正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

摘要

我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGlu_u 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS 相机采集信号，并使用焦点激光照射装置进行局部刺激。

摘要

突触是高度区室化的功能单位，彼此独立运作。在亨廷顿病（HD）及其他神经退行性疾病中，由于谷氨酸清除不足，可能导致“溢入”和“溢出”效应，从而破坏这种独立性。已有研究指出，突触前末梢和/或树突棘的星形胶质细胞覆盖异常，以及谷氨酸释放位点处谷氨酸转运体簇的尺寸减小，与导致运动障碍/运动过多症状的疾病发病机制相关。然而，导致HD中谷氨酸能突触功能障碍的机制尚不明确。通过改进并应用突触成像技术，我们获得了揭示运动启动障碍新机制的数据。本文描述了一种相对低成本的方法，利用新型基因编码的超快谷氨酸传感器iGlu_u、宽场光学系统、科学级CMOS（sCMOS）相机、473 nm激光器及激光定位系统，在来自年龄匹配的健康或患病小鼠的急性脑片中实现单突触分辨率，以评估皮质-纹状体突触的状态。通过单个或多个像素构建谷氨酸瞬变信号，用于估算：i）基于活性区附近谷氨酸浓度[Glu]最大升高值所反映的谷氨酸释放水平；ii）通过突触周围[Glu]衰减时间常数（TauD）所反映的谷氨酸摄取能力。静息状态下末梢的大小差异以及短时程可塑性的不同模式，被用作识别皮质-纹状体末梢属于端脑内神经元（IT）通路或锥体束（PT）通路的判据。利用这些方法，我们发现，在出现症状的HD小鼠中，约40%的PT型皮质-纹状体突触表现出谷氨酸清除不足，提示这些突触可能易于遭受兴奋性毒性损伤。该结果强调了TauD作为具有运动减少表型的亨廷顿病小鼠中功能障碍突触生物标志物的重要价值。

引言

属于一个"单突触连接"（即两个神经细胞之间的连接）的每个突触终末的相对作用，通常通过其对突触后神经元初始段的影响来评估^1,2。对突触后神经元的胞体和/或树突记录是目前最常用且最具成效的方法，用于从自上而下或纵向的视角阐明信息处理机制^3,4,5。然而，星形胶质细胞的存在及其各自独立且（在啮齿类动物中）互不重叠的区域，可能提供一种基于突触部位局部信号交换、整合与同步机制的横向视角^6,7,8,9,10。

众所周知，星形胶质细胞在神经退行性疾病的发病机制中通常起着重要作用^11,12，特别是在谷氨酸能突触的维持和可塑性方面具有关键作....

方案

所有工作均按照欧盟动物实验指令2010/63/EU进行，并已在柏林卫生保护与技术安全办公室注册（G0233/14 和 G0218/17）。

注意：可在任何年龄和性别中进行 Q175 野生型（WT）和杂合子（HETs）的记录。本研究中，我们选取了 51 至 76 周龄的雄性和雌性个体进行研究。

1. 在皮质纹状体轴突中表达谷氨酸传感器 iGlu_u 的注射方法

1. 使用拉针仪（一步拉制模式）制备用于病毒注射的硼硅酸盐玻璃移液管。拉制完成后，手动折断移液管尖端，使其尖端直径达到 30–50 µm。对移液管及手术器械（包括用于开颅的钻头）进行高压灭菌处理。
2. 将病毒 AAV9-CaMKIIa.iGlu_u.WPRE-hGH（7.5 x 10¹³gc/mL）以 10 µL 分装保存于 -80 °C。若在病毒制备后不久（6 个月内）进行注射，则可暂时保存于 5 °C。手术前取出病毒管，置于室温下平衡。
3. 用病毒溶液填充玻璃移液管，并去除所有气泡。
4. 通过腹腔注射含 87.5 mg/kg 氯胺酮和 12.5 mg/kg 赛拉嗪的混合溶液麻醉动物。皮下注射 0.25% 布比卡因（8 mg/kg）以提供额外镇痛。通过监测肌肉张力及观察疼痛诱发反射是否....

结果

鉴定两种类型的皮层-纹状体谷氨酸能曲张体
IT 和 PT 传入纤维分别起源于第 2/3 层和第 5 层，并在同侧及对侧（仅 IT 末梢）纹状体中表现出不同的分支和终止模式。目前对于在运动启动过程中常见的重复刺激条件下谷氨酸释放与清除的特性仍知之甚少，但已有充分证据表明，相应的谷氨酸释放型曲张体在大小上存在差异²²。通过采用大小判别标准，研究发现 IT 和 PT 末梢在短期可塑性方面表现出截然不同的形式²⁴。在 50 ms 刺激间隔下，较小的 IT 末梢倾向于出现成对脉冲抑制（PPD），而较大的 PT 末梢则表现出成对脉冲易化。这种差异在更短的刺激间隔（20 ms）以及连续 6 次脉冲刺激序列中均被观察到。图 3 和 图 6 展示了这些实验结果，其中通过动作电位机制在生理 Ca²⁺/Mg²⁺ 浓度条件下诱发了突触谷氨酸的释放。

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讨论

这些实验涉及一个普遍关注的问题——突触的独立性及其在神经退行过程中可能发生的丧失，我们描述了一种新方法，用于在老年（>1年）小鼠的急性脑切片中识别受影响的突触。得益于近年来新推出的谷氨酸传感器iGlu_u所具有的更优动力学特性，这些实验以前所未有的方式揭示了突触谷氨酸释放与摄取之间的关系。

尽管在几乎所有关于癫痫、中风和神经退行性疾病的综述中都提到谷氨酸诱导的兴奋性毒性可导致神经元丢失和突触修剪这一假说，但谷氨酸清除对突触功能与维持的影响尚未被充分阐明^38,39,40,41。然而，现有证据的实际支持力度可能比文献中所预期的更为有限。此外，由于所选用的实验工具在空间和时间分辨率上的局限性，在使用整体刺激和记录技术解读结果时可能带来混淆^42,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜	WPI	PZMIII	Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
立体定位仪	Stoelting	51500D	Digital Lab New Standard stereotaxic frame
高速钻孔设备	Stoelting	514439V	Foredom K1070 cromoter Kit
注射系统	Stoelting	53311	Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton 注射器 5 µl	Hamilton	87930	75RN Syr (26s/51/2)
激光定位系统	Rapp OptoElectronic	UGA-40	UGA-40
用于 iGluu 激发的蓝光激光器	Rapp OptoElectronic	DL-473-020-S	473 nm laser
473 nm 二向色镜	Rapp OptoElectronic	ROE TB-355-405-473	Dichroic
1P 直立显微镜	Carl Zeiss	000000-1066-600	Axioskop 2 FS Plus
63x/1.0 物镜	Carl Zeiss	421480-9900	W Plan-Apochromat
4x 物镜	Carl Zeiss	44-00-20	Achroplan 4x/0,10
iGluu 用二向色镜	Omega optical	XF2030
iGluu 发射滤光片	Omega optical	XF3086
二向色镜	Omega optical	QMAX_DI580LP
自发荧光扣除用发射滤光片	Omega optical	QMAX EM600-650
sCMOS 相机	Andor	ZYLA4.2PCL10	ZYLA 4.2MP Plus
采集软件	Andor	4.30.30034.0	Solis
AD/DA 转换器	HEKA Elektronik	895035	InstruTECH LIH8+8
采集软件	HEKA Elektronik	895153	TIDA5.25
电极定位系统	Sutter Instrument	MPC-200	Micromanipulator
电刺激器	Charite workshops	STIM-26
切片机	Leica	VT1200 S	Vibrotome
Brown/Flaming 型拉制仪	Sutter Instr	SU-P1000	P-1000
注射移液管用玻璃管	WPI	1B100F3
刺激移液管用玻璃管	WPI	R100-F3
河豚毒素	Abcam	ab120054	TTX
iGluu 质粒	Addgene	106122	pCI-syn-iGluu
Q175 小鼠	Jackson Lab	27410	Z-Q175-KI