我们介绍一种分离和培养原代人唾液腺来源上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液腺上皮来源一致的基因表达模式，可在来源于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的基底膜基质上以唾液球（salispheres）形式培养，也可在经处理的培养皿上以单层形式生长。
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摘要
摘要
唾液腺是研究人类多种疾病相关问题的重要部位。研究人员的一个目标是恢复因放疗损伤或与干燥综合征相关的病理状况而受损的腺体功能。另一个目标是阐明病毒在腺体组织内复制的机制，从而进入唾液，实现水平传播。这些研究目标凸显了建立一种稳定且易于获取的体外唾液腺模型的重要性，以便上述及相关研究领域的科研人员使用。本文介绍一种简单的方法，用于从人唾液腺中分离上皮细胞并在体外进行扩增。本方案可根据具体研究需求进一步优化。简言之，通过机械和酶消化方法将唾液腺组织解离，获得单个细胞或小细胞团。通过将细胞接种于基底膜基质上，并在促进上皮细胞生长的优化培养基中培养，实现上皮细胞的筛选。所获得的细胞培养物可维持为三维细胞团（称为“唾液球”），也可在经处理的塑料培养皿上以单层形式生长。该方法可获得主要为上皮细胞的异质性细胞群体，可在发生细胞衰老前连续传代5–8次（完成15–20次群体倍增）。
引言
在哺乳动物中，唾液腺分为三对主要唾液腺：腮腺、下颌下腺和舌下腺。此外，在舌部还分布有一系列小唾液腺，散在于整个口腔内1。主要唾液腺负责产生大部分唾液量2。唾液不仅通过分泌因子提供抗菌保护，还在食物咀嚼以及经食管运输过程中起到润滑作用2。因此，唾液腺功能障碍是一种医学问题，患者因无法分泌足够的唾液，更容易发生龋齿或口腔念珠菌病等疾病3。此外，唾液减少会导致进食和消化食物更加困难，显著影响生活质量。
唾液腺功能障碍主要见于患有干燥综合征（一种自身免疫性疾病）的患者，或接受过头颈部放疗的癌症患者3,4,5,6。由于自身免疫或放射治疗导致腺体内分泌腺泡受损，且无法自我更新，从而造成患者遭受不可逆的损伤6。唾液腺的研究也引起了关注病毒致病机制的研究人员的兴趣。某些病原体（如人巨细胞病毒，HCMV）可在唾液腺内持续复制，并通过唾液将新生病毒传播给新的宿主7
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方案
这些方案和研究已通过辛辛那提大学机构审查委员会的审查和批准（全机构范围保证编号 #00003152，IRB 方案编号 2016-4183）。唾液腺组织在许多头颈部外科手术中常被切除，通常未受恶性病变累及。通常，在从患者体内切除后 2–4 小时内使用新鲜切除的唾液腺组织（图 1A）。
1. 试剂准备
- 支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）
- 加入制造商提供的试剂盒中的组分（见材料表）。
- 用基础培养基冲洗每根试管一次，以确保组分完全转移。然后加入炭吸附处理的胎牛血清，使血清终浓度为4%。
- 红细胞（RBC）裂解缓冲液
- 配制10x储存液：称取40.15 g NH4Cl、5.0 g NaHCO3和0.186 g乙二胺四乙酸（EDTA），用dH2O定容至200 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
- 使用前用无菌dH2O稀释至1x工作浓度。
- 解离溶液
- 向100 mL Dispase溶液....
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结果
将消化组织后的细胞接种到BMM上2-3天后，细胞会迅速形成小的细胞簇，每个细胞簇的规模可继续扩大至15-20个细胞（图2A）。通常可见细胞碎片和脱落的死细胞，应通过吸除并更换新鲜培养基予以清除。细胞将以唾液球（salisphere）形式持续增殖约3-10天，或直至BMM层保持完整为止。偶尔由于BMM部分降解，细胞会贴附于底部塑料表面，并开始以单层形式增殖。在BMM上生长的唾液球在大小和结构复杂性方面会表现出一定变异性。可通过按本方案所述方法将唾液球传代至新制备的BMM上来维持其生长。在传代至新鲜BMM后的2-3天内，细胞将重新形成球状结构。唾液球细胞也可接种于经细胞培养处理的塑料表面，以单层形式生长，此时其形态学特征与上皮来源细胞一致，如图2B所示。尽管在BMM上以唾液球形式生长的细胞更可能维持唾液组织特有的表型，但以单层形式生长的细胞在某些实验方案中可能更具优势。需要进行更深入的表征分析，以确定单层培养的细胞与唾液球培养的细胞相比，在多大程度上保留了唾.......
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讨论
唾液腺功能障碍会影响舍格伦综合征患者以及接受邻近唾液腺肿瘤放射治疗患者的生存质量3,4,5,16。一种针对这些患者的潜在治疗方法是在体外培养具有功能的唾液腺干细胞或类器官，随后将其植入受损的唾液腺中以替代病变组织9。此外，唾液腺常常是人类病原体持续存在和传播的部位。例如，已知人类疱疹病毒（如人巨细胞病毒，HCMV）可感染唾液腺，并利用唾液腺和唾液将病毒传播给新的宿主7,8,17。然而，病毒在唾液腺中持续存在的分子机制及其进入唾液的过程仍不清楚。体外唾液腺细胞系统的建立将为探索这些机制提供重要的模型系统。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 James P. Bridges 在原代细胞培养相关方法上提供的宝贵指导。Matthew J. Beucler 获美国国立卫生研究院培训项目 T32-ES007250 资助。本研究还获得了授予 William E. Miller 的美国国立卫生研究院项目 R01-AI121028 和 R21-DE026267 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Thermo Scientific | 339653 | |
| 支气管上皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3171 | 根据制造商说明添加弹头试剂盒。补充 20 mL 去除活性炭的胎牛血清。 |
| 70 µm 尼龙网细胞筛 | Fisher | 22-363-548 | |
| 去除活性炭的胎牛血清 | Gibco | 12676-029 | |
| III 型胶原酶 | Worthington | LS004182 | 在 4 °C 下保存。 |
| 冻存管 | Fisher | 5000-0020 | |
| 中性蛋白酶 | Cell Applications | 07923 | 将胶原酶溶解配制成 0.15% (w/v) 储存液。过滤除菌后于 -20 °C 保存。 |
| 解剖剪刀 | Fisher | 08-940 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Corning | 55-031-PC | |
| 常规化学品 | Sigma | ||
| PathClear 基底膜提取物 | Cultrex | 3432-005-01 | 使用前至少在 4 °C 下解冻 24 小时。操作时始终置于冰上。 |
| 六孔培养板 | Falcon | 353046 | |
| 手术镊 | Fisher | 22-079-742 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Corning | 25-052-CI |
参考文献
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.
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