Name: 正常小鼠和亨廷顿小鼠急性脑切片中谷氨酸释放和服用的单突触指标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解利用iGluu荧光传感器和双光子显微镜在成年小鼠急性脑切片中评估单突触谷氨酸释放与清除平衡的方法。该技术可识别亨廷顿病模型中功能失调的突触，为神经退行性疾病研究提供重要工具。

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本工作由 CHDI（项目号 A-12467）、德国研究基金会（Exc 257/1 和 DFG 项目号 327654276 – SFB 1315）以及夏里特医院的院内研究基金资助。我们感谢伦敦大学圣乔治学院的 K. Török 和利物浦大学的 N. Helassa 提供 iGluu 质粒以及许多有益的讨论。D. Betances 和 A. Schönherr 提供了出色的技术支持。

所有工作均按照欧盟动物实验指令2010/63/EU进行，并已在柏林卫生保护与技术安全办公室注册（G0233/14 和 G0218/17）。
注意：可在任何年龄和性别中进行 Q175 野生型（WT）和杂合子（HETs）的记录。本研究中，我们选取了 51 至 76 周龄的雄性和雌性个体进行研究。
1. 在皮质纹状体轴突中表达谷氨酸传感器 iGluu 的注射方法
<ol>
	<li>使用拉针仪（一步拉制模式）制备用于病毒注射的硼硅酸盐玻璃移液管。拉制完成后，手动折断移液管尖端，使其尖端直径达到 30–50 µm。对移液管及手术器械（包括用于开颅的钻头）进行高压灭菌处理。</li>
	<li>将病毒 AAV9-CaMKIIa.iGluu.WPRE-hGH（7.5 x 1013gc/mL）以 10 µL 分装保存于 -80 °C。若在病毒制备后不久（6 个月内）进行注射，则可暂时保存于 5 °C。手术前取出病毒管，置于室温下平衡。</li>
	<li>用病毒溶液填充玻璃移液管，并去除所有气泡。</li>
	<li>通过腹腔注射含 87.5 mg/kg 氯胺酮和 12.5 mg/kg 赛拉嗪的混合溶液麻醉动物。皮下注射 0.25% 布比卡因（8 mg/kg）以提供额外镇痛。通过监测肌肉张力及观察疼痛诱发反射是否消失来评估麻醉深度。</li>
	<li>剃除头部皮肤毛发，并用 70% 酒精消毒。将小鼠固定于立体定位仪中。</li>
	<li>使用手术刀去除皮肤，用高速（38,000 rpm）钻头在运动皮层上方颅骨钻出直径为 1.2 mm 的孔。</li>
	<li>将连接注射移液管的注射器安装至精密操纵器的夹持装置上。将垂直取向的移液管插入皮层四个不同位点。注射坐标相对于前囟（单位：mm）为：前向 1.5，外侧 1.56、1.8、2.04、2.28；相对于硬脑膜的深度（单位：mm）为：1.5–1.7。</li>
	<li>使用注射系统，以 0.05 µL/min 的速度在每个位点注射 0.3 µL 未稀释的病毒溶液。每次注射后，将移液管留置 1 分钟，然后以 1 mm/min 的速度缓慢撤出。</li>
	<li>使用尼龙缝线缝合手术切口完成操作。</li>
	<li>术后将小鼠置于清洁笼盒内的加热垫上恢复 0.5 至 1 小时，之后放回原笼盒。</li>
	<li>在制备急性脑切片前，维持小鼠于 12 小时昼夜循环条件下饲养 6 至 8 周。 
	注意：为避免因免疫反应导致细胞损伤和突触丢失，若需注射多种病毒载体，应同时进行或在初次注射后 2–3 小时内完成。iGluu 的注射坐标依据 Paxinos 和 Franklin29 脑图谱选定，对应于 M1 运动皮层。对注射后脑组织进行免疫染色显示，在同侧和对侧纹状体以及对侧 M1 和 S1 皮层中可见大量但多数分离良好的轴突及轴突曲张体。</li>
</ol>
2. 搜索表达谷氨酸传感器 iGluu 的谷氨酸能终末
<ol>
	<li>校准模式
	<ol>
		<li>使用以下设置准备 sCMOS 相机及相机控制软件。在读出页面中，设置像素读出速率：560 MHz（= 最快读出速度），灵敏度/动态范围：bit，杂散噪声滤波器：是，重叠读出：是。在像素合并/感兴趣区域页面中，选择全屏。</li>
		<li>准备一张载玻片，其上含有在盖玻片下的 5 mg/mL 荧光黄（LY）液滴。</li>
		<li>将 LY 载玻片置于 63 倍物镜下，打开激光快门，并使用以下设置进行连续采集：像素合并：1x1，触发模式：内部，曝光时间：最小值（待确定）。</li>
		<li>调节激光功率，以产生直径为 4 µm 的荧光光斑（图像中不应包含饱和像素）。</li>
		<li>为校准激光定位系统，在激光定位软件中选择以下设置：光斑直径：10，扫描速度：43.200 kHz。点击右侧面板上的开始图像采集按钮。在序列页面中设置运行次数：0，运行延迟：0，并选择TTL 触发运行选项。点击校准按钮，并根据采集屏幕左上角显示的说明校准激光控制软件。</li>
		<li>如果系统使用独立的相机与激光控制软件，则从相机采集窗口获取截图并发送至激光控制软件，以重新计算 XY 坐标。若软件安装在不同计算机上，则使用视频采集器将图像导入激光控制软件。激光控制软件需要 XY 缩放因子和偏移量信息。为此，确定图像在激光控制程序采集窗口中的左上角、左下角和右下角的坐标。根据以下公式计算缩放因子：X 因子 = (X 右下角 – X 左下角)/2048，X 偏移量 = X 左下角，Y 因子 = (Y 左上角 – Y 左下角)/2048，Y 偏移量 = Y 左下角。</li>
		<li>在校准过程结束时，创建一个 267x460 像素的矩形感兴趣区域（ROI），将其移至屏幕中心，然后点击开始序列按钮。</li>
		<li>恢复以下相机控制软件设置：像素合并：2x2，触发模式：外部曝光，曝光时间：最小值（待确定）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自发荧光校正模式 
	注意：在活跃突触末梢周围环境中，谷氨酸的基础浓度通常低于 100 nM14,30,31,32,33,34。因此，在无突触谷氨酸释放的情况下，任何谷氨酸传感器（尤其是低亲和力传感器如 iGluu）的荧光信号都较弱。尽管如此，即使在静息状态下仍可检测到部分 iGluu 荧光，但必须将其与组织自发荧光区分开来。473 nm 照明会同时激发 iGluu 荧光和自发荧光（图 1A–C）。后者覆盖较宽的波长范围，而 iGluu 荧光则局限于 480–580 nm（峰值在 510 nm）。自发荧光校正基于使用不同高通滤光片采集两幅图像。
	<ol>
		<li>按其他文献所述方法预先制备脑片35。保持脑片处于可用状态。</li>
		<li>将脑片转移至记录室，浸入含氧人工脑脊液（ACSF）中，其成分为：125 mM NaCl、3 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、25 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM 葡萄糖（pH 7.3，303 mOsm/L），并补充 0.5 mM 丙酮酸钠、2.8 mM 抗坏血酸钠和 0.005 mM 谷胱甘肽。灌流速率为 1–2 mL/min。维持浴液温度在 28–30 °C。</li>
		<li>在 20 倍水浸物镜下定位背侧纹状体。使用尼龙网格将脑片固定在铂金丝网上，以最小化组织移动。切换至 63x /NA 1.0 水浸物镜。选择反射 473 nm 光（二向色镜）并透过波长&#62;510 nm 的光（发射滤光片）的滤光片组合。</li>
		<li>使用 AD/DA 板及相应控制软件同步照明、刺激和图像采集。设置触发程序，控制激光曝光时间为 180 ms，图像采集时间为 160 ms。使用激光定位装置将激光束引导至预设数量的点，并设定扫描速度和光斑大小参数。</li>
		<li>使用 510 nm 高通滤光片采集同时包含自发荧光和 iGluu 阳性结构的图像（&#34;黄图像&#34;）。</li>
		<li>使用 600 nm 高通滤光片采集仅含自发荧光的图像（&#34;红图像&#34;）。</li>
		<li>使用最亮 10 个像素和最暗 10 个像素的平均强度定义范围，对红图像和黄图像进行缩放。执行减法运算（&#34;黄图像减红图像&#34;），并对相减后的图像重新缩放，生成标准 8 位 tif 文件，以便于观察目标突触小结（图 1D）。该图像包含来自 iGluu 阳性结构的亮像素、背景的灰像素以及具有自发荧光结构的暗像素。 
		注意：使用给定设备时，基础荧光平均值（F）将低于 700 A.U.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>突触小结搜索模式 
	注意：iGluu 阳性像素可能属于轴突树中功能不同的结构，例如不同等级的轴突分支、分叉位点、囊泡耗竭后的膨大结构或完全活跃的膨大结构。然而，仅通过视觉检查几乎无法识别功能性突触末梢。因此，每个谷氨酸能突触末梢必须通过其对电去极化的响应性来确认。对刺激无响应的位点应予以剔除。诱导皮质纹状体轴突释放谷氨酸的生理手段是引发动作电位。这可通过使用具有适当光谱特性的通道视紫红质，或通过电刺激由 iGluu 自身标记的轴突来实现。为避免意外激活视蛋白，我们优先选择后者。
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪（四步模式）从硼硅酸盐玻璃毛细管制备刺激电极。内尖端直径应约为 1 µm。当充满 ACSF 时，电极电阻应约为 10 MΩ。</li>
		<li>为诱导附着于同一轴突上的一组突触小结发生动作电位依赖性谷氨酸释放，使用 63 倍放大倍数、510 nm 发射滤光片及相减后的图像，将玻璃刺激电极放置在荧光膨大结构附近。避免靠近其他额外的轴突。</li>
		<li>开启刺激器，向刺激电极输送去极化电流脉冲。使用约 2 µA 的电流强度（不超过 10 µA）。</li>
		<li>启动多通道浴液给药系统，其中一个通道输送标准灌流液，其他通道输送必要的离子通道、转运体或膜受体阻断剂。控制记录位置的灌流，然后切换至河豚毒素（TTX）通道（灌流液加 1 µM TTX）。2–3 分钟后，再次刺激目标突触小结，但此时无动作电位产生。释放直接由电压门控钙通道介导的钙内流引起。</li>
		<li>通过调节刺激器上的强度旋钮，调整刺激电流，使其引发的反应与动作电位引发的反应相似。通常，对于 0.5 ms 的去极化，刺激电流约为 6 µA。</li>
		<li>为基本测试制备效果，应用 0.5 mM CdCl2。该钙通道阻断剂可完全抑制突触谷氨酸释放，从而验证直接诱发的谷氨酸信号具有钙依赖性。 
		注意：以下一般性建议可能有助于提高在纹状体中进行单突触实验的成功率。为选择具有完整释放机制的谷氨酸能突触末梢，膨大结构应满足：(i) 具有平滑的纺锤形形态；(ii) 不与轴突分叉相关；(iii) 在&#34;黄图像&#34;上比其他结构更亮；(iv) 位于纹状体神经毡内而非纤维束中；(v) 位于非常细的轴突分支上；(vi) 不位于脑片较深层区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 谷氨酸释放与清除的可视化
<ol>
	<li>记录模式 
	注意：在减去自发荧光（步骤 2.2）并进行几次初步测试以确认目标突触小结的反应性（步骤 2.3）后，即可开始数据采集。单个轴突末梢释放谷氨酸所引发的反应可直接在图像中观察到（图 2），无需进一步使用分析工具。然而，立即提取一些突触功能的基本指标已被证明非常方便（图 3）。这些信息对于决定后续实验流程至关重要，例如特定末梢类型的筛选、亨廷顿病（HD）相关改变的快速评估、试验次数与频率，或通过灌流系统施加药物的方案。还可能需要处理偶尔出现的伪迹。首先，描述数据记录的标准设置。
	<ol>
		<li>使用显微镜的 XY 驱动装置，将待测的 iGluu 阳性突触小结移至视野中心附近。点击中止采集按钮停止图像采集。在最后获取的图像上，用鼠标左键点击静息状态下突触小结的中心，以确定其 XY 位置。设定光标的位置坐标将显示在采集窗口底部的状态栏中。</li>
		<li>利用校准数据（步骤 2.1.6），计算激光束应照射的位置坐标，以激发 iGluu 荧光。使用以下公式：X 激光 = X 相机 × X 因子 + X 偏移，Y 激光 = Y 偏移 – Y 相机 × Y 因子。在执行此重新计算时，需注意相机的垂直或水平翻转设置。</li>
		<li>在激光控制软件中使用计算出的坐标创建一个单点序列。为此，在激光控制软件的序列页面中的添加到序列框中选择点。设置延迟触发开始时间为 10 µs，激光脉冲时间为 180 ms。将鼠标移至计算出的坐标位置，点击左键。</li>
		<li>在激光控制软件中选择以下设置：运行次数：0，运行延迟：0，序列：TTL 触发运行。然后点击启动序列。</li>
		<li>在相机控制软件中选择以下设置：在 binning/ROI 页面，设置图像区域：自定义，像素合并：2x2，高度：20，宽度：20，左侧：静息 iGluu 阳性区域的 X 坐标减去 10 像素，底部：静息 iGluu 阳性区域的 Y 坐标减去 10 像素，采集模式：动力学序列，动力学序列长度：400，曝光时间：0.0003744 s（最小值）。采用这些设置，采集速率为 2.48 kHz。</li>
		<li>选择触发模式：外部触发。在相机控制软件中点击获取信号，并启动为触发设备设定的实验方案。</li>
		<li>执行实验方案试验，其时间线如下：0 ms – 开始试验，1 ms – 开始激光照射，20 ms – 相机开始图像采集，70 ms – 开始第一次电刺激，120 ms – 开始第二次电刺激，181 ms – 结束试验（激光和相机关闭）。因此，在一次试验中，相机以 2.48 kHz 的频率采集 400 帧图像。有关电刺激的详细信息，请参见步骤 2.3.3 和 2.3.5。</li>
		<li>为确保突触前囊泡池有足够恢复时间，应以 0.1 Hz 或更低的重复频率执行试验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离线构建谷氨酸瞬变信号，并快速评估谷氨酸释放与清除，以识别病理性突触
	<ol>
		<li>启动评估程序。此处我们使用自行开发的软件 SynBout v. 3.2（作者：Anton Dvorzhak）。以下步骤用于从 iGluu 荧光增强的像素中构建 ΔF/F 瞬变信号，如图 2 视频所示。</li>
		<li>为确定突触小结大小，计算静息状态下感兴趣区域（ROI）荧光强度的均值和标准差（SD，记为 F），即在刺激开始前的荧光值。确定并框选荧光强度 F&#62;均值 + 3 SD 的像素区域（图 3A）。假设该超阈值区域呈圆形，计算其虚拟直径（单位：µm）。</li>
		<li>将 ΔF 定义为峰值强度值与 F 的差值。绘制刺激电流和 ΔF/F 随时间变化的曲线（图 3B）。计算刺激前静息状态下 ΔF/F 的标准差（SD），以及&#34;峰值幅度&#34;。选择 ΔF/F 峰值幅度超过静息状态 3 SD 的像素，进行单指数拟合以分析从峰值开始的衰减过程，并确定 ΔF/F 衰减的时间常数 TauD。</li>
		<li>为估计特定突触的&#34;最大幅度&#34;，选择 ΔF/F 值最高的像素。该像素通常位于静息突触小结 iGluu 荧光区域内或其边界附近。&#34;最大幅度&#34;是反映单个突触清除机制所承受谷氨酸负荷的最佳指标。</li>
		<li>为估计 iGluu 信号的空间扩展范围，确定所有超阈值像素组合形成的虚拟圆的直径，该直径称为&#34;扩散范围&#34;。而&#34;峰值扩散&#34;则指平均扩散瞬变曲线的峰值（图 3C，虚线红框之间的差值）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可能伪迹的校正 
	注意：电去极化伴随微电极内液向外流动，可能导致组织轻微位移。为区分刺激引起的 iGluu 变化与失焦导致的图像偏移，可采用以下方法识别并消除位移伪迹（图 4）。
	<ol>
		<li>分析来自显示位移迹象的 ROI 中超阈值像素的空间特征（图 4F–H）。</li>
		<li>查找位于静息状态下最初确定的突触小结边界之外的像素（图 4F–H，红色框标出）。</li>
		<li>识别可能存在的负像素强度值（图 4I, J）。任何方向为负、幅度大于刺激前均值 ± 3 SD 的 ΔF/F 均应视为伪迹，相关记录应予以剔除。</li>
		<li>为避免失焦伪迹，应将刺激电极置于突触小结的前外侧，采用双相电刺激，并尽量降低刺激强度/持续时间。 
		注意：失焦伪迹也可能源于相机。若相机未牢固固定于显微镜上，可能因相机冷却系统微小振动而产生振荡，最常见的是在 ΔF/F 图像中出现以 50 Hz 频率旋转的&#34;阴阳&#34;图案。此类振动可通过数学方法从荧光信号中减去，但最终测量质量将高度依赖于记录时间。</li>
		<li>将相机牢固固定于显微镜，确保无振动。若仍存在振动，可在相机与显微镜适配器之间加装橡胶垫圈。 
		注意：不能忽视所关注突触周围纹状体神经毡中可能存在不表达 iGluu 的谷氨酸能曲张体，因此它们不可见。在共激活情况下（更可能在无 TTX 时发生），所记录的目标突触小结瞬变信号可能受到溢出效应影响。同样适用于失焦的 iGluu 表达末梢。此时典型现象是荧光瞬变源自更广泛的区域。由于该反应可被 TTX 消除，因此可将其解释为由非特异性多纤维激活引起的非特异性反应。</li>
		<li>为校正此类非特异性多纤维反应，请遵循图 5中所述程序。使用视野边界的像素荧光信号。为最小化背景反应，应尽量降低刺激强度和持续时间，或使用 TTX。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这些实验涉及一个普遍关注的问题——突触的独立性及其在神经退行过程中可能发生的丧失，我们描述了一种新方法，用于在老年（&#62;1年）小鼠的急性脑切片中识别受影响的突触。得益于近年来新推出的谷氨酸传感器iGluu所具有的更优动力学特性，这些实验以前所未有的方式揭示了突触谷氨酸释放与摄取之间的关系。
尽管在几乎所有关于癫痫、中风和神经退行性疾病的综述中都提到谷氨酸诱导的兴奋性毒性可导致神经元丢失和突触修剪这一假说，但谷氨酸清除对突触功能与维持的影响尚未被充分阐明38,39,40,41。然而，现有证据的实际支持力度可能比文献中所预期的更为有限。此外，由于所选用的实验工具在空间和时间分辨率上的局限性，在使用整体刺激和记录技术解读结果时可能带来混淆42,</s...

属于一个&#34;单突触连接&#34;（即两个神经细胞之间的连接）的每个突触终末的相对作用，通常通过其对突触后神经元初始段的影响来评估1,2。对突触后神经元的胞体和/或树突记录是目前最常用且最具成效的方法，用于从自上而下或纵向的视角阐明信息处理机制3,4,5。然而，星形胶质细胞的存在及其各自独立且（在啮齿类动物中）互不重叠的区域，可能提供一种基于突触部位局部信号交换、整合与同步机制的横向视角6,7,8,9,10。
众所周知，星形胶质细胞在神经退行性疾病的发病机制中通常起着重要作用11,12，特别是在谷氨酸能突触的维持和可塑性方面具有关键作用13,14,15,16。因此可以推测，突触功能的改变可能与来自不同起源的传入纤维所共享靶区中星形胶质细胞的状态密切相关。为了进一步探究健康与疾病状态下由靶区或星形胶质细胞介导的局部调控机制，有必要对单个突触进行评估。本研究方法旨在估算功能性谷氨酸释放与清除指标的范围，并建立可用于识别与运动启动最密切相关脑区（即首先是运动皮层和背侧纹状体）中功能异常（或已恢复）突触的判断标准。
纹状体缺乏固有的谷氨酸能神经元。因此，相对容易识别来自纹状体外的谷氨酸能传入纤维。这些传入纤维主要起源于丘脑内侧核和大脑皮层（详见17,18,19,20）。皮层-纹状体突触由位于皮层第2/3层和第5层的锥体神经元的轴突形成。这些轴突通过构成锥体束（PT）的纤维系统形成双侧的端脑内（IT）连接或同侧连接。此外，已有研究提示IT型和PT型终末在谷氨酸释放特性及大小上存在差异21,22。基于这些数据，人们也可能预期其在谷氨酸处理方面存在某些差异。
纹状体是亨廷顿病（Huntington's disease, HD）中受累最严重的脑区5。人类HD是一种严重的遗传性神经退行性疾病。Q175小鼠模型为研究HD的运动迟缓-强直型的细胞基础提供了机会，该表型与帕金森综合征具有许多共同特征。从约1岁开始，纯合子Q175小鼠（HOM）表现出运动迟缓的迹象，这通过在开放场地中测量其静止不动的时间得以证实23。本研究在杂合子Q175小鼠（HET）中进行的实验不仅证实了先前在HOM小鼠中观察到的运动功能缺陷，还进一步显示，这些运动缺陷伴随纹状体皮层突触终端附近星形胶质细胞兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）水平降低24。因此，有研究假设，星形胶质细胞对谷氨酸摄取能力的缺陷可能导致相应突触的功能障碍甚至丢失25,26。
本文介绍了一种新方法，可用于评估单个突触中谷氨酸清除速率与释放的神经递质总量之间的关系。新型谷氨酸传感器iGluu在皮质-纹状体锥体神经元中表达，由Katalin Török27开发，是对先前报道的高亲和力但响应较慢的谷氨酸传感器iGluSnFR28的改进版本。这两种传感器均为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的衍生物。其光谱与动力学特性详见Helassa等人的研究27。简而言之，iGluu是一种低亲和力传感器，具有快速的去激活动力学特性，因此特别适用于研究谷氨酸释放突触末端的谷氨酸清除过程。iGluu的解离时间常数通过停流装置测定，在20 °C时Tauoff为2.1 ms，当外推至34 °C时则缩短至0.68 ms27。在34 °C条件下，利用双光子显微镜对器官型海马培养物CA1区的单个Schaffer侧支末梢进行螺旋激光扫描探测，测得其信号衰减的平均时间常数为2.7 ms。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜</td><td>WPI</td><td>PZMIII</td><td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td></tr><tr><td>高速钻孔设备</td><td>Stoelting</td><td>514439V</td><td>Foredom K1070 cromoter Kit</td></tr><tr><td>注射系统</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 5 &amp;micro;l</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>75RN Syr (26s/51/2)</td></tr><tr><td>激光定位系统</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA-40</td><td>UGA-40</td></tr><tr><td>用于 iGluu 激发的蓝光激光器</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-473-020-S</td><td>473 nm laser</td></tr><tr><td>473 nm 二向色镜</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>ROE TB-355-405-473</td><td>Dichroic</td></tr><tr><td>1P 直立显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1066-600</td><td>Axioskop 2 FS Plus</td></tr><tr><td>63x/1.0 物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>421480-9900</td><td>W Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>4x 物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>44-00-20</td><td>Achroplan 4x/0,10</td></tr><tr><td>iGluu 用二向色镜</td><td>Omega optical</td><td>XF2030</td><td></td></tr><tr><td>iGluu 发射滤光片</td><td>Omega optical</td><td>XF3086</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Omega optical</td><td>QMAX_DI580LP</td><td></td></tr><tr><td>自发荧光扣除用发射滤光片</td><td>Omega optical</td><td>QMAX EM600-650</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 相机</td><td>Andor</td><td>ZYLA4.2PCL10</td><td>ZYLA 4.2MP Plus</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Andor</td><td>4.30.30034.0</td><td>Solis</td></tr><tr><td>AD/DA 转换器</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895035</td><td>InstruTECH LIH8+8</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895153</td><td>TIDA5.25</td></tr><tr><td>电极定位系统</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-200</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>电刺激器</td><td>Charite workshops</td><td>STIM-26</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td>Vibrotome</td></tr><tr><td>Brown/Flaming 型拉制仪</td><td>Sutter Instr</td><td>SU-P1000</td><td>P-1000</td></tr><tr><td>注射移液管用玻璃管</td><td>WPI</td><td>1B100F3</td><td></td></tr><tr><td>刺激移液管用玻璃管</td><td>WPI</td><td>R100-F3</td><td></td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Abcam</td><td>ab120054</td><td>TTX</td></tr><tr><td>iGluu 质粒</td><td>Addgene</td><td>106122</td><td>pCI-syn-iGluu</td></tr><tr><td>Q175 小鼠</td><td>Jackson Lab</td><td>27410</td><td>Z-Q175-KI</td></tr></tbody></table>

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

突触是高度区室化的功能单位，彼此独立运作。在亨廷顿病（HD）及其他神经退行性疾病中，由于谷氨酸清除不足，可能导致“溢入”和“溢出”效应，从而破坏这种独立性。已有研究指出，突触前末梢和/或树突棘的星形胶质细胞覆盖异常，以及谷氨酸释放位点处谷氨酸转运体簇的尺寸减小，与导致运动障碍/运动过多症状的疾病发病机制相关。然而，导致HD中谷氨酸能突触功能障碍的机制尚不明确。通过改进并应用突触成像技术，我们获得了揭示运动启动障碍新机制的数据。本文描述了一种相对低成本的方法，利用新型基因编码的超快谷氨酸传感器iGluu、宽场光学系统、科学级CMOS（sCMOS）相机、473 nm激光器及激光定位系统，在来自年龄匹配的健康或患病小鼠的急性脑片中实现单突触分辨率，以评估皮质-纹状体突触的状态。通过单个或多个像素构建谷氨酸瞬变信号，用于估算：i）基于活性区附近谷氨酸浓度[Glu]最大升高值所反映的谷氨酸释放水平；ii）通过突触周围[Glu]衰减时间常数（TauD）所反映的谷氨酸摄取能力。静息状态下末梢的大小差异以及短时程可塑性的不同模式，被用作识别皮质-纹状体末梢属于端脑内神经元（IT）通路或锥体束（PT）通路的判据。利用这些方法，我们发现，在出现症状的HD小鼠中，约40%的PT型皮质-纹状体突触表现出谷氨酸清除不足，提示这些突触可能易于遭受兴奋性毒性损伤。该结果强调了TauD作为具有运动减少表型的亨廷顿病小鼠中功能障碍突触生物标志物的重要价值。

鉴定两种类型的皮层-纹状体谷氨酸能曲张体 
IT 和 PT 传入纤维分别起源于第 2/3 层和第 5 层，并在同侧及对侧（仅 IT 末梢）纹状体中表现出不同的分支和终止模式。目前对于在运动启动过程中常见的重复刺激条件下谷氨酸释放与清除的特性仍知之甚少，但已有充分证据表明，相应的谷氨酸释放型曲张体在大小上存在差异22。通过采用大小判别标准，研究发现 IT 和 PT 末梢在短期可塑性方面表现出截然不同的形式24。在 50 ms 刺激间隔下，较小的 IT 末梢倾向于出现成对脉冲抑制（PPD），而较大的 PT 末梢则表现出成对脉冲易化。这种差异在更短的刺激间隔（20 ms）以及连续 6 次脉冲刺激序列中均被观察到。图 3 和 图 6 展示了这些实验结果，其中通过动作电位机制在生理 Ca2+/Mg2+ 浓度条件下诱发了突触谷氨酸的释放。
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我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS 相机采集信号，并使用焦点激光照射装置进行局部刺激。

突触是高度区室化的功能单位，彼此独立运作。在亨廷顿病（Huntington's disease, HD）及其他……

对表达快速谷氨酸传感器的单个突触进行高分辨率成像，可检测到神经递质释放与摄取之间的局部不匹配。在疾病情况下，该方法可用于识别功能异常的突触。为校正自发荧光，首先将目标小鼠的脑切片放入单光子显微镜的记录室中。将切片浸入充氧的人工脑脊液中，使用20倍水浸物镜定位背侧纹状体。用尼龙网格将切片固定在铂金丝网上以最大限度减少组织移动，然后切换至63倍水浸物镜。使用510纳米的高通滤光片，同时采集自发荧光和谷氨酸传感器阳性结构的图像。使用600纳米的高通滤光片，单独获取自体荧光结构的第二幅图像。为定义范围，利用最亮的10个像素和最暗的10个像素的平均强度来调整红色和黄色图像。然后，进行黄色图像减去红色图像的减法运算，并对相减后的图像重新定标，生成标准的8位TIFF文件，以便于观察目标突触小结。为了搜索有反应的突触小结，您需要使用合适的玻璃微电极进行电刺激。使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备刺激电极，使其尖端内径约为1微米。为了探测一组候选突触小结是否依赖动作电位释放谷氨酸，请选择63倍放大倍数和510纳米发射滤光片。加载减影图像，以便将玻璃刺激电极放置在荧光曲张体附近，同时避免靠近其他轴突。将电极置于与最大分叉或位于切片较深区域内的分配相关的曲张体处。将刺激电极放置在目标突触小结附近，然后关闭光源，因为记录必须在完全黑暗的条件下进行。然后，打开多通道浴槽灌流系统，其中一个通道输送标准浴液，其他通道输送必要的离子通道、转运体或膜受体阻断剂，包括用河豚毒素（tetrodotoxin）阻断动作电位的产生。控制记录位点的灌流速度，并开启刺激器，向刺激电极输送 2 至 10 微安的去极化电流脉冲。此时，神经递质的释放由电压门控通道介导的钙离子直接内流所激活。为了在清除过程中可视化谷氨酸的释放，使用显微镜的 X、Y 驱动装置，将经测试的谷氨酸传感器阳性小体移至视野中心附近。停止采集后，用鼠标左键单击图像以确定静息小体中心的 X、Y 位置。设定光标的 X、Y 坐标将被显示出来。根据校准数据，使用所示公式计算激光束应照射的位点坐标，以激发谷氨酸传感器荧光。在激光控制软件中创建单点序列时，在序列页面的“添加到序列”框中选择“点”，并将运行次数和运行延迟设置为零，序列设置为在TLL时运行。然后，点击“开始序列”。在相机控制软件中，选择合适的成像参数，并将触发模式设为外部触发。在相机控制软件中点击“采集信号”。然后启动触发装置对应的实验方案，并按照适当的时间线执行一次实验方案试验，使相机在一次试验中以 2.48 千赫兹的频率采集 400 帧图像，重复频率为 0.1 赫兹或更低。为了识别病理性突触，启动高程程序，计算所选感兴趣区域在静息状态下的荧光强度均值及标准差。将静息状态下荧光强度大于均值加三个标准差的像素所占据的区域框出，并假设该阈上区域呈圆形，据此确定其虚拟直径（单位：微米）。以荧光强度相对于时间的变化作图，即（实际荧光强度值减去静息状态荧光强度值）除以静息状态荧光强度值所得的差值。确定荧光反应的峰值幅度。对荧光反应峰值后的衰减过程进行单指数拟合，确定衰减的时间常数 TauD。为了估算特定突触处的最大幅度，应选择荧光强度变化最大的像素点，该点最能反映突触清除机制所承受的谷氨酸负荷量。利用突触大小和成对脉冲比标准，单突触成像可用于鉴定两类皮质-纹状体突触。在20至50毫秒的刺激间隔下，较小的中间肠-头端突触终端倾向于表现出成对脉冲抑制，而较大的锥体束突触终端则表现出成对脉冲易化。在野生型小鼠和表达亨廷顿表型的小鼠上进行的运动行为测试显示，开放场中总运动路径长度与跨步潜伏期之间存在显著正相关。此外，单突触谷氨酸成像显示，有症状的亨廷顿病小鼠在单突触刺激引起的谷氨酸反应中，其突触旁谷氨酸衰减速率存在缺陷，表现为 TauD 值升高。在野生型动物中，只有在施加一种选择性、不可转运的谷氨酸摄取抑制剂后，才会观察到类似的延长现象。通过对野生型小鼠和表达亨廷顿病症状的小鼠脑片中特定 TauD 值出现概率的评估发现，在野生型动物中，TauD 从不超过 15 毫秒。然而，在有症状的亨廷顿病中，尽管释放的谷氨酸量有减少的趋势，仍有40%的突触其TauD值介于16至58毫秒之间。因此，TauD可被视为亨廷顿病中功能障碍突触的生物标志物，并可用于验证针对星形胶质细胞谷氨酸转运的实验中功能恢复的效果。该针对单个皮质-纹状体突触谷氨酸监测的方案，可能有助于阐明谷氨酸摄取缺陷在神经退行性疾病发病机制中的作用。单突触成像对于研究兴奋性突触的突触前位点尤为有用。

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正常小鼠和亨廷顿小鼠急性脑切片中谷氨酸释放和服用的单突触指标

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本视频展示了在小鼠脑切片中评估单个皮质-纹状体突触的谷氨酸释放与清除过程。通过电刺激促进突触处谷氨酸的释放。释放的谷氨酸会改变传感器蛋白的荧光信号，该荧光随时间逐渐衰减，从而反映谷氨酸的释放效率与清除能力。...

分析小鼠脑片中单个神经元突触的谷氨酸释放与清除

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

我们描述了一种结合局灶性紫外光诱导激活神经活性化合物、全细胞膜片钳技术以及多光子成像的方法，用于在小鼠脑急性组织切片的海马神经元树突和树突棘中检测细胞内钠离子瞬变。...

结合紫外光介导的谷氨酸局灶性解笼技术进行CA1锥体神经元多光子细胞内钠离子成像

在此，我们介绍一种用于精确测量张力性和时相性细胞外谷氨酸变化的空间和时间分辨方法的实验装置搭建、软件操作及数据分析流程 体内 使用酶联微电极阵列（MEA）。...

利用基于酶的生物传感器测量阿尔茨海默病小鼠模型中的紧张性和时相性谷氨酸

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

本方案介绍了一种从成年及衰老小鼠海马组织制备急性脑片的方法，该方法采用经心脏灌注及冰冻NMDG-aCSF溶液进行脑片切割，以减少组织的缺氧损伤。所获得的脑片可在数小时内保持良好的活性，适用于长期的膜片钳和场电位记录实验。...

最小化成年及衰老小鼠海马脑片中的缺氧现象

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。...

一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

了解利用iGluu荧光传感器和双光子显微镜在成年小鼠急性脑切片中评估单突触谷氨酸释放与清除平衡的方法。该技术可识别亨廷顿病模型中功能失调的突触，为神经退行性疾病研究提供重要工具。

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

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