本方法描述了从培养细胞和动物组织中制备样品，提取并衍生化样品中的辅酶A，随后通过高效液相色谱法纯化衍生化的辅酶A，并利用吸光度或荧光检测进行定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
新兴研究发现，细胞内辅酶A（CoA）的供应可能受限，从而对细胞生长、代谢和存活产生不利影响。由于CoA在细胞中含量相对较低，且游离CoA会动态转化为CoA硫酯，而后者又参与多种代谢反应，因此对细胞内CoA的检测具有挑战性。本文介绍了一种方法，可在样品制备过程中规避潜在的技术难点，建立具有宽线性检测范围的检测方案，适用于众多生物医学实验室使用。
引言
辅酶A（CoA）是所有生物体必需的辅因子，由泛酸（也称为泛酸盐，即泛酸的盐形式）或维生素B5合成。CoA是细胞内有机酸的主要载体，包括短链酸如乙酸和琥珀酸、支链酸如丙酸和甲基丙二酸、长链脂肪酸如棕榈酸和油酸、极长链脂肪酸如多不饱和脂肪酸，以及外源性化合物如丙戊酸。有机酸通过酶促反应与CoA形成硫酯键，从而作为底物参与100多种中间代谢反应1。CoA硫酯还具有变构调节和转录激活的功能。目前人们已认识到2，细胞内总CoA水平受到调控3,4，因此CoA的可利用性可能成为限制因素，而CoA缺乏可能导致严重后果，例如影响CoA生物合成的遗传性疾病即为明证5。泛酸激酶催化CoA生物合成的第一步（图1），由PANK2基因突变引起的泛酸激酶相关神经退行性疾病称为PKAN6。CoA合酶由COASYN基因编码，催化CoA生物合成的最后两步（图1），而COASYN基因突变导致的CoA合酶蛋白相关神经退行性疾病称为CoPAN7。PK....
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方案
本方案中涉及的动物实验程序均按照方案323和556执行，并已获得圣裘德儿童研究医院机构动物照护与使用委员会的特别批准。
1. 溶液的配制
注意：配制所有溶液及实验步骤中提及之处均应使用超纯水。
- 用水配制 1 mM 氢氧化钾（KOH）溶液。
- 用水配制 0.25 M 氢氧化钾（KOH）溶液。
- 用水配制 1 M Trizma-HCl 溶液，并调节 pH 至 8.0。
- 用乙腈（Optima 级）配制 100 mM 单溴二苯并呋喃（mBBr）溶液。mBBr 储存液在 -20 °C 避光保存可稳定数月，因为光照可使单溴二苯并呋喃光解为二苯并呋喃26。
- 配制固相萃取（SPE）柱洗涤缓冲液：50% 甲醇（Optima 级）+ 2% 乙酸。
- 配制固相萃取（SPE）柱洗脱缓冲液：含 50 mM 甲酸铵的 95% 乙醇（HPLC 级）。
2. 辅酶A-联氨标准品的制备
- 从信誉良好的供应商（例如 Avanti Polar Lipids, Inc.）购买高质量的辅酶A（CoA）标准品。
- 在20 mM Tris缓冲液（pH 8）中配制高浓度的CoA储备液。通过在λ26....
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结果
已开发出一种相对快速且可靠的检测培养细胞和组织中总辅酶A（CoA）的方法，该方法通过使用mBBr将CoA的巯基衍生为荧光产物，随后采用反相高效液相色谱（HPLC）纯化衍生化的CoA-双甲胺（CoA-bimane）。首先建立标准曲线：分别注入已知且递增量的CoA-bimane标准品，将CoA-bimane色谱图中峰面积对输入的CoA-bimane量作图（图4）。CoA-bimane在λ393 nM处有吸收峰最大值，典型的HPLC谱图显示了在C18 HPLC柱上使用表1中的洗脱程序时CoA-bimane标准品的保留时间（图3）。通过测定吸光度或荧光单位检测得到的CoA-bimane代表性标准曲线分别如图4A和图4B所示。图4A
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讨论
本文展示了一种可靠且逐步操作的方法，用于定量细胞和动物组织中的总辅酶A（CoA），该方法具有较宽的线性检测范围，可在配备紫外吸收或荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC）的大多数实验室中实现。另一种方法是质谱法，常用于检测辅酶A及其硫酯类物质，但由于仪器成本高昂，且需要专门的方法开发与数据分析知识，因此应用并不广泛。目前市场上无法购得适用于质谱法定量游离CoA的同位素标记CoA内标物，且质谱仪对游离CoA的检测灵敏度远低于乙酰-CoA等CoA硫酯类物质。因此，除非将质谱输出数据与CoA标准校准曲线进行比对，否则游离CoA的含量往往被严重低估。
我们将本文所述方法与实验室先前使用的一种不同方法进行了比较，发现采用本方法从小鼠肝脏中回收的辅酶A（CoA）含量更高，为123.4 ± 7.9 pmol/mg湿重，而此前使用衍生化游离CoA并加以放射性标记的酶法测得的结果约为80 pmol/mg湿重28。本文所描述的总CoA测定方法相比实验室先前使用的方法显著更为简便、快速且易于控制28。此前的方法.......
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披露
MWF、CS 和 SJ 撰写了论文，MWF 和 CS 提供了数据和图表，COR 设计了实验并对稿件进行了关键性审阅。SJ 和 COR 是一项待审批专利申请（PCT/US17/39037）"泛酸激酶的小分子调节剂”的发明人，该专利申请由圣裘德儿童研究医院持有，涵盖本文中提及的化合物 PZ-2891。
致谢
作者感谢CoA Therapeutics, Inc.（BridgeBio LLC的子公司）、美国国立卫生研究院资助项目GM34496以及美国黎巴嫩叙利亚联合慈善协会提供的赞助研究经费。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(2-吡啶基)-乙基硅胶固相萃取柱 | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| 辅酶A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å 高效液相色谱柱 | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| 单溴二氯荧光素 | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip探头式组织破碎仪 | Omni International | 32750H | |
| Parafilm封口膜 | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125电动转子-定子匀浆器 | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X离心管滤器 | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475荧光检测器 | Waters | 2475 | |
| Waters 2489紫外-可见光检测器 | Waters | 2489 | |
| Waters e2695分离模块 | Waters | e2695 |
参考文献
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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重印与许可
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