利用显微注射技术分析人源HeLa细胞中剪接体snRNA的定位

摘要

剪接体snRNA的生成是一个涉及多种细胞区室的复杂过程。在此，我们采用荧光标记的snRNA显微注射技术，以监测其在细胞内的转运过程。

摘要

剪接体snRNA的生物合成是一个复杂的过程，涉及细胞核和细胞质两个阶段，最后一步发生在一种称为卡哈尔体（Cajal body）的核内结构中。然而，直到最近，指导snRNA定位于该核内结构的序列仍不明确。为了确定对snRNA在卡哈尔体中积累至关重要的序列，我们采用了荧光标记snRNA的显微注射技术，并随后观察其在细胞内的定位情况。首先，我们构建了snRNA的缺失突变体，制备了用于体外转录的DNA模板，并在含有与Alexa488偶联的UTP存在下转录生成snRNA。将标记后的snRNA与TRITC偶联的70 kDa葡聚糖混合，显微注射至人HeLa细胞的细胞核或细胞质中。细胞孵育1小时后固定，通过间接免疫荧光法显示卡哈尔体标志蛋白coilin，而snRNA以及作为核或细胞质注射标志的葡聚糖则直接通过荧光显微镜观察。该方法可高效、快速地检测各种序列对RNA细胞内定位的影响。在此，我们展示了Sm结合序列对于snRNA高效定位于卡哈尔体的重要性。

引言

RNA剪接是基因表达中的关键步骤之一，由一种称为剪接体的大型核糖核蛋白复合物催化完成。在整个剪接过程中，超过150种蛋白质和5种小核RNA（snRNA）会在不同阶段整合到剪接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA参与主要的GU-AG内含子的剪接。这些snRNA以预先形成的核小核糖核蛋白颗粒（snRNP）形式进入剪接体，每个snRNP包含snRNA、与snRNA结合的7种Sm蛋白（或与U6 snRNA结合的类似Sm蛋白）以及1至12种特异于该snRNP的蛋白质。

snRNP的组装包括细胞质和细胞核两个阶段。新转录的snRNA被输出至细胞质，在那里结合由七种Sm蛋白组成的环状结构。该Sm环随后作为信号，介导snRNA重新输入细胞核。未能与Sm蛋白结合的有缺陷snRNA则滞留在细胞质中¹。新进入细胞核的snRNP首先出现在卡哈尔体（Cajal body）中，在此处与snRNP特异性蛋白结合并完成成熟过程（详见文献^2,3综述）。我们近期研究表明，抑制snRNP最终成熟步骤会导致未成熟snRNP在卡哈尔体中被隔离^4,5。我们提出一个模型，即snRNP的最终成熟过程受到质量监控机制的调控，该机制监测snRNP特异性蛋白的正确添加以及功能性snRNP的形成。然而，细胞如何区分正确组装的成熟颗粒与异常的未成熟颗粒，其分子机制仍不清楚。

为了确定snRNA中对snRNA在核内卡哈尔体（Cajal bodies）中靶向定位和富集至关重要的序列，我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射技术。显微注射是首选方法，原因如下：1）该方法无需额外添加序列标签即可区分合成snRNA与其内源性对应物，这对于空间有限、难以插入额外标签序列的短RNA尤为重要；2）该方法可用于分析对snRNA生成过程至关重要的序列。例如，Sm序列对于Sm蛋白环的组装以及snRNP重新进入细胞核至关重要⁶。当snRNA在细胞内表达时，缺乏Sm序列的snRNA会在细胞质中被降解，无法进入细胞核和卡哈尔体⁷。然而，缺乏Sm序列的snRNA可直接显微注射至细胞核内，从而可检测Sm序列在snRNA定位于卡哈尔体过程中的潜在作用。

本文详细描述了一种我们曾用于确定snRNA序列以将snRNA靶向定位于卡哈尔体所需的微注射方法⁵。我们证明，Sm结合位点和SMN结合位点共同存在时，足以将snRNA以及多种短链非编码RNA定位至卡哈尔体。基于微注射实验及其他证据，我们提出，组装在Sm结合位点上的Sm蛋白环结构即为卡哈尔体的定位信号。

方案

1. 用于显微注射的snRNA制备

1. 使用以下PCR体系，通过PCR制备包含全长或截短/突变版本snRNA的DNA模板：98 °C，60 秒，98 °℃，15 秒，68 °℃，30 秒；72 ℃ °C，1 分钟，98 °C，15 秒，35 个循环，72 °5 分钟，4 ℃
2. 正向引物必须在首个转录核苷酸的上游包含用于体外转录的启动子序列。使用含有T7启动子的正向引物和以最后一个转录核苷酸结尾的反向引物扩增U2 snRNA序列（参见 材料表 详情见上文。
3. 使用短链RNA合成试剂盒合成snRNA（参见 材料表 for details) 含 T7 RNA 聚合酶。加入 1 mM ATP、1 mM CTP、1 mM GTP、0.8 mM UTP、0.2 mM UTP-Alexa488、1.8 mM 三甲基鸟苷帽类似物 (m3^2,2,7G(5’)ppp(5’)G), 1 μL RNA抑制剂和500-700 ng DNA模板加入反应体系中，37℃孵育 ˚C 过夜。
4. 加入1 µ加入2U DNase至反应体系中，37℃继续孵育15分钟 ˚C.
5. 通过酸性酚/氯仿抽提法分离snRNA。移除上层水相，加入相当于原始体积1/10的3 M醋酸钠（pH = 5.2），3 µL 甘油用于更好地观察沉淀，以及 2.5 倍体积的 100% 乙醇。在 -80 ℃ 下孵育 1 小时 ˚C，以14,000 × g离心10分钟 g 和 4 °C.
6. 用70%乙醇洗涤沉淀，并溶于12 µ无核酸酶水 L。通常的RNA产量约为600 ng/μL. 在 -80 ℃ 下保存 °C.
7. 通过琼脂糖凝胶电泳监测体外转录snRNA的完整性。
8. 显微注射前，将RNA稀释至终浓度200 ng/μL。μL 在含有 10 的水中 µg/µ70 kDa L-葡聚糖-TRITC

2. 细胞

1. 使用前，将盖玻片用 1 M HCl 处理 1 小时，然后用蒸馏水彻底清洗，并保存在 100% 乙醇中。酸处理可促进细胞黏附，防止注射过程中或之后细胞脱落。为便于识别已注射的细胞，可使用带网格的盖玻片。
2. 在微注射前一天，将 HeLa 细胞或其他贴壁细胞接种于 12 mm 盖玻片（编号 1 或 1.5）上，使微注射时细胞融合度达到 50%。

3. 注射

注意：HeLa 细胞的显微注射在 Dulbecco 改良必需培养基（D-MEM，含 4.5 g/L D-葡萄糖、酚红和抗生素）中进行。注射使用显微注射仪和配备无菌针头的显微操作器完成（详见材料表）。整个显微镜/显微操作器系统需预先加热至 37 °C 并持续至少 4 小时，以防止显微镜和显微注射装置各部件发生温度波动。

1. 将含有 2 mL 培养基并置于中央的盖玻片的培养皿（30 mm）放入显微镜的载物台上。使用微量移液器吸取 3 µL snRNA 混合物并注入注射针中。将注射针以相对于培养皿表面 45° 的角度安装到显微注射仪的针夹中。
2. 使用 10x 长工作距离物镜寻找针尖。首先，在注射仪上设置速度为粗调，缓慢降低针尖直至接触培养基液面。通过显微镜双目镜观察，找到针尖接触培养基时产生的亮斑位置。
3. 将速度切换至微调，继续在显微镜下观察的同时缓慢降低针尖，直至观察到针尖末端。将针尖移至视野中央，切换至 40x 长工作距离物镜。
4. 更换物镜后，选择目标细胞，并将针尖移至该细胞上方。设置细胞接触所需的压力和时间（详见讨论部分的提示与故障排除）。
5. 将针尖向下插入细胞内，随后在显微操作器上设定下限位置。注意避免将针尖移至细胞下方。
6. 设定下限后，将针尖退回细胞上方，按下注射仪操纵杆上的注射按钮。针尖将自动进入细胞并到达预设的限位位置，随后注入 RNA 混合物。
7. 操作结束后，按下注射仪上的菜单按钮，从针夹中取出注射针。然后在关闭注射仪和显微操作器之前，断开连接管路。

4. 细胞固定与染色

1. 显微注射后，将细胞放回 CO₂ 培养箱，在 37 °C 下孵育 1 小时。
2. 孵育结束后，在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞三次，用含 0.1 M PIPES（pH 6.9）的 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，再用室温 PBS 洗涤三次。若仅分析 snRNA 定位，则用清水短暂冲洗后，置于含 DAPI 的封片剂中封片。
3. 若需同时分析蛋白质定位，则在室温下用含 0.5% Triton-X100 的 PBS 处理细胞 5 分钟进行透化。PBS 冲洗三次后，依次与一抗和二抗孵育，最后用 PBS 洗涤，清水短暂冲洗，再置于含 DAPI 的封片剂中封片。

5. 显微镜观察

1. 若贴片后未立即成像，请将载玻片存放于 4 °C 直至成像。
2. 使用配备浸油物镜（60X 或 100x/1.4NA）的高端荧光显微系统采集图像。
3. 一旦识别到显微注射的细胞，对每个样本以 200 nm 的 z 步长采集 20 个 z 层切片，并进行数学去卷积处理；随后展示最大投影图像或单个 z 层堆栈图像。
4. 为定量荧光信号，在coilin免疫染色所识别的Cajal体周围绘制感兴趣区域（ROI），测量coilin定义的ROI内snRNA信号的强度；随后在核质中随机位置设置ROI，测定snRNA荧光强度，并计算Cajal体内与核质中RNA信号的比值。

结果

为了监测snRNA的定位以及Sm结合位点在卡哈尔体靶向中的作用，我们制备了含有T7启动子的DNA模板，该模板包含全长U2 snRNA或缺失形成Sm结合位点的七个核苷酸（AUUUUUG）的U2 snRNA。snRNA通过体外转录生成，经分离后与TRITC标记的70 kDa葡聚糖混合。我们将含有体外转录snRNA的混合物显微注射至HeLa细胞的细胞核或细胞质中。

先前的研究表明，Sm结合位点对于核输入是必需的⁶。为了检测Sm位点是否在snRNA向卡哈尔体（Cajal body）的富集过程中也起重要作用，我们将缺失Sm位点的snRNA直接显微注射到细胞核内（图1A），而将注射到细胞质中的样本作为对照（图1B）。作为阳性对照，我们显微注射了全长snRNA（图1C、D）。显微注射后，将细胞在CO₂培养箱中孵育60分钟，随后固定细胞，并通过...

讨论

我们采用荧光标记snRNA的显微注射技术，以确定snRNA定位于核内卡哈尔体的关键序列。由于标记RNA的制备快速且相对简便（通过PCR制备DNA模板，随后进行体外转录），该方法可有效分析不同序列对RNA定位的贡献。在相对较短的时间内，我们已成功分析了U2 snRNA的十种不同的缺失或替换突变（参考文献⁵及未展示数据）。对于具有复杂生物合成途径的RNA，该方法还可用于检测其成熟所必需的序列。以snRNA为例，若缺失Sm结合序列（该序列是Sm环组装所必需的），会导致突变snRNA在细胞质中被隔离并降解⁷。另一优势在于，可同时注射两种不同标记的RNA，并在同一细胞内直接比较其定位情况。然而，由于不同荧光染料可能影响RNA的行为，每种荧光染料在双标记实验前均需单独验证。已有研究表明，长度达数百个核苷酸的RNA可成功注射，并在多种模式系统中检测其定位（详见参考文献⁸的综述）。对于较长RNA，其限制步骤通常在于全长RNA的体外合成。此外，也可注射已预先与蛋白质组装的RNA，以检测单个蛋白质对RNP定位的影响...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	储存浓度 1 mM
杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖	Sigma-Aldrich	D5796	含 4.5 g⁄L D-葡萄糖、酚红和抗生素
FemtoJet express 显微注射仪	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	显微注射针，内径 0.5 µm，外径 0.7 µm
含 DAPI 的 Fluoromont G	SouthernBiotech	0100-20
糖原	ThermoFisher	AM9510	储存浓度 5 mg/mL
带网格的玻璃盖玻片	Ibidi	10817	带网格的盖玻片，无直接使用经验
InjectMan NI 2 显微操作器	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G 三甲基化帽类似物	Jena Bioscience	NU-853-1	储存浓度 40 mM
MEGAshortscript T7 转录试剂盒	ThermoFisher	AM1354
显微镜盖玻片 12 mm，1 号	Paul Marienfeld GmbH	111520	用于常规实验
显微镜盖玻片 12 mm，1.5 号	Paul Marienfeld GmbH	117520	用于高分辨率成像
DeltaVision 显微镜	GE Healthcare		用于图像采集
DMI6000 显微镜	Leica		用于显微注射
32% 电镜级甲醛溶液	EMS	15714	溶于 PIPES，终浓度为 4%
苯酚:氯仿 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
U2 扩增引物：正向：5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, 反向：5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		斜体部分为 T7 启动子序列
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	储存浓度 40 mM
异硫氰酸四甲基罗丹明标记的葡聚糖（65–85 kDa）	Sigma-Aldrich	T1162	溶于水，储存浓度 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	溶于水，储存浓度 10%