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方法文章

细胞和组织中辅酶A的定量分析

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DOI：

10.3791/60182

⸱

2019年9月27日

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

通讯作者： Suzanne Jackowski <suzanne.jackowski@stjude.org>

本文内容

摘要

本方法描述了从培养细胞和动物组织中制备样品，提取并衍生化样品中的辅酶A，随后通过高效液相色谱法纯化衍生化的辅酶A，并利用吸光度或荧光检测进行定量分析。

摘要

新兴研究发现，细胞内辅酶A（CoA）的供应可能受限，从而对细胞生长、代谢和存活产生不利影响。由于CoA在细胞中含量相对较低，且游离CoA会动态转化为CoA硫酯，而后者又参与多种代谢反应，因此对细胞内CoA的检测具有挑战性。本文介绍了一种方法，可在样品制备过程中规避潜在的技术难点，建立具有宽线性检测范围的检测方案，适用于众多生物医学实验室使用。

引言

辅酶A（CoA）是所有生物体必需的辅因子，由泛酸（也称为泛酸盐，即泛酸的盐形式）或维生素B5合成。CoA是细胞内有机酸的主要载体，包括短链酸如乙酸和琥珀酸、支链酸如丙酸和甲基丙二酸、长链脂肪酸如棕榈酸和油酸、极长链脂肪酸如多不饱和脂肪酸，以及外源性化合物如丙戊酸。有机酸通过酶促反应与CoA形成硫酯键，从而作为底物参与100多种中间代谢反应1。CoA硫酯还具有变构调节和转录激活的功能。目前人们已认识到2，细胞内总CoA水平受到调控3,4，因此CoA的可利用性可能成为限制因素，而CoA缺乏可能导致严重后果，例如影响CoA生物合成的遗传性疾病即为明证5。泛酸激酶催化CoA生物合成的第一步（图1），由PANK2基因突变引起的泛酸激酶相关神经退行性疾病称为PKAN6。CoA合酶由COASYN基因编码，催化CoA生物合成的最后两步（图1），而COASYN基因突变导致的CoA合酶蛋白相关神经退行性疾病称为CoPAN7。PKAN和CoPAN均为遗传性神经退行性疾病，均伴有脑内铁沉积，且疾病病理机制与CoA缺乏密切相关。

不同组织中总辅酶A（CoA）的细胞水平存在差异8，且在多种生理、病理及药理状态下，总CoA水平可升高或降低。在进食转为禁食的能量转换过程中，肝脏CoA水平升高9；在瘦素缺乏的肥胖小鼠中，肝脏CoA水平异常升高10。长期摄入乙醇会导致肝脏CoA水平下降11。在Pank2基因敲除小鼠模型中，脑内CoA水平在围产期降低，但在成年阶段脑内CoA含量恢复至野生型水平，表明发育过程中存在适应性CoA调节反应12。通过转基因或基因递送方法调控组织内CoA含量，可影响代谢和神经功能13,14,15。针对PKAN或CoPAN潜在疗法的临床前研究中，常将细胞或组织CoA水平的测定作为疗效评估指标16,17,18,19,20。对上述各种情况及其代谢或功能后果的评估，均需要一种定量检测总CoA的方法。

在许多实验室中，准确且可靠的生物样本中辅酶A（CoA）检测方法仍是一项技术挑战。遗憾的是，目前尚无可用的探针用于在完整细胞内评估或定量辅酶A或辅酶A硫酯类物质，尽管天然辅酶A硫酯的类似物已被广泛用作研究利用辅酶A酯的酶类机制的探针21。辅酶A含有游离的巯基（-SH）结构，其转化为辅酶A硫酯（或逆向转化）在细胞或动物组织转移至不同环境以及细胞裂解过程中发生迅速。细胞内存在多种酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A硫酯酶，介导辅酶A库内的相互转化；此外，其他以辅酶A硫酯为底物的酶在生物样本中仍保持活性，直至通过化学或物理手段被淬灭。酰基转移酶将酰基从辅酶A转移至肉碱，便是可改变辅酶A/辅酶A硫酯分布的反应网络中的一个实例。放射性示踪剂可用于测定细胞内辅酶A的合成速率。已有综述总结了当前用于测定生物样本中辅酶A及其衍生物的方法22，包括偶联酶法分光光度测定、高压液相色谱以及基于质谱的分析方法。然而，这些方法通常仅针对特定的辅酶A分子种类，无法反映总辅酶A库的变化情况。偶联酶法通常因检测灵敏度较低而需要较多的起始材料，且其线性范围有限。

本实验室已建立一种可靠的测定培养细胞和动物组织中总辅酶A（CoA）含量的方法。该策略在样品制备过程中将所有辅酶A硫酯水解，仅生成游离辅酶A，而非试图维持并分析全部种类的辅酶A分子。本方法整合了已发表的多种独立技术，包括样品前处理、辅酶A的衍生化、高压液相色谱（HPLC）后的纯化与鉴定，以及通过吸光度或荧光检测对衍生化后的辅酶A进行定量23,24,25。采用该方法获得的辅酶A测定结果，加深了我们对辅酶A调控机制的理解，并推动了针对辅酶A缺乏症治疗策略的开发。

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方案

本方案中涉及的动物实验程序均按照方案323和556执行，并已获得圣裘德儿童研究医院机构动物照护与使用委员会的特别批准。

1. 溶液的配制

注意：配制所有溶液及实验步骤中提及之处均应使用超纯水。

  1. 用水配制 1 mM 氢氧化钾（KOH）溶液。
  2. 用水配制 0.25 M 氢氧化钾（KOH）溶液。
  3. 用水配制 1 M Trizma-HCl 溶液，并调节 pH 至 8.0。
  4. 用乙腈（Optima 级）配制 100 mM 单溴二苯并呋喃（mBBr）溶液。mBBr 储存液在 -20 °C 避光保存可稳定数月，因为光照可使单溴二苯并呋喃光解为二苯并呋喃26。
  5. 配制固相萃取（SPE）柱洗涤缓冲液：50% 甲醇（Optima 级）+ 2% 乙酸。
  6. 配制固相萃取（SPE）柱洗脱缓冲液：含 50 mM 甲酸铵的 95% 乙醇（HPLC 级）。

2. 辅酶A-联氨标准品的制备

  1. 从信誉良好的供应商（例如 Avanti Polar Lipids, Inc.）购买高质量的辅酶A（CoA）标准品。
  2. 在20 mM Tris缓冲液（pH 8）中配制高浓度的CoA储备液。通过在λ260 nm处的分光光度吸光度（Ɛ = 16,800 M-1∙cm-1）测定或确认高浓度储备液中CoA的含量。加入4倍摩尔过量的mBBr，高速涡旋10秒。例如，对于缓冲液中10 mM的CoA，加入40 mM的mBBr。加入过量mBBr以确保所有CoA均被衍生化。
  3. 在室温下避光孵育4小时，不振荡，以完成CoA与mBBr的衍生化反应。mBBr与CoA的巯基反应，该反应依赖于pH和温度27。加入mBBr后，CoA转化为水溶性荧光（或紫外吸收）的辅酶A-双甲胺（CoA-bimane；图2）。
  4. 加入100 μL乙酸，高速涡旋10秒以终止反应。
  5. 在2,000 x g下离心15分钟，去除任何沉淀物。
  6. 使用固相萃取柱（SPE柱）对上清液进行纯化，以去除未反应的mBBr（如下所述）。在SPE柱纯化后（第5.8节），无需对洗脱液进行过滤或离心。
  7. 将含有CoA-bimane的SPE柱洗脱液收集至预先称重的试管中，用氮气吹干，称重，并用已知量的CoA-bimane构建标准校准曲线。
    1. 通过高效液相色谱法（HPLC，见下文）在λ260 nm（腺嘌呤部分）和λ393 nm（双甲胺部分）处进行吸光度检测，检查CoA-bimane标准品的纯度，并确认色谱图中两个峰的重合。
    2. 使用λ260 nm处的吸光度（Ɛ = 16,800 M-1∙cm-1）确认高浓度储备液中CoA-bimane标准品的含量。
  8. 使用CoA-bimane标准品记录HPLC保留时间，用于实验样品中CoA-bimane的鉴定。
  9. 将高浓度CoA-bimane标准品分装后避光保存于-20 °C，可保存长达2年。避免反复冻融。

3. 培养细胞中辅酶A的提取与衍生化

  1. 当培养的贴壁细胞接近后期亚汇合密度时进行收集。例如，人源HepG2/C3A细胞培养至每100 mm培养皿6-8 × 106的密度，或HEK 293T细胞培养至每100 mm培养皿约1.3 × 107的密度。
    1. 常规进行辅酶A（CoA）测定时应使用双份或三份平行培养样本。同时平行培养独立的培养皿，用于测定活细胞数量。在HPLC纯化后，计算每106-107个细胞中的CoA含量。
  2. 吸除培养皿中的培养基。用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤培养皿上的细胞，以去除残留培养基，随后吸除PBS。再用预冷的水快速洗涤细胞以去除残留的PBS，并迅速吸除水分。添加PBS或水时应避免扰动贴壁细胞。
  3. 向培养皿中加入1 mL预冷的水。用细胞刮将细胞刮入冷水中，并将细胞悬液转移至含有400 μL 0.25 M KOH和1.5 mL水的玻璃试管中。
    1. 在高速涡旋振荡器上剧烈振荡混匀10秒。然后用石蜡膜密封，于55 °C水浴中静置孵育1小时。样品pH应≥12。高pH值对于水解CoA硫酯至关重要，必要时可用额外的KOH溶液调节pH。
  4. 通过低速离心收集悬浮培养的细胞：在4 °C下以136 × g离心6分钟。用预冷PBS洗涤一次，再用冷水短暂洗涤一次，最后重悬于2.5 mL冷水和400 µL 0.25 M KOH的混合液中。剧烈混匀后，按上述条件于55 °C孵育。
  5. 加入160 μL 1 M Trizma-HCl和10 μL 100 mM mBBr，在高速涡旋振荡器上剧烈振荡混匀10秒。此步骤将pH调节至约8，以利于mBBr与游离CoA发生反应。盖紧后避光室温孵育2小时，使mBBr与CoA的巯基充分反应。
  6. 加入100 μL乙酸，在高速涡旋振荡器上剧烈振荡混匀10秒以终止反应。
  7. 以2,000 × g离心15分钟，去除沉淀的细胞碎片。
  8. 将上清液转移至玻璃试管中并妥善保存，用于后续所述的固相萃取（SPE）柱纯化步骤。

4. 组织中辅酶A的提取与衍生化

  1. 取动物组织块，大小约0.5 cm直径或更小，用吸水纸短暂吸干（1–2秒），然后在液氮中快速冷冻，并于–80 °C保存直至处理。若不进行快速冷冻，组织中的辅酶A（CoA）会被水解或转化为硫酯。此步骤对获得组织中最大产量的CoA至关重要。
  2. 在开始分析前迅速称取冷冻组织块（5–60 mg），并记录每个样品的重量。该湿重用于后续HPLC纯化后CoA含量的计算。避免组织块完全解冻。
  3. 向玻璃试管（例如13 mm × 100 mm一次性试管）中加入2 mL 1 mM KOH，该试管将用于插入探头并用转子-定子匀浆器破碎组织。将试管置于冰上待用。此举可确保样品在低温下匀浆，防止匀浆过程中产热导致CoA降解。
  4. 将组织（30–40 mg）转移至含预冷1 mM KOH的玻璃试管中，匀浆30秒。避免组织完全解冻。
  5. 加入500 μL 0.25 M KOH，高速涡旋10秒，然后置于冰上，直至所有样品完成匀浆。此步骤使样品pH升至12以上，以水解CoA硫酯，从而得到总CoA（游离CoA + 水解后的CoA硫酯）。
  6. 将样品在55 °C水浴中孵育2小时，不振荡，以促进水解反应。
  7. 加入150 μL 1 M Trizma-HCl和10 μL 100 mM mBBr，高速涡旋10秒。此步骤将pH调至约8，以利于mBBr与游离CoA发生反应。
  8. 将样品在室温下避光孵育2小时，以确保所有CoA均被mBBr衍生化。
  9. 加入100 μL乙酸，高速涡旋10秒以终止反应。
  10. 在2,000 × g 离心15分钟，使沉淀的细胞碎片形成沉淀。
  11. 小心移出上清液并保存于玻璃试管中，用于后续固相萃取（SPE）柱净化（如下所述）。

5. 使用固相萃取（SPE）柱进行样品纯化

  1. 在室温下，用 1 mL 洗涤缓冲液平衡每个一次性 2-(2-吡啶基)-乙基硅胶柱（1 mL 规格），以确保吡啶基团质子化，从而发挥阴离子交换剂的作用。2-(2-吡啶基)-乙基硅胶是一种弱阴离子交换剂，在碱性 pH 条件下非常适合分离辅酶A-联氨（CoA-bimane）。该硅胶材料的 pKa 为 6，洗脱需在 pH ≥ 7 的条件下进行。
  2. 将样品上清液（步骤 4.11）加入柱中，并收集流出液。
  3. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤柱两次，以去除未保留的杂质。
  4. 用 1 mL 水洗涤柱一次。
  5. 用 1 mL 洗脱缓冲液洗涤柱两次，将洗脱液收集至另一个玻璃试管（12 mm × 75 mm）中，以收集 CoA-bimane。
  6. 在氮气下将试管中的 CoA-bimane 样品吹干。干燥后的样品在室温下稳定，可长期保存。密封试管并完全遮盖后储存。
  7. 准备进行 HPLC 分析时，将样品重悬于 300 μL 水中，并在旋涡混合器上以高速剧烈振荡 10 秒。
  8. 将重悬后的样品转移至离心过滤管（0.22 µm 醋酸纤维素滤膜，2 mL 规格），在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟，以去除任何沉淀物。
  9. 将过滤后的样品转移至适合 HPLC 进样的玻璃小瓶中。

6. HPLC 纯化与 CoA-bimane 的测定

  1. 配制缓冲液。缓冲液 A：50 mM KH2PO4，pH 4.6；缓冲液 B：乙腈（Optima 级）。
  2. 启动高效液相色谱（HPLC）系统。
    注意：本实验室所用 HPLC 系统为 Waters e2695 分离模块，配备 2489 紫外-可见光（UV-Vis）吸收检测器和 2475 荧光检测器，由 Empower 3 软件控制，系统还配有自动进样器。
  3. 将每个样品（例如 20 μL）注入 Gemini C18 柱（3 μm，100 Å，4.6 mm × 150 mm），按照 表 1 中的程序进行分离，流速为 0.5 mL/min，柱温为 25 °C。使用 UV/可见光检测器在 λ393 nm 处检测吸收值，荧光检测条件为 λex = 393 nm，λem = 470 nm。每次样品分析前，通过运行 CoA-联氨标准曲线确定保留时间。
  4. 记录每个样品中 CoA-联氨峰的峰面积，并与标准曲线比较，计算注入 HPLC 柱的 CoA-联氨的 pmol 数量。组织样品使用 CoA-联氨吸收值标准曲线，细胞培养样品使用 CoA-联氨荧光标准曲线。
  5. 由于 CoA-联氨数值代表每个样品的总辅酶 A 含量，因此需对培养样品归一化至活细胞数量，或对组织样品归一化至湿重（mg）（图 6）。或者，可根据每个样品的 DNA 或蛋白质含量进行归一化后，计算总辅酶 A 含量。DNA 或蛋白质含量可通过样品制备过程中 KOH 加入前取出的等分试样单独测定。

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结果

已开发出一种相对快速且可靠的检测培养细胞和组织中总辅酶A（CoA）的方法，该方法通过使用mBBr将CoA的巯基衍生为荧光产物，随后采用反相高效液相色谱（HPLC）纯化衍生化的CoA-双甲胺（CoA-bimane）。首先建立标准曲线：分别注入已知且递增量的CoA-bimane标准品，将CoA-bimane色谱图中峰面积对输入的CoA-bimane量作图（图4）。CoA-bimane在λ393 nM处有吸收峰最大值，典型的HPLC谱图显示了在C18 HPLC柱上使用表1中的洗脱程序时CoA-bimane标准品的保留时间（图3）。通过测定吸光度或荧光单位检测得到的CoA-bimane代表性标准曲线分别如图4A和图4B所示。图4A

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讨论

本文展示了一种可靠且逐步操作的方法，用于定量细胞和动物组织中的总辅酶A（CoA），该方法具有较宽的线性检测范围，可在配备紫外吸收或荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC）的大多数实验室中实现。另一种方法是质谱法，常用于检测辅酶A及其硫酯类物质，但由于仪器成本高昂，且需要专门的方法开发与数据分析知识，因此应用并不广泛。目前市场上无法购得适用于质谱法定量游离CoA的同位素标记CoA内标物，且质谱仪对游离CoA的检测灵敏度远低于乙酰-CoA等CoA硫酯类物质。因此，除非将质谱输出数据与CoA标准校准曲线进行比对，否则游离CoA的含量往往被严重低估。

我们将本文所述方法与实验室先前使用的一种不同方法进行了比较，发现采用本方法从小鼠肝脏中回收的辅酶A（CoA）含量更高，为123.4 ± 7.9 pmol/mg湿重，而此前使用衍生化游离CoA并加以放射性标记的酶法测得的结果约为80 pmol/mg湿重28。本文所描述的总CoA测定方法相比实验室先前使用的方法显著更为简便、快速且易于控制28。此前的方法...

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披露

MWF、CS 和 SJ 撰写了论文，MWF 和 CS 提供了数据和图表，COR 设计了实验并对稿件进行了关键性审阅。SJ 和 COR 是一项待审批专利申请（PCT/US17/39037）"泛酸激酶的小分子调节剂”的发明人，该专利申请由圣裘德儿童研究医院持有，涵盖本文中提及的化合物 PZ-2891。

致谢

作者感谢CoA Therapeutics, Inc.（BridgeBio LLC的子公司）、美国国立卫生研究院资助项目GM34496以及美国黎巴嫩叙利亚联合慈善协会提供的赞助研究经费。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-(2-吡啶基)-乙基硅胶固相萃取柱Millipore-Sigma54127-U
辅酶AAvanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 μm 100 Å 高效液相色谱柱Phenomenex00F-4439-E0
单溴二氯荧光素ThermoFisher ScientificM-1378
Omni-Tip探头式组织破碎仪Omni International32750H
Parafilm封口膜FisherS37440
PowerGen 125电动转子-定子匀浆器ThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X离心管滤器CoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Waters 2475荧光检测器Waters2475
Waters 2489紫外-可见光检测器Waters2489
Waters e2695分离模块Waterse2695

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