正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

对表达快速谷氨酸传感器的单个突触进行高分辨率成像，可检测到神经递质释放与摄取之间的局部不匹配。在疾病情况下，该方法可用于识别功能异常的突触。为校正自发荧光，首先将目标小鼠的脑切片放入单光子显微镜的记录室中。

将切片浸入充氧的人工脑脊液中，使用20倍水浸物镜定位背侧纹状体。用尼龙网格将切片固定在铂金丝网上以最大限度减少组织移动，然后切换至63倍水浸物镜。使用510纳米的高通滤光片，同时采集自发荧光和谷氨酸传感器阳性结构的图像。

使用600纳米的高通滤光片，单独获取自体荧光结构的第二幅图像。为定义范围，利用最亮的10个像素和最暗的10个像素的平均强度来调整红色和黄色图像。然后，进行黄色图像减去红色图像的减法运算，并对相减后的图像重新定标，生成标准的8位TIFF文件，以便于观察目标突触小结。

为了搜索有反应的突触小结，您需要使用合适的玻璃微电极进行电刺激。使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备刺激电极，使其尖端内径约为1微米。为了探测一组候选突触小结是否依赖动作电位释放谷氨酸，请选择63倍放大倍数和510纳米发射滤光片。

加载减影图像，以便将玻璃刺激电极放置在荧光曲张体附近，同时避免靠近其他轴突。将电极置于与最大分叉或位于切片较深区域内的分配相关的曲张体处。将刺激电极放置在目标突触小结附近，然后关闭光源，因为记录必须在完全黑暗的条件下进行。

然后，打开多通道浴槽灌流系统，其中一个通道输送标准浴液，其他通道输送必要的离子通道、转运体或膜受体阻断剂，包括用河豚毒素（tetrodotoxin）阻断动作电位的产生。控制记录位点的灌流速度，并开启刺激器，向刺激电极输送 2 至 10 微安的去极化电流脉冲。此时，神经递质的释放由电压门控通道介导的钙离子直接内流所激活。

为了在清除过程中可视化谷氨酸的释放，使用显微镜的 X、Y 驱动装置，将经测试的谷氨酸传感器阳性小体移至视野中心附近。停止采集后，用鼠标左键单击图像以确定静息小体中心的 X、Y 位置。设定光标的 X、Y 坐标将被显示出来。

根据校准数据，使用所示公式计算激光束应照射的位点坐标，以激发谷氨酸传感器荧光。在激光控制软件中创建单点序列时，在序列页面的“添加到序列”框中选择“点”，并将运行次数和运行延迟设置为零，序列设置为在TLL时运行。然后，点击“开始序列”。

在相机控制软件中，选择合适的成像参数，并将触发模式设为外部触发。在相机控制软件中点击“采集信号”。然后启动触发装置对应的实验方案，并按照适当的时间线执行一次实验方案试验，使相机在一次试验中以 2.48 千赫兹的频率采集 400 帧图像，重复频率为 0.1 赫兹或更低。

为了识别病理性突触，启动高程程序，计算所选感兴趣区域在静息状态下的荧光强度均值及标准差。将静息状态下荧光强度大于均值加三个标准差的像素所占据的区域框出，并假设该阈上区域呈圆形，据此确定其虚拟直径（单位：微米）。以荧光强度相对于时间的变化作图，即（实际荧光强度值减去静息状态荧光强度值）除以静息状态荧光强度值所得的差值。

确定荧光反应的峰值幅度。对荧光反应峰值后的衰减过程进行单指数拟合，确定衰减的时间常数 TauD。为了估算特定突触处的最大幅度，应选择荧光强度变化最大的像素点，该点最能反映突触清除机制所承受的谷氨酸负荷量。

利用突触大小和成对脉冲比标准，单突触成像可用于鉴定两类皮质-纹状体突触。在20至50毫秒的刺激间隔下，较小的中间肠-头端突触终端倾向于表现出成对脉冲抑制，而较大的锥体束突触终端则表现出成对脉冲易化。在野生型小鼠和表达亨廷顿表型的小鼠上进行的运动行为测试显示，开放场中总运动路径长度与跨步潜伏期之间存在显著正相关。

此外，单突触谷氨酸成像显示，有症状的亨廷顿病小鼠在单突触刺激引起的谷氨酸反应中，其突触旁谷氨酸衰减速率存在缺陷，表现为 TauD 值升高。在野生型动物中，只有在施加一种选择性、不可转运的谷氨酸摄取抑制剂后，才会观察到类似的延长现象。通过对野生型小鼠和表达亨廷顿病症状的小鼠脑片中特定 TauD 值出现概率的评估发现，在野生型动物中，TauD 从不超过 15 毫秒。

然而，在有症状的亨廷顿病中，尽管释放的谷氨酸量有减少的趋势，仍有40%的突触其TauD值介于16至58毫秒之间。因此，TauD可被视为亨廷顿病中功能障碍突触的生物标志物，并可用于验证针对星形胶质细胞谷氨酸转运的实验中功能恢复的效果。该针对单个皮质-纹状体突触谷氨酸监测的方案，可能有助于阐明谷氨酸摄取缺陷在神经退行性疾病发病机制中的作用。

单突触成像对于研究兴奋性突触的突触前位点尤为有用。