细胞和组织中辅酶A的定量

辅酶A（CoA）是所有生物中必不可少的合成物，由泛酸（也称为泛酸盐）或维生素B5合成。CoA是有机酸的主要细胞内载体，包括短链酸，如醋酸和琥珀酸，亚链酸，如丙酸和甲基甲酸酯，长链脂肪酸，如棕榈酸和油酸盐，超长链脂肪酸，如多不饱和脂肪酸，异种生物，如丙丙酸。有机酸与CoA酶形成硫酯联联系，使其在100多个中间^代谢1反应中用作基质。CoA 硫化物也是基洛斯特调节剂和转录活化剂。现在，人们^赞赏2，细胞总CoA供应是^调节3，4;因此，CoA的可用性可以受到限制，CoA的缺陷可能是灾难性的，例如影响CoA生物^合成5的遗传性遗传性疾病。泛酸激酶催化CoA生物合成的第一步（图1）和泛酸激酶相关神经退化，称为PKAN，是由PANK2^基因6的突变引起的。CoA合成酶，由COASYN基因编码，催化CoA生物合成的最后两个步骤（图1）和COASY蛋白相关的神经退化，称为CoPAN，是由COASYN^基因7的突变引起的。PKAN 和 CoPAN 都是遗传性神经退行性疾病，与大脑中的铁积累和 CoA 缺乏疾病病理学有关。

在组织⁸之间，总 CoA 的细胞水平各不相同，在各种生理、病理和药理状态下，总 CoA 可以增加或减少。肝CoA增加期间燃料从饲料切换到禁食^状态9，肝CoA水平异常高的瘦素缺乏肥胖^小鼠10。肝CoA减少对慢性乙醇^摄入11。Pank2敲除小鼠模型中的脑CoA水平在围产期被抑制，但后来在成人阶段大脑CoA含量相当于野生型水平，表明在发育过程中有自适应CoA^反应。通过转因或基因传递方法操作组织CoA含量会影响代谢和神经功能13、14、15。PKAN 或 CoPAN 潜在疗法的临床前开发包括细胞或组织 CoA 测量作为疗效指标 16、17、18、19、20.评估所有这些条件及其代谢或功能后果需要一种定量方法来测量总 CoA。

在许多实验室中，测量生物样品 CoA 的准确、可靠的检测是一项技术难题。不幸的是，没有探针可用于评估或量化在完整细胞中的CoA或CoA硫化物，虽然天然CoA硫化物的类比在利用^酶21的CoA酯研究中被广泛用作机械探针。CoA 与游离磺酸 （-SH） 莫伊蒂一起转换为 CoA 硫化物（反之亦然）在转移到不同环境和细胞裂解期间在细胞或动物组织中快速。细胞中的大量丙基-CoA合成酶和丙基-CoA硫酯酶在CoA池内介导转化，利用CoA硫酯作为基质的其他酶在生物样品中保持活性，直到通过化学或物理淬火意味 着。通过丙烯转移酶将丙基组从CoA卸载到肉碱，是反应网络中可能改变CoA/CoA硫酯分布的一个例子。放射性示踪剂可用于测量细胞中的CoA合成率。目前测量生物样品中的CoA和CoA衍生物的方法已经^审查了22种，包括耦合酶分光度测定测定、高压液相色谱和质谱法程序。然而，这些方法往往集中在特定的CoA分子物种上，并且对整个CoA池的变化视而不见。由于检测灵敏度低，并且线性范围有限，耦合酶测定通常需要大量输入材料。

我们的实验室已经开发出一种可靠的程序，用于定量培养细胞和动物组织中的总CoA。该战略包括所有CoA硫化物的水解，在样品制备过程中只产生免费CoA，而不是努力维持和分析CoA物种的整个谱系。该程序是单独公布的方法汇编，用于制备样品、CoA衍生、纯化和高压液相色谱 （HPLC） 后识别，以及通过吸光或荧光检测23，24，25。使用此程序获得的 CoA 测定使我们能够了解 CoA 法规，并开发治疗 CoA 缺陷的治疗方法。

本议定书中提到的动物程序是按照第323和556号议定书进行的，并特别得到圣朱德儿童研究医院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 准备解决方案

注:使用超纯水用于所有解决方案，并在程序中注明。

1. 在水中制备1 mM氢氧化钾（KOH）。
2. 在水中准备 0.25 M KOH。
3. 在水中准备 1 M Trizma-HCl 并调节到 pH 8.0。
4. 在醋酸酯（Optima级）中制备100mM单溴联苯（mBBr）。mBBr的库存溶液在-20°C下稳定数月，只要它们在黑暗中保持，因为暴露在光线下可以光解单溴二苯^基26。
5. 准备用于固相萃取 （SPE） 柱的洗涤缓冲液:50% 甲醇（Optima 级） = 2% 醋酸。
6. 为SPE柱准备洗脱缓冲液:95%乙醇（HPLC级），含有50 mM铵甲酸铵。

2. CoA-bimane标准的编制

1. 从信誉良好的来源（例如，阿凡提极地脂质公司）购买高品质的CoA标准。
2. 在 20 mM Tris、pH 8 中制备 CoA 的高浓度库存溶液。高浓度库存中的 CoA 量由 ±260 nm 的分光光度吸收率确定或确认（± 16，800 M^-1±cm-1）。添加 4 倍摩尔过量 mBBr;涡旋在高10s。例如，对于缓冲器中的 10 mM CoA，添加 40 mM mBr。mBBr 被添加过多，以确保所有 CoA 都派生。
3. 在室温下在黑暗中孵育4小时，不摇晃，用mBBr衍生CoA。mBBr 与 CoA 的 thiol 组发生反应，它是 pH 和温度相关²⁷。添加 mBBr 可将 CoA 转换为水溶性荧光（或紫外线吸收剂）CoA-bimane（CoA-bimane;图 2.
4. 在高上加入100μL醋酸和涡旋10秒，以阻止反应。
5. 在 2，000 x g下离心 15 分钟，以去除任何沉淀物。
6. 使用 SPE 柱清除上清液以移除未反应的 mBBr（如下所述）。在 SPE 列清理后，不需要过滤和离心洗净（第 5.8 节）。
7. 从含有CoA-bimane的SPE柱中收集脱氧管，在氮气下干燥，称重并构建一个标准校准曲线，已知数量的CoA-bimane。
   1. 检查 HPLC 的 CoA-bimane 纯度标准（见下文），在 ±260（二苯基）和 +393（双峰）和色谱图中两个峰值的重合度检测。
   2. 使用 ±260 nm （+ = 16，800 M^-1±cm^-1） 确认高浓度库存中的 CoA-bimane 标准的数量。
8. 使用 CoA-比马内标准注册 HPLC 保留时间，以识别实验样品中的 CoA-bimane。
9. 储存CoA-bimane标准高浓度库存的等分，防止光线照射，并在-20°C下储存长达2年。避免反复解冻和重新冻结。

3. 培养细胞CoA的提取和衍生

1. 接近晚期亚康透密度时，收获培养中的粘附细胞。例如，人类HepG2/C3A细胞生长到密度为6-8 x 10^6，或HEK 293T细胞生长到每100毫米盘中1.3 x 10⁷的密度。
   1. 将重复或三元区域性定期用于 CoA 确定。与样本细胞培养物同时孵育单独的培养皿，以确定可行的细胞数。计算HPLC纯化后每10^个6-107个细胞的CoA量。
2. 吸气培养介质从菜外掉。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）快速清洗盘子上的细胞，去除任何残留的培养基，并将PBS从培养皿中吸出。用冰冷的水快速清洗细胞，去除残留的PBS，并迅速吸出盘子的水。加入PBS或水时，避免干扰粘附细胞。
3. 在培养皿中加入1mL的冰冷水。将细胞刮入培养皿中的冷水中，并将细胞悬浮液转移到含有400μL 0.25 M KOH和1.5 mL水的玻璃试管中。
   1. 用旋涡大力混合悬架10s。然后用石蜡薄膜紧紧覆盖，在55°C孵育1小时，在水浴中不摇晃。样品的pH值应为± 12。高 pH 分对水解 CoA 硫化物非常重要，必要时可使用 KOH 的附加分量进行调整。
4. 在低速离心下通过离心生长的收获培养细胞:136 x g，在4°C下6分钟。用冰冷的PBS洗一次，然后用冷水再次短暂洗涤，最后在2.5 mL的冷水加400μL 0.25 M KOH中重新悬浮。如上文所述，在55°C下大力混合并孵育。
5. 加入160 μL的1M Trizma-HCl和10μL的100 mM mBBr，并通过涡旋在高10s混合。这使得pH到大约8，以支持mBBr反应与自由CoA。在室温下覆盖并孵育样品2小时，在黑暗中，mBBr与CoA的二醇发生反应。
6. 加入100 μL醋酸，在高涡中混合10秒，以阻止反应
7. 在 2，000 x g下离心 15 分钟，以清除沉淀的细胞碎片。
8. 在玻璃试管中取出并保存上清液，用于下面描述的 SPE 柱清理。

4. 组织CoA的提取和衍生

1. 解剖动物组织片，直径约0.5厘米或更小，在吸水纸上短暂（1-2s）上涂布，然后在液氮中闪冻，储存在-80°C，直到加工。组织中的CoA水解或转化为硫化物，如果不是闪光冻结。此步骤对于获得组织 CoA 的最大产量非常重要。
2. 在开始分析之前，快速称重冷冻组织片（5 ~ 60 mg），并记录每个样本的重量。这种湿重测定用于在HPLC纯化后计算CoA含量。避免组织片完全解冻。
3. 将 2 mL 的 1 mM KOH 添加到玻璃试管（例如，13 mm x 100 mm 一次性），用于插入探针，使用转子-定子均质器破坏组织。将管子放在冰上直到使用。这样做是为了确保样品在低温下均质化，并且 CoA 不会由于同质化过程中产生的热量而遭到破坏。
4. 在玻璃试管（含冷1 mM KOH）中转移和均质组织（30~40mg），30s.避免组织完全解冻。
5. 加入500 μL 0.25 M KOH;涡旋在高10s上，并保持在冰上，直到所有样品均质化。这将使12号以上样品的pH值对CoA硫化物进行水解，产生总CoA（自由CoA+水解CoA硫化物）。
6. 在55°C下孵育样品2小时，在水浴中不摇，支持水解。
7. 加入150 μL的1M Trizma-HCl和10μL的100 mM mBBr;涡旋高10秒。这使得pH为约8，以支持mBBr反应与自由CoA。
8. 在黑暗中在室温下孵育样品2小时，以确保所有CoA均用mBBr进行衍生。
9. 在高10秒上加入100μL的醋酸和涡旋，以阻止反应。
10. 在 2，000 x g下离心 15 分钟，以颗粒沉淀的细胞碎片。
11. 在 SPE 柱清理的玻璃试管中取出并保存上清液（如下所述）。

5. 使用固相萃取 （SPE） 列进行样品清理

1. 在室温下，将每个一次性 2-（2-pyridyl）-乙基硅胶柱（1 mL 大小）与 1 mL 的洗涤缓冲液进行平衡，以确保 pyridyl 功能组被质子化，并充当一个电子交换器。2-（2-pyridyl）-乙基硅胶是一种弱的抗氧化交换器，是基本pH的CoA-bimane的理想选择。2-（2-pyridyl）-乙基硅胶的pKa为6，洗脱pH= pH = 7。
2. 将样品上清液（步骤 4.11）添加到列中并收集油液。
3. 用1 mL的洗涤缓冲液洗涤柱两次，以去除任何未保留的物种。
4. 用1 mL的水清洗柱子一次。
5. 用 1 mL 的洗脱缓冲液将柱洗两次到单独的玻璃试管（12 mm x 75 mm）中，以收集 CoA-bimane。
6. 干CoA-bimane样品在氮气下管中干燥。干燥样品在室温下保持稳定，直到进一步使用。密封并完全盖住管和存储。
7. 准备进行HPLC分析时，将样品重新悬浮在300μL水中，并在高涡中大力混合10s。
8. 将重新悬浮样品转移到离心管过滤器（0.22 μm醋酸纤维素，2 mL大小）和离心机在5，000 x g10分钟，以去除任何沉淀物。
9. 将过滤样品转移到适合HPLC注射的玻璃瓶中。

6. HPLC 的纯化和CoA-双马的测量

1. 准备缓冲区。缓冲器 A: 50 mM KH₂PO₄， pH 4.6;缓冲器 B: 醋酸酯（Optima 级）。
2. 打开 HPLC 系统的电源。
   注:我们实验室的 HPLC 系统是沃特世 e2695 分离模块，配备 2489 紫外线可见 （UV-Vis） 吸收检测器和 2475 荧光检测器，使用 Empower 3 软件进行控制。该系统还具有自动样品喷油器。
3. 使用表 1 中的程序，将每个样品（例如 20 μL）注入双子座 C18 上进行分离，使用表 1中的程序进行分离，其流量为 0.5 mL/min。柱温度为 25°C。在 ±393 nm 处测量 UV/可见光探测器的吸收率，在 μex = 393 nm、μem = 470 nm 处测量荧光检测。保留时间是通过在每组样本之前运行 CoA-bimane 标准曲线来确定的。
4. 记录每个样品的CoA-bimane峰下的面积，并与标准曲线进行比较，以计算注入到HPLC柱上的CoA-bimane的pmol。CoA-bimane 吸收标准曲线用于组织样品，CoA-bimane 荧光标准曲线用于组织培养样本。
5. 由于 CoA-bimane 值表示每个样本的总 CoA，因此，将值与培养样本的活细胞数或组织样本的 mg 湿重值（图 6） 进行规范化。或者，计算每个样品的DNA或蛋白质含量正常化后的CoA总值。DNA或蛋白质含量可单独测定使用样品等分，在添加KOH之前样品制备过程中去除。

利用mBBr将CoA的二醇衍生为荧光剂，然后利用反相HPLC纯化衍生的CoA-bimane，开发出一种相对快速、可靠的方法，用于检测培养细胞和组织的总CoA。首先生成标准曲线，其中已知且不断增加的 CoA-bimane 标准量单独注入，CoA-bimane 色谱图中峰值下的区域绘制为输入 CoA-bimane 的函数（图 4）。CoA-bimane 的吸收率最大值为 ±393 nM ，具有代表性的 HPLC 配置文件使用表 1中的洗脱程序在 C18 HPLC 列上显示 CoA-bimane 标准的保留时间（图 3）。通过测量吸光度或荧光单位检测的CoA-bimane代表标准曲线分别如图4A和图4B所示。 图 4 A中的标准曲线反映了 CoA-bimane 在 +393 nm 处的吸收量，图 4B表示绘制的 CoA-bimane 荧光（μex = 393 nm 和 μem = 470 nm）与CoA-比马内CoA-bimane 标准可检测为 0.01 至 12，000 pmol，当同时使用吸光和荧光进行检测时，可覆盖 106倍范围。虽然该标准的检测下限为0.01 pmol，但实验样品中CoA-bimane定量的下限为0.2pmol，比色谱中的基线或背景荧光大约5倍。CoA-bimane 的吸光性或荧光检测的选择取决于组织或细胞中通常存在的 CoA 量，以及处理较大或较小样本尺寸的实用性。吸收率通常对组织样品有用，因为处理 40-50 mg 的起始材料比 5 mg 组织样本产生更好的恢复性，而荧光通常适用于体积较小且较大的培养细胞样本荧光标准曲线下端的值插值的置信度。只有吸光检测的实验室可以考虑增加或减少起始样品大小，增加HPLC注射体积或减少样品重悬浮体积（上文第5.9节），以进行培养细胞的测量。

通过调整KOH浓度以及后续孵育的时间和温度（未显示数据），优化了组织和培养细胞的水解丙基-CoAs的条件。在55°C下，2小时的最佳条件为0.25M。自由CoA的硫醇组加上从硫化物中释放的任何CoA在pH下调整后通过与mBBr的反应而衍生。随后的HPLC分离和小鼠肝脏或人类培养的C3A细胞的典型检测配置文件在图5中指示为红峰，使用表1中描述的洗脱程序，保留时间在11至12分钟之间。典型的生物起始材料量为30-40毫克的鼠肝（湿重），6-8 x 106细胞用于人类"类似肝脏"的C3A细胞，或人类HEK293T细胞的±1.3 x 107细胞。C3A细胞在10 uM下用PanK实验药物PZ-2891进行治疗，从而提升CoA17（图6）。当 PanK 等形体过度表达时，HEK293T 单元中的 CoA 测量显示 CoA 测量范围广泛（431-6925 pmoles/μL）（图 6）。此方法所需的样本大小适用于许多实验环境。

CoA-Bimane峰下的区域是使用HPLC提供的软件计算的。在正确调整基准校正和峰值定义的输入值之前，HPLC 软件可以自动确定峰值限制，但我们的实验室倾向于在每个色谱图中手动指定 CoA-bimane 峰值，尤其是不熟悉的生物样本。

表1:CoA-双马分离HPLC方案。缓冲器 A: 50 mM KH2PO4， pH 4.6;缓冲器B:醋酸酯。缓冲区 A 和缓冲区 B 的混合遵循曲线 6，这是一个线性渐变，中间曲线 8 是中等凹面渐变。

图 1.辅酶生物合成途径。在CoA生物合成的第一步中，泛酸激酶（PanK）催化泛酸酯（维生素B5）至4°磷脂的磷酸化。磷磷酸酯的形成后，先用半胱氨酸凝结，通过4°磷酸酯基质合成酶催化，然后脱脂化，通过4μ磷脂氨基苯甲酸酯形成4°磷脂氨酸。4_-磷脂酶在由CoA合成酶催化的两步工艺中转换为辅酶A（CoA）。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2. mBBr 反应与 CoA。单溴联苯（mBBr）与CoA-SH（免费CoA）混合，在黑暗中在室温下孵育2小时。当与CoA结合形成CoA-bimane时，非荧光mBBr变得荧光。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:CoA-bimane标准的吸收HPLC跟踪。CoA-bimane在双子座C18柱上使用表1中的HPLC程序被分离。典型保留时间（分钟）由阻油单位 （AU） 指示。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:通过吸光或荧光检测的CoA-bimane标准曲线。（A） 使用 CoA-bimane 的吸收检测单位测量的标准曲线在 +393 nm 处进行测量。组织样本通常使用吸光度标准曲线进行评估。（B） 使用荧光检测单位测量的标准曲线，在 μex = 393 nm、μem = 470 nm 处为 CoA-bimane 测量。培养的细胞通常使用荧光标准曲线评估CoA含量。定期评估重复的标准（和示例）。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:典型肝脏或培养细胞样本的HPLC痕迹。（A） 小鼠肝脏提取物中含量的CoA-bimane鉴定和定量。指示吸收单位 （AU）。（B） HepG2/C3A培养细胞中含量的CoA-bimane鉴定和定量。指示荧光发射单位 （EU）。CoA-Bimane 峰显示为红色。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6.小鼠肝脏、培养C3A和HEK293T细胞中的CoA水平。（A） 从泛酸激酶敲除（Pank1-/-） 和匹配野生型 （WT） 动物的小鼠肝脏中的 CoA 测量。由于没有Pank1表达9，与WT动物相比，Pank1-/-动物的肝脏CoA较低。这些数据是使用5只雄鼠获得每个基因型的，并代表HepG2/C3A细胞中的CoA水平，这些细胞采用二甲基二氧化硫（车辆控制）或PZ-2891（一种在10 uM下调节PanK活性的实验药物）进行调节。17.在用PZ-2891孵育24小时后，细胞CoA水平升高。（C） HEK293T细胞中的CoA水平转染为空载体pcDNA3.1，或cDNA编码人类PANK等形:PANK1+，PANK2m，这是成熟的，经过加工的人类PANK2，或PANK3。CoA 水平通过所有活动 PANK 等形的过度表达而升高。（B） 和 （C） 中的数据来自独立的三元样品，并表示为均值 = SEM。使用未配对的 t 检验进行统计分析，显著性值以红色显示。面板（B） 和 （C） 中的数据改编自夏尔马等人。12请点击此处查看此图的较大版本。

MWF、CS和SJ撰写了论文，MWF和CS提供了数据和数据，COR设计了实验并严格审查了稿件。SJ 和 COR 是圣朱德儿童研究医院持有的"泛酸激酶小分子调节剂"的待决专利申请 （PCT/US17/39037） 的发明人，该医院涵盖本文所引用的 PZ-2891 化合物。