使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析

Summary

乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。

Abstract

乘子鼻核素的生物发生是一个复杂的过程,涉及核和细胞质阶段,最后一步发生在一个称为Cajal体的核隔间中。然而,将snRNA定位到这种亚核结构的序列直到最近才被发现。为了确定在Cajal体内积累snRNA的重要序列,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,然后在其细胞内进行定位。首先,我们准备了snRNA缺失突变体,合成DNA模板进行体外转录,并在UTP与Alexa488相伴的情况下转录snRNA。标记snRNA与70kDa-Dextran与TRITC结合,并微注入到人类HeLa细胞的细胞质。细胞孵育1小时,固定,Cajal身体标记线圈通过间接免疫荧光可视化,而作为核或细胞质注射标志物的snRNA和dextran直接使用荧光显微镜观察。这种方法可以高效、快速地测试各种序列如何影响细胞内的RNA定位。在这里,我们展示 Sm 绑定序列对于将 snRNA 有效定位到 Cajal 体中的重要性。

Introduction

RNA拼接是基因表达的关键步骤之一,基因表达是由一种称为拼接体的大型核糖核蛋白复合物催化的。总共,超过150种蛋白质和5种小核RNA(snRNA)在拼接途径的不同阶段被集成到拼接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA正在参与主要GU-AG的拼接。这些snRNA加入拼接的拼接体作为预形成的小核核核核核核核核核核核核蛋白颗粒(snRNA),含有snRNA,7个Sm蛋白与snRNA(或类似Sm蛋白,与U6 snRNA相关)和1-12个特定蛋白质为每个snRNP。

snRNP 的组装涉及细胞质和核阶段。新转录的snRNA被导出到细胞质中,在那里它获得一个从七种Sm蛋白组装而成的环。Sm环随后充当snRNA重新导入到核的信号。有缺陷的snRNA,不能与Sm蛋白关联,被保留在细胞质1。新进口的snRNPs首先出现在Cajal体内,它们与snRNP特异性蛋白质相遇并完成其成熟(参考^{文献2,3)。}我们最近表明,抑制最终成熟步骤导致在Cajal身体4,5中固存未成熟的snRNPs。我们提出了一个模型,其中最终的snRNP成熟是在质量控制下,监测snRNP特异性蛋白质的添加和活性snRNPs的形成。然而,细胞如何区分正确组装的成熟颗粒和异常未成熟颗粒的分子细节仍然难以捉摸。

为了确定在核Cajal体内靶向和积累snRNA所必需的snRNA序列,我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射。微注射是一种选择的方法,因为:1) 它不需要额外的序列标记来区分合成 snRNA 形成其内源性对应物,这对短 RNA 尤其重要,空间很小,无法插入额外的标记序列;2) 它允许分析对生物发生很重要的序列。例如,Sm 序列对于 Sm 环组件和重新导入到原子核⁶中至关重要。当snRNA在细胞中表达时,缺乏Sm序列的snRNA在细胞质中降解,并且不到达细胞核和Cajal体7。然而,没有Sm序列的snRNA可以直接微注入到细胞核中,从而在Cajal身体定位测定中Sm序列的潜在作用。

在这里,我们详细描述了一种显微注射方法,我们应用这种方法来确定将snRNA靶向Cajal体5所需的snRNA序列。我们表明,Sm 和 SMN 绑定位点是必要和足够的,不仅 snRNA,而且各种短非编码 RNA 到 Cajal 身体。基于显微注射和其他证据,我们提出在Sm绑定位点上组装的Sm环是Cajal体定位信号。

Protocol

1. 制备用于显微注射的snRNA

1. 使用以下 PCR 设置,准备包含全长或截断/突变版本的 SnRNA 的 DNA 模板:98 °C,60 s,98 °C,15 s,68 °C,1 分钟,98 °C 15 秒和 72 °C 5 分钟。
2. 前引物必须包含一个促进因子序列,用于第一个转录核苷酸的上游体外转录。使用含有T7启动子和反向底漆的正向底漆放大U2 snRNA序列,该底漆以最后一个转录的核苷酸结束(详情见材料表)。
3. 使用用于短RNA合成试剂盒(详情见材料表)的含有T7RNA聚合酶的snRNA合成。添加 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2m UTP-Alexa488, 1.8 mM 三甲基苯丙胺帽模拟 (m3^2,2,7G(5') ppp(5')G, 1 mL RNA抑制剂和 500-700 ng 的 DNA 模板到反应混合物和孵育在 37 °C 过夜.
4. 在反应中加入1μL(2U)的DNase,并在37°C下孵育15分钟。
5. 通过酸性苯酚/氯仿提取分离snRNA。去除顶部水相,加入3M醋酸钠(pH = 5.2)、3 μL糖原原体积的1/10,以更好的颗粒可视化和2.5体积的100%乙醇。在-80°C下孵育1小时,在14,000 x g和4°C下离心10分钟。
6. 用70%乙醇清洗颗粒,并溶解在12μL的无核酸酶水中。通常的RNA产量约为600纳克/mL。储存在-80°C。
7. 通过阿加辛胶电泳监测体外转录的snRNA的完整性。
8. 在显微注射之前,将RNA稀释至含有10μg/μL dextran-TRITC 70 kDa的水中的最终浓度为200纳克/mL。

2. 单元格

1. 使用前,用1M HCl处理盖玻片1小时,在蒸馏水中彻底清洗,并储存在100%乙醇中。酸性治疗促进细胞粘附,以防止注射期间或注射后细胞剥落。为了更容易识别注入的细胞,请使用带网格的封面玻片。
2. 种子HeLa或其他粘附细胞在12mm盖玻片(1号或1.5号)上注射前1天达到显微注射时50%的汇合。

3. 注射

注:HeLa细胞在Dulbeco的改性鹰培养基(D-MEM,4.5g/L D-葡萄糖中含有苯酚红和抗生素)中进行微注射。注射使用喷油器和装有无菌针的显微操作器进行(详情见材料表)。将整个显微/显微操作器系统预热至37°C至少4小时,以防止显微镜和显微注射器各部分的波动。

1. 将含有 2 mL 培养基的培养皿(30 mm)与中间的盖玻片放入显微镜支架中。使用微装载机将 3 μL 的 snRNA 混合物加载到针头中。将针头安装在 45° 的显微注射器支架中,相对于培养皿的表面。
2. 要找到针头,请使用 10 倍长距离目标。首先,在喷油器上设置速度,降低针头,直到其接触培养基。使用显微镜双筒望远镜,找到亮点,这是针接触培养基的地方。
3. 将速度更改为FINE并进一步降低针头,同时观察显微镜,直到观察到针头尖。在视场中间移动指针,然后切换到 40 倍长距离目标。
4. 更改目标后,选择细胞并将指针移到此细胞上方。设置电池触点的压力和时间(请参阅讨论中的提示和故障排除)。
5. 将针向下移入细胞,然后在微操作器上设置下限。小心不要将针头移到细胞下方。
6. 设置下限后,将针头移回电池上方,然后按下喷油器操纵手柄上的喷射按钮。针在细胞内自动移动到设定极限的位置,并注射RNA混合物。
7. 要完成操作,请按下喷油器上的MENU 按钮,然后从支架上取下针头。然后,在关闭喷油器和微操作器之前,断开喷管与喷油器的连接。

4. 细胞固定和染色

1. 微注射后,将细胞返回到CO2培养箱,并在37°C孵育1小时。
2. 孵育后,在室温下用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)冲洗细胞三次,在0.1 M PIPES pH 6.9中用4%的甲醛固定20分钟,用室温PBS洗涤三次。如果仅分析 snRNA 定位,请在水中短暂冲洗细胞,然后用 DAPI 安装在安装介质中。
3. 在额外的蛋白质定位的情况下,在室温下用0.5%Triton-X100在PBS中渗透细胞5分钟。使用PBS冲洗三次后,用初级和二级抗体孵育细胞,在PBS中最后洗净后在水中短暂冲洗,用DAPI安装在安装介质中。

5. 显微镜

1. 如果在安装后没有立即进行成像,则将幻灯片存放在 4°C,直到成像。
2. 使用配备浸入物镜(60X 或 100x/1.4NA)的高端荧光显微系统获取图像。
3. 一旦识别微注入细胞,收集一个20个z截面的堆栈,每个样本有200 nm z步长,并受到数学反卷积。然后,提出了最大投影或单个 z 堆栈。
4. 要量化荧光信号,在通过线圈免疫染色识别的 Cajal 身体周围绘制感兴趣区域 (ROI)。测量线圈IN定义ROI中snRNA信号的强度。接下来确定随机放置在核质中的ROI中的snRNA荧光强度,并计算Cajal体和核质中RNA信号的比例。

Results

为了监测snRNA的定位和Sm结合位点在Cajal身体靶向中的作用,我们准备了一个DNA模板,其中包含T7启动子和全长U2 snRNA或U2 snRNA,缺少构成Sm结合位点的七个核苷酸(AUUUUG)。snRNA在体外转录、分离和与TRITC耦合dextran-70kDa混合。我们微注射含有体外转录的snRNA的混合物到HeLa细胞的细胞质。

此前已经表明,Sm绑定场址是核^进口6所必需的。为了测试Sm位点是否对Cajal身体积累也很重要,我们微注射snRNA,缺乏Sm位点直接进入细胞核(图1A)。注射到细胞质作为对照(图1B)。作为一种正对照,我们微注射全长snRNA(图1C,D)。在CO2培养箱中孵育60分钟后,确定微注入细胞,通过间接免疫荧光对Cajal体标记线圈进行可视化。核和细胞质注射后在Cajal体内积累的全长snR...

Discussion

我们采用荧光标记snRNA的显微注射来确定对snRNA定位到核Cajal体中的重要序列。由于标签RNA的快速且相当简单制备(通过PCR制备DNA模板,然后进行体外转录),该方法提供了有效分析各种序列如何促进RNA定位。在相对较短的时间内,我们能够分析U2 snRNA的10个不同的删除或替换(参考文献5和未显示的数据)。对于具有复杂生物成因途径的RNA,这种方法还允许对成熟至关重要的测试序列。在snRNA的情况下,删除Sm结合序列,这是Sm环组装所必需的,导致在细胞^质7中固存和退化突变的snRNA。其他优势包括两种不同标记的RNA可以同时注射,并在一个细胞内直接比较其定位。然而,由于各种氟铬可能改变RNA行为,在双重标签实验之前,必须单独测试每个氟铬。已成功地注射了数百个长度的核苷酸RNA,并在各种模型系统中对其定位进行了测定(参考^文献8中对此进行了审查)。长RNA的极限步骤通常是全长RNA的体外合成。此外,使用预组装蛋白注射RNA可以用于测试单个蛋白质对RNP定位的影响。在我们的项目中,我们注射...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	储备浓度 1 mM
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 - 高葡萄糖	Sigma-Aldrich	D5796	含有 4.5 g⁄L D-葡萄糖、酚红和抗生素
FemtoJet express 注射器	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	0.5 &微量显微注射针;m 内和 0.7 µm 外径
含 DAPI 的 Fluoromont G	SouthernBiotech	0100-20
糖原	ThermoFisher	AM9510	原液浓度 5 mg/mL
网格状玻璃盖玻片	Ibidi	10817	带网格的盖玻片，没有直接经验
InjectMan NI 2 显微作器	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G（5'）ppp（5'）G 三甲基化帽类似物	Jena Bioscience	NU-853-1	原液浓度 40 mM
MEGAshortscript T7 转录试剂盒	ThermoFisher	AM1354
显微镜盖玻片 12 mm，No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	用于日常工作
显微镜盖玻片 12 mm，No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	用于高分辨率图像
显微镜 DeltaVision	GE Healthcare		用于图像采集
显微镜 DMI6000	Leica		用于显微注射
多聚甲醛 32% 溶液 EM 级	EMS	15714	溶解在 PIPES 中至终浓度 4%
苯酚：氯仿 5：1	Sigma-Aldrich	P1944
用于 U2 扩增的引物： 正向：5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG， 反向：5&急性;TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 启动子序列（斜体）
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	储备液浓度 40 mM
异硫氰酸四甲基罗丹明 葡聚糖 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	溶于水，储备液浓度 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	溶于水，原液浓度 10%