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方法文章

从人唾液腺中分离唾液腺上皮细胞用于体外培养形成唾液球或单层细胞

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DOI：

10.3791/59868

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2019年7月15日

 , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍一种分离和培养原代人唾液腺来源上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液腺上皮来源一致的基因表达模式，可在来源于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的基底膜基质上以唾液球（salispheres）形式培养，也可在经处理的培养皿上以单层形式生长。

摘要

唾液腺是研究人类多种疾病相关问题的重要部位。研究人员的一个目标是恢复因放疗损伤或与干燥综合征相关的病理状况而受损的腺体功能。另一个目标是阐明病毒在腺体组织内复制的机制，从而进入唾液，实现水平传播。这些研究目标凸显了建立一种稳定且易于获取的体外唾液腺模型的重要性，以便上述及相关研究领域的科研人员使用。本文介绍一种简单的方法，用于从人唾液腺中分离上皮细胞并在体外进行扩增。本方案可根据具体研究需求进一步优化。简言之，通过机械和酶消化方法将唾液腺组织解离，获得单个细胞或小细胞团。通过将细胞接种于基底膜基质上，并在促进上皮细胞生长的优化培养基中培养，实现上皮细胞的筛选。所获得的细胞培养物可维持为三维细胞团（称为“唾液球”），也可在经处理的塑料培养皿上以单层形式生长。该方法可获得主要为上皮细胞的异质性细胞群体，可在发生细胞衰老前连续传代5–8次（完成15–20次群体倍增）。

引言

在哺乳动物中，唾液腺分为三对主要唾液腺：腮腺、下颌下腺和舌下腺。此外，在舌部还分布有一系列小唾液腺，散在于整个口腔内1。主要唾液腺负责产生大部分唾液量2。唾液不仅通过分泌因子提供抗菌保护，还在食物咀嚼以及经食管运输过程中起到润滑作用2。因此，唾液腺功能障碍是一种医学问题，患者因无法分泌足够的唾液，更容易发生龋齿或口腔念珠菌病等疾病3。此外，唾液减少会导致进食和消化食物更加困难，显著影响生活质量。

唾液腺功能障碍主要见于患有干燥综合征（一种自身免疫性疾病）的患者，或接受过头颈部放疗的癌症患者3,4,5,6。由于自身免疫或放射治疗导致腺体内分泌腺泡受损，且无法自我更新，从而造成患者遭受不可逆的损伤6。唾液腺的研究也引起了关注病毒致病机制的研究人员的兴趣。某些病原体（如人巨细胞病毒，HCMV）可在唾液腺内持续复制，并通过唾液将新生病毒传播给新的宿主7,8。因此，迫切需要建立稳健且可重复的唾液腺组织体外模型，以应对和深入理解多种多样的医学问题。

已有多种小鼠唾液腺系统模型被用作研究起点，以理解并表征构成唾液腺的不同上皮细胞9,10。人类与小鼠唾液腺之间存在明显且重要的差异11。最显著的区别在于，人类腮腺相对于下颌下腺更大，而小鼠的下颌下腺与腮腺在大小上则更为相近1,2,11。尽管目前已存在永生化的人类下颌下腺细胞系，但人们普遍担忧这些永生化细胞无法准确维持原代组织的表型，同时也有疑虑认为这些细胞并非真正来源于唾液腺上皮组织本身12。基于这些原因，研究人源原代唾液腺组织具有重要意义且十分必要。

本文介绍一种从人唾液腺组织中分离原代上皮细胞并进行体外培养的实验方案。本方案基于 Pringle 等人和 Tran 等人的研究工作，并对其步骤进行了若干修改，以普遍简化操作流程13,14。首先，Tran 等人的方案要求使用酶消化唾液腺组织长达五小时，而我们的改良方案仅需一小时孵育即可成功，与 Pringle 等人的方案类似。其次，我们采用不同的酶组合进行组织消化，特别是未使用原始 Tran 等人方案中的胰蛋白酶（trypsin），而是使用分散酶（dispase）和胶原酶（collagenase）的混合物。我们倾向于在初始消化步骤中避免使用胰蛋白酶，因为最近一项研究表明，胰蛋白酶对唾液腺组织的初始消化可能导致细胞活力下降，可能是由于丢失了一类稀有的干细胞群体15。最后，我们将唾液球（salispheres）培养在基底膜基质（BMM）表面，并使用一种 commercially available 培养基，该培养基最初是为支气管上皮细胞扩增而设计的。本方案适用于从腮腺、下颌下腺和舌下腺中分离唾液腺细胞。这些细胞表达唾液淀粉酶及其他唾液特异性基因，表明其维持了类似于唾液腺腺泡上皮细胞的表型7。我们已利用该方法成功建立了来自 >50 例原代人组织样本的唾液腺细胞培养。此外，这些原代唾液腺细胞可方便地进行冷冻保存，以供后续使用。

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方案

这些方案和研究已通过辛辛那提大学机构审查委员会的审查和批准（全机构范围保证编号 #00003152，IRB 方案编号 2016-4183）。唾液腺组织在许多头颈部外科手术中常被切除，通常未受恶性病变累及。通常，在从患者体内切除后 2–4 小时内使用新鲜切除的唾液腺组织（图 1A）。

1. 试剂准备

  1. 支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）
    1. 加入制造商提供的试剂盒中的组分（见材料表）。
    2. 用基础培养基冲洗每根试管一次，以确保组分完全转移。然后加入炭吸附处理的胎牛血清，使血清终浓度为4%。
  2. 红细胞（RBC）裂解缓冲液
    1. 配制10x储存液：称取40.15 g NH4Cl、5.0 g NaHCO3和0.186 g乙二胺四乙酸（EDTA），用dH2O定容至200 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
    2. 使用前用无菌dH2O稀释至1x工作浓度。
  3. 解离溶液
    1. 向100 mL Dispase溶液瓶（见材料表）中加入0.15 g III型胶原酶。待胶原酶完全溶解后，过滤除菌，分装，于-20 °C保存。

2. 组织消化

  1. 使用100 mm细胞培养皿，用经高压灭菌的解剖剪刀和外科镊子将组织机械剪切成约1–2 mm大小的细小碎片（图1B，C）。应剪断组织碎片之间的结缔组织，以确保充分分离，并便于后续操作。
  2. 向剪碎的组织中加入6 mL dispase/collagenase溶液，然后在37 °C孵育约30分钟至1小时。
  3. 用5 mL血清移液管反复吹打组织15–20次，以进一步分散组织。
  4. 再次于37 °C孵育30分钟至1小时。
  5. 重复步骤2.3和2.4两到三次，或直至组织呈糊状并能轻松通过移液管开口（图1D）。
    注意：组织样本的初始大小以及剪切的精细程度将决定步骤2.3和2.4需要重复的次数。通常情况下，我们收到的组织样本大小约为1 cm × 1 cm。此外，可使用标准倒置细胞培养显微镜监测组织解离过程，以追踪细胞从组织中分离的进展。少量细胞簇有利于唾液腺细胞以唾液球（salispheres）形式进行初始生长。

3. 用基底膜基质包被孔板

注意：基底膜基质（BMM）应在使用前一天于 4 °C 条件下过夜解冻。解冻后，BMM 必须始终置于冰上或 4 °C 环境中，因为在较高温度下其会迅速凝固（即形成凝胶）。此外，若样品在接种到 BMM 之前曾于冰上冷却，则需格外小心，因为低温样品会"融化"BMM，从而使细胞直接暴露于塑料培养皿表面。

  1. 将BMM（参见材料表）缓慢移液至每个待包被的孔中。均匀且缓慢地将BMM分布在孔内。
    ​注意：通常我们每孔使用500 µL的BMM，但可根据需要调整体积，用于其他规格的培养板（如12孔板或24孔板），或制备更厚或更薄的水凝胶。
  2. 包被后的培养板在使用前于37 °C孵育至少15分钟，以使BMM充分凝固。

4. 未消化组织的过滤、红细胞裂解和细胞铺板

  1. 将步骤 2.5 中的组织匀浆转移至 15 mL 圆锥形离心管中。用 6 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养板一次，以转移残留的细胞。
  2. 通过 70 µm 尼龙网细胞筛将匀浆过滤至 50 mL 圆锥形离心管中，以去除未消化的组织。将滤过的细胞在 500 x g 条件下离心 5 分钟。
  3. 用无菌 dH2O 将 10 倍浓度的红细胞裂解缓冲液稀释成 1 倍工作液。
  4. 吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于 10 mL 1x 红细胞裂解缓冲液中，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  5. 加入 20–25 mL DPBS 以中和红细胞裂解缓冲液，并尽量减少唾液细胞的裂解。在 500 x g 条件下离心 5 分钟。
    注意：经红细胞裂解缓冲液处理后，细胞沉淀应呈白色。若沉淀呈红色，表明红细胞尚未完全裂解。如有需要，可重复步骤 4.4 至 4.5 ，直至红细胞完全裂解。
  6. 吸除上清液，然后按每孔加入 1–2 mL 支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）重悬细胞沉淀，并将重悬的细胞接种至 BMM 包被的孔中。在 37 °C 下孵育。
  7. 细胞接种至 BMM 后，将在 2–3 天内形成球形结构，即"唾液球"。在 BMM 开始降解前，细胞可作为唾液球维持约 5–7 天；BMM 降解后，细胞得以接触并黏附于塑料表面，进而以单层形式生长。

5. salisphere 的传代培养及在 BMM 上的维持

  1. 吸弃孔板中的培养基，然后每孔加入 1 mL dispase/collagenase 溶液，在 37 °C 下孵育约 15 分钟，或直至基底膜基质（BMM）大部分溶解。
  2. 将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中，并用 DPBS 洗涤孔板一次以收集残留细胞。在 500 ×g 条件下离心 5 分钟。
  3. 吸弃上清液。将沉淀重悬于 2 mL 胰蛋白酶溶液中，然后在 37 °C 下孵育 15 分钟。
  4. 使用含 10% 血清的完全培养基中和胰蛋白酶。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 吸弃上清液。将细胞重悬于 DPBS 中以去除残留的培养基、胰蛋白酶和血清。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 吸弃上清液。将细胞重悬于 BEGM 中，并将重悬的细胞接种至已固化的 BMM 包被的培养皿中。重悬的细胞也可直接接种于经细胞培养处理的培养皿中，以单层形式进行增殖。有关唾液腺细胞以单层形式培养的更多信息，请参见第 6 节。在 BMM 或塑料表面培养的细胞应每隔 2–3 天更换一次新鲜的 BEGM。
  7. 将细胞置于湿度控制的培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 条件下进行培养。

6. 在经处理的塑料培养皿上继代培养唾液球

注意：若在塑料培养皿上以单层形式培养细胞，请从此步骤开始。以下方案适用于在100 mm培养皿中生长的细胞。

  1. 吸去培养基，用 DPBS 洗涤一次，以去除残留的培养基。
  2. 加入 2 mL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 15 分钟，或直至细胞完全脱落。
  3. 使用 4 mL 含 10% 血清的完全培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  4. 用约 5 mL DPBS 洗涤培养板一次，以收集残留细胞，于 500 × g 离心 5 分钟。
  5. 吸去上清液，将细胞重悬于 6–10 mL DPBS 中，以去除残留培养基。
  6. 于 500 × g 离心 5 分钟。
  7. 吸去上清液，将细胞重悬于 BEGM 中，接种至经处理的塑料组织培养皿中，每 2–3 天更换新鲜 BEGM。
  8. 将细胞培养于湿度控制的培养箱中，维持 37 °C 及 5% CO2 条件。

7. 细胞的冷冻保存

注意：细胞的冷冻保存可从源自唾液球或单层培养细胞的单细胞悬液中完成。

  1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以计算存在的细胞总数。
  2. 在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液。将沉淀用含有 10% 二甲基亚砜（DMSO）的支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）重悬。细胞浓度应为 2 × 106 个细胞/mL 至 10 × 106 个细胞/mL。
  4. 将细胞分装至无菌冻存管中。将冻存管放入隔热泡沫架内，于 -80 °C 过夜孵育，以实现细胞的缓慢冷冻。
  5. 次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
    注意：细胞应在 37 °C 快速解冻。解冻后，于 500 × g 离心使细胞沉淀，并在接种前去除含 DMSO 的培养基。

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结果

将消化组织后的细胞接种到BMM上2-3天后，细胞会迅速形成小的细胞簇，每个细胞簇的规模可继续扩大至15-20个细胞（图2A）。通常可见细胞碎片和脱落的死细胞，应通过吸除并更换新鲜培养基予以清除。细胞将以唾液球（salisphere）形式持续增殖约3-10天，或直至BMM层保持完整为止。偶尔由于BMM部分降解，细胞会贴附于底部塑料表面，并开始以单层形式增殖。在BMM上生长的唾液球在大小和结构复杂性方面会表现出一定变异性。可通过按本方案所述方法将唾液球传代至新制备的BMM上来维持其生长。在传代至新鲜BMM后的2-3天内，细胞将重新形成球状结构。唾液球细胞也可接种于经细胞培养处理的塑料表面，以单层形式生长，此时其形态学特征与上皮来源细胞一致，如图2B所示。尽管在BMM上以唾液球形式生长的细胞更可能维持唾液组织特有的表型，但以单层形式生长的细胞在某些实验方案中可能更具优势。需要进行更深入的表征分析，以确定单层培养的细胞与唾液球培养的细胞相比，在多大程度上保留了唾...

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讨论

唾液腺功能障碍会影响舍格伦综合征患者以及接受邻近唾液腺肿瘤放射治疗患者的生存质量3,4,5,16。一种针对这些患者的潜在治疗方法是在体外培养具有功能的唾液腺干细胞或类器官，随后将其植入受损的唾液腺中以替代病变组织9。此外，唾液腺常常是人类病原体持续存在和传播的部位。例如，已知人类疱疹病毒（如人巨细胞病毒，HCMV）可感染唾液腺，并利用唾液腺和唾液将病毒传播给新的宿主7,8,17。然而，病毒在唾液腺中持续存在的分子机制及其进入唾液的过程仍不清楚。体外唾液腺细胞系统的建立将为探索这些机制提供重要的模型系统。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 James P. Bridges 在原代细胞培养相关方法上提供的宝贵指导。Matthew J. Beucler 获美国国立卫生研究院培训项目 T32-ES007250 资助。本研究还获得了授予 William E. Miller 的美国国立卫生研究院项目 R01-AI121028 和 R21-DE026267 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿Thermo Scientific172931
15 mL 圆锥形离心管Thermo Scientific339651
50 mL 圆锥形离心管Thermo Scientific339653
支气管上皮细胞生长培养基LonzaCC-3171根据制造商说明添加弹头试剂盒。补充 20 mL 去除活性炭的胎牛血清。
70 µm 尼龙网细胞筛Fisher22-363-548
去除活性炭的胎牛血清Gibco12676-029
III 型胶原酶WorthingtonLS004182在 4 °C 下保存。
冻存管Fisher5000-0020
中性蛋白酶Cell Applications07923将胶原酶溶解配制成 0.15% (w/v) 储存液。过滤除菌后于 -20 °C 保存。
解剖剪刀Fisher08-940
杜氏磷酸盐缓冲液Corning55-031-PC
常规化学品Sigma
PathClear 基底膜提取物Cultrex3432-005-01使用前至少在 4 °C 下解冻 24 小时。操作时始终置于冰上。
六孔培养板Falcon353046
手术镊Fisher22-079-742
胰蛋白酶-EDTA 溶液Corning25-052-CI

参考文献

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