注射针。然后在关闭注射仪和显微操作器之前，断开连接管路。
4. 细胞固定与染色
- 显微注射后，将细胞放回 CO2 培养箱，在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 孵育结束后，在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞三次，用含 0.1 M PIPES（pH 6.9）的 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，再用室温 PBS 洗涤三次。若仅分析 snRNA 定位，则用清水短暂冲洗后，置于含 DAPI 的封片剂中封片。
- 若需同时分析蛋白质定位，则在室温下用含 0.5% Triton-X100 的 PBS 处理细胞 5 分钟进行透化。PBS 冲洗三次后，依次与一抗和二抗孵育，最后用 PBS 洗涤，清水短暂冲洗，再置于含 DAPI 的封片剂中封片。
5. 显微镜观察
- 若贴片后未立即成像，请将载玻片存放于 4 °C 直至成像。
- 使用配备浸油物镜（60X 或 100x/1.4NA）的高端荧光显微系统采集图像。
- 一旦识别到显微注射的细胞，对每个样本以 200 nm 的 z 步长采集 20 个 z 层切片，并进行数学去卷积处理；随后展示最大投影图像或单个 z 层堆栈图像。
- 为定量荧光信号，在coilin免疫染色所识别的Cajal体周围绘制感兴趣区域（ROI），测量coilin定义的ROI内snRNA信号的强度；随后在核质中随机位置设置ROI，测定snRNA荧光强度，并计算Cajal体内与核质中RNA信号的比值。
结果
为了监测snRNA的定位以及Sm结合位点在卡哈尔体靶向中的作用，我们制备了含有T7启动子的DNA模板，该模板包含全长U2 snRNA或缺失形成Sm结合位点的七个核苷酸（AUUUUUG）的U2 snRNA。snRNA通过体外转录生成，经分离后与TRITC标记的70 kDa葡聚糖混合。我们将含有体外转录snRNA的混合物显微注射至HeLa细胞的细胞核或细胞质中。
先前的研究表明，Sm结合位点对于核输入是必需的6。为了检测Sm位点是否在snRNA向卡哈尔体（Cajal body）的富集过程中也起重要作用，我们将缺失Sm位点的snRNA直接显微注射到细胞核内（图1A），而将注射到细胞质中的样本作为对照（图1B）。作为阳性对照，我们显微注射了全长snRNA（图1C、D）。显微注射后，将细胞在CO2培养箱中孵育60分钟，随后固定细胞，并通过间接免疫荧光法对卡哈尔体标志蛋白coilin进行可视化检测。全长snRNA在细胞核和细胞质注射后均能在卡哈尔体中富集。相比之下，缺失Sm位点的snRNA在注射到细胞质后仍滞留在细胞质中，这与先前的研究结果一致6。将缺失Sm位点的snRNA显微注射到细胞核内后发现，Sm结合序列对于snRNA在卡哈尔体中的定位具有重要作用。缺失Sm位点的U2 snRNA虽保留在细胞核内，但未能在卡哈尔体中富集（图1A）。
有时，仅向单一细胞区室的显微注射会失败，导致TRICT-葡聚糖-70kDa同时出现在细胞核和细胞质中（图2A）。这些细胞应从后续分析中剔除。尽管荧光标记的snRNA在注射前保存于-80 °C，但仍可能发生RNA降解。降解后的snRNA注入细胞质后无法转运至细胞核，而是滞留在细胞质中（图2B）。此类snRNA应予弃用，并需重新合成新的snRNA。
图 1：显微注射snRNA的定位。 缺失Sm位点（A、B）或全长（C、D）的Alexa488标记U2 snRNA被显微注射至HeLa细胞的细胞质或细胞核中。 Cajal小体（箭头）通过coilin免疫标记（红色）标识；snRNA以绿色显示。使用Dextran-TRITC-70kDa（黄色）监测核或细胞质注射；DNA用DAPI染色（蓝色）。箭头指示snRNA的细胞质定位。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：显微注射方法的一个潜在缺陷。 （A）向某一区室的显微注射失败，导致WT U2 snRNA被同时注射到细胞质和细胞核中。请注意，Dextran-TRITC-70kDa（黄色）存在于两个细胞区室中。（B）WT U2 snRNA被注射到HeLa细胞的细胞质中（绿色），但大量snRNA仍滞留在细胞质中（箭头所示），表明注射的snRNA发生部分降解，并丢失了Sm结合位点。 Cajal小体（箭头）通过coilin免疫标记（红色）显示。 DNA用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
我们采用荧光标记snRNA的显微注射技术，以确定snRNA定位于核内卡哈尔体的关键序列。由于标记RNA的制备快速且相对简便（通过PCR制备DNA模板，随后进行体外转录），该方法可有效分析不同序列对RNA定位的贡献。在相对较短的时间内，我们已成功分析了U2 snRNA的十种不同的缺失或替换突变（参考文献5及未展示数据）。对于具有复杂生物合成途径的RNA，该方法还可用于检测其成熟所必需的序列。以snRNA为例，若缺失Sm结合序列（该序列是Sm环组装所必需的），会导致突变snRNA在细胞质中被隔离并降解7。另一优势在于，可同时注射两种不同标记的RNA，并在同一细胞内直接比较其定位情况。然而，由于不同荧光染料可能影响RNA的行为，每种荧光染料在双标记实验前均需单独验证。已有研究表明，长度达数百个核苷酸的RNA可成功注射，并在多种模式系统中检测其定位（详见参考文献8的综述）。对于较长RNA，其限制步骤通常在于全长RNA的体外合成。此外，也可注射已预先与蛋白质组装的RNA，以检测单个蛋白质对RNP定位的影响。在我们的研究项目中，我们注射了与Sm蛋白结合的snRNA，以验证Sm环在卡哈尔体定位中的作用5。最后，荧光标记RNA的显微注射可实现直接定量分析，无需额外步骤，此前已有针对snRNA的应用报道9。
在启动显微注射项目之前，还应考虑该方法存在的一些缺点。首先，尽管显微注射过程已实现部分自动化，但该方法仍依赖于操作者的手动技能和经验，研究人员需考虑培训所需的时间。实验方案中的关键步骤包括完整RNA的制备、显微注射以及随后在显微镜下识别已注射的细胞（参见下文“提示与故障排除”）。其次，显微注射对细胞造成显著的应激，许多细胞无法长期存活。尽管已有部分成功案例通过活细胞成像技术追踪细胞内显微注射的RNA10，但我们发现，当将显微注射与荧光显微镜下的活细胞成像结合使用时，细胞死亡率显著升高。第三，注入人细胞中的RNA量非常少，这限制了对注射RNA进行生物化学分析的可能性。这也意味着难以监测荧光标记核苷酸的掺入如何影响RNA的功能。因此，应将不同比例的标记-NTP与未标记NTP掺入野生型RNA中，并检测其定位情况，以确定荧光信号强度与标记RNA功能之间的最佳比例。此外，荧光染料的性质也可能影响RNA的定位。在我们的实验中，Alexa488-UTP的效果明显优于Alexa546-UTP。我们尚未深入探究这些差异的原因，但可能的一个原因是Alexa546的分子尺寸更大且形状不同于Alexa488。
综上所述，RNA显微注射是一种有效的RNA定位方法，但应始终与其他替代方法结合使用。在本研究中，我们成功地将MS2结合位点引入U2 snRNA，利用MS2-YFP监测其定位，并通过MS2系统验证了snRNA显微注射所获得的一些关键结果5。
提示与故障排除
每种细胞系的注射压力、补偿压力和注射时间均需通过实验确定。在细胞质显微注射情况下，我们采用的注射压力（Pi）为170 hPa，补偿压力（Pc）为50 hPa；而在细胞核显微注射情况下，Pi为200 hPa，Pc为80 hPa。两种情况下的注射时间均设置为0.2秒。有时可观察到细胞内物质出现轻微移动，这是注射成功的标志。若细胞破裂，则需降低注射压力。还应通过TRITC荧光通道检查补偿压力。当观察到有强烈液流从针尖涌出时，应降低补偿压力。
每次注射之间，务必检查细胞是否成功注入。通过TRITC荧光通道观察注入的Dextran-TRITC，以识别显微注射的细胞。如果未观察到任何显微注射的细胞，首先应增加注射压力和注射时间。其次，通过荧光通道（TRITC）检查注射针是否堵塞。若可见Dextran-TRITC从针尖微弱流出，则表明注射针功能正常，问题可能出在注射下限的设定上。设定该下限是一个非常关键且棘手的步骤。每个细胞的形态各不相同，因此需要频繁调整下限，以确保显微注射的准确性。
在理想情况下，应在针尖被细胞碎片堵塞前完成约 50 个细胞的显微注射。应定期检查针尖是否有荧光物质流出；如果未观察到德克萨斯红葡聚糖（Dextran-TRITC）从针尖流出，则说明针尖已堵塞。为清除堵塞，可按住注射仪上的 CLEAN 按钮持续 3 秒，以增加压力并尝试清除阻塞物。如果此方法无效，可尝试通过轻触培养皿底部来震断针尖。然而，该操作极为困难，需要大量实践经验，且无法保证成功。因此，对于初学者而言，建议更换注射针。
更换针头前，请按下注射器上的MENU按钮。将针头稍微上移，然后按压显微操作仪上的HOME键。此时针头会完全从培养基中升起，但显微操作仪会记住针头的原始位置，因此您无需重新寻找针头。更换针头后，再次按下HOME按钮，针头将回到原始位置，您应在显微镜下能够看到针尖。更换针头后，必须重新调整限位。然后再次按下注射器上的MENU按钮，针头即完成显微注射的准备工作。
成像过程中，最困难的部分是找到显微注射的细胞。为了定位这些细胞，应使用TRITC通道，因为在此通道下，TRITC标记的70 kDa葡聚糖比显微注射的snRNA产生的微弱Alexa488信号更易观察。使用带网格的盖玻片对此过程很有帮助。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了捷克科学基金会（18-10035S）、国家可持续发展计划I（LO1419）、机构支持（RVO68378050）、欧洲区域发展基金（CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775）以及查理大学资助机构（GAUK 134516）的支持。我们进一步感谢捷克共和国布拉格分子遗传学研究所（IMG CAS）光学显微镜核心设施提供的支持（由捷克生物成像项目资助 - LM2015062）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | 储存浓度 1 mM |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖 | Sigma-Aldrich | D5796 | 含 4.5 g⁄L D-葡萄糖、酚红和抗生素 |
| FemtoJet express 显微注射仪 | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | 显微注射针，内径 0.5 µm，外径 0.7 µm |
| 含 DAPI 的 Fluoromont G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 糖原 | ThermoFisher | AM9510 | 储存浓度 5 mg/mL |
| 带网格的玻璃盖玻片 | Ibidi | 10817 | 带网格的盖玻片，无直接使用经验 |
| InjectMan NI 2 显微操作器 | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G 三甲基化帽类似物 | Jena Bioscience | NU-853-1 | 储存浓度 40 mM |
| MEGAshortscript T7 转录试剂盒 | ThermoFisher | AM1354 | |
| 显微镜盖玻片 12 mm，1 号 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | 用于常规实验 |
| 显微镜盖玻片 12 mm，1.5 号 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | 用于高分辨率成像 |
| DeltaVision 显微镜 | GE Healthcare | 用于图像采集 | |
| DMI6000 显微镜 | Leica | 用于显微注射 | |
| 32% 电镜级甲醛溶液 | EMS | 15714 | 溶于 PIPES，终浓度为 4% |
| 苯酚:氯仿 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| U2 扩增引物：正向：5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, 反向：5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT | Sigma-Aldrich | 斜体部分为 T7 启动子序列 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | 储存浓度 40 mM |
| 异硫氰酸四甲基罗丹明标记的葡聚糖（65–85 kDa） | Sigma-Aldrich | T1162 | 溶于水，储存浓度 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | 溶于水，储存浓度 10% |
参考文献
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重印与许可
