Summary
Макрофаг фагоцитной активности против раковых клеток, в частности 4T1 мыши молочных клеток карциномы, был изображен в этом исследовании. Была создана и наблюдалась модель сокультуры живых клеток с использованием сочетания флуоресцентной и дифференциальной контрастной микроскопии помех. Эта оценка была изображена с помощью программного обеспечения для визуализации для разработки многоточечного видео.
Abstract
Опухолевые макрофаги (TAMs) были определены в качестве важного компонента для роста опухоли, вторжения, метастази и устойчивости к терапии рака. Тем не менее, опухолевые макрофаги могут быть вредны для опухоли в зависимости от микроокружения опухоли и могут обратимо изменять свои фенотипические характеристики, либо антагонизировать цитотоксическую активность иммунных клеток или усиливая противоопухолевую реакцию. Молекулярные действия макрофагов и их взаимодействие с опухолевыми клетками (например, фагоцитоз) не были широко изучены. Таким образом, взаимодействие между иммунными клетками (M1/M2-подтип TAM) и раковыми клетками в микроокружении опухоли в настоящее время находится в центре внимания исследований иммунотерапии рака. В настоящем исследовании, модель живой клеточной кокультуры индуцированных макрофагов M1 и мыши ныхциномы 4T1 карциномы клетки была разработана для оценки фагоцитарной активности макрофагов с помощью замедленного видео функция с использованием фазового контраста, флуоресцентные, и дифференциальные помехи контраста (DIC) микроскопии. Настоящий метод может наблюдать и документировать многоточечную живую визуализацию фагоцитоза. Фагоцитоз 4T1 клеток макрофагов M1 можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии перед окрашиванием 4Т1 клеток с carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). В настоящее время издание описывает, как сокультуры макрофагов и опухолевых клеток в одной визуализации блюдо, поляризовать M1 макрофагов, а также записывать многоточечные события макрофагов, охватывающих 4T1 клеток в течение 13 ч культуры.
Introduction
Макрофаги являются первой линией иммунной защиты и играют определенную роль в организации иммунных реакций против патогенных микроорганизмов и посторонних материалов, включая раковые клетки. Они являются специализированным фагоцитом, который разрушает и избавляется от нежелательных частиц в организме. Макрофаги способствуют защитные функции, такие как очистка апоптотические клетки и микроорганизмы и вербовка других иммунных клеток1. Макрофаги могут различаться на два различных типа, M1 и M2 макрофаги, в ответ на экологические сигналы2. M1-поляризованные макрофаги (т.е. классически активированные макрофаги) активируются цитокиновым интерфероном-Я (IFN-я) и липополисахаридами (LPS) и участвуют в воспалительной реакции, расчистке патогенов, эффективном фагоцитозе и опухолевом иммунитете3,4. Макрофаги M2 тесно связаны с опухолевыми макрофагами (TAMs) и обладают противовоспалительными и опухолевыми свойствами4.
Фагоцитоз, производный от древнегреческого (фагейн), что означает "пожирать", (kytos), что означает "клетка", и -osis, что означает "процесс"5. Фагоцитоз – это процесс, опосредованный рецепторами, в ходе чего фагоциты (включая макрофаги, моноциты и нейтрофилы) убивают и поглощают вторгающиеся патогены, очищают посторонние частицы и очищают апоптотический клеточный мусор. Опухолевые макрофаги (TAMs) находятся в строми в различных опухолях, включая рак молочной железы, и имеют про-опухолевые функции6,7, что приводит к резистентности к фагоцитозу. Детальный механизм фагоцитоза опухолевых клеток макрофагов пока не понятен.
Это исследование представляет собой двухступенчатый метод: 1) 4T1 мыши молочных клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов cocultured, и 2) фагоцитарной активности макрофагов оценивается с помощью живой-клеточной видеомикроскопии. CFSE флуоресцентный краситель был использован для испачкать 4T1 мыши молочных клеток карциномы. Пятна этикетки 4T1 клетки, чтобы отличить их от cocultured M1 макрофагов в рамках одной визуализации блюдо. RAW 264.7 макрофаги поляризуются с LPS и IFN-З в фенотип M1. Для обеспечения полной поляризации была проведена иммуностогирование анти-iNOS антителами, спряжение к FITC. Впоследствии, многоточечный ряд замедленного изображения был приобретен для наблюдения за несколькими событиями, в том числе фагоцитоз, в рамках кокультуры.
Более глубокое понимание взаимодействий между опухолевыми клетками и макрофагами может привести к потенциальной иммунотерапии рака. Визуализация в реальном времени предлагает детальное представление о клеточной динамике в обстановке в реальном времени и используется для изучения миграции клеток, фенотипического скрининга, апоптоза и цитотоксичности8,9 в неврологии, биологии развития и открытии наркотиков. Хотя предлагаемой опухолью в этом исследовании является рак молочной железы, метод также может быть применен к нескольким клеткам-мишеням и различным клеткам-эффекторам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 1'6 описывают модель кокультуры клеток карциномы 4T1 мыши и макрофагов мыши RAW 264.7. В разделе 7 описывается замедленной оценки фарафахM M1, которые могут быть 4Т1.00.
1. Культирование 4T1 мыши молочных клеток карциномы и RAW 264.7 мышь макрофаги
- Оттепель флакон криогенно сохранившихся 4T1 и RAW 264.7 проход 6 клеток нежным возбуждением в водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию или нормальной температуре роста для клеточных линий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттаивание должно быть сделано быстро, примерно в течение 2 минут. Чтобы избежать загрязнения, удалите флакон из водяной ванны и обеззараживайте его, распыляя 70% этанола. Чтобы избежать генетического дрейфа, особенно для макрофагов, используйте низкое количество проходов (т.е. менее 20). - Разбавить оттаять клетки в 10 мл полной среде DMEM в 15 мл конической трубки и центрифуги клетки на 600 х г в течение 5 минут для получения клеточной гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда DMEM дополнена 10% (v/v) сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 200 U/mL пенициллином/стрептомицином, и 2 мМ L-глютамина используется во всем протоколе. - Тщательно аспирируйте носители, resuspend клетки в 8 мл полной среде и передачи в 25 см2 ткани культуры обработанных колбы. Культура как 4T1 и RAW 264.7 клетки в полной среде DMEM на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Resuspend клетки гранулы осторожно и добавить подвески клетки в культуре колба капля за каплей, чтобы избежать убийства клеток. - После 1 недели культивирования, чтобы позволить клеточной прилипания, контролировать колбу ежедневно и добавить 8 мл полного DMEM среды по мере необходимости.
2. Иммуностоинг M1 поляризованных RAW 264.7 макрофагов
- По мере того как вслюхость RAW 264.7 клеток достигает 70-80%, откажитесь от культурных носителей и аккуратно промыть 2x с по крайней мере 2 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом RAW 264.7 клеток, убедитесь, что не было дифференциации клеток (т.е. дендрит-как фенотип и / или увеличение размера клетки). Если изменения клеточной морфологии видны, отбросьте культуру и оттаивните новую клеточную линию от более раннего флакона прохождения. - Подготовьте макрофаги для сбора, аккуратно выбив аяде клеточного клеточного с помощью клеточного скребока и перенесите их в коническую трубку 15 мл.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовить клеточной подвески 1 х 105 клеток / блюдо с помощью полного DMEM среды.
- Семя 2 мл макрофагов подвесной в два изображения блюд. Инкубировать клетки 2'3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2, чтобы позволить присоединение клеток.
- Подготовка M1 поляризации средств массовой информации, добавив 100 нг / мл LPS и 20 нг / мЛ IFN-я в полной DMEM среднего10,11.
- Откажитесь от культуры супернатанта от макрофагов и тщательно промыть монослой в блюде 2x, по крайней мере 1 мл PBS.
- Добавьте 2 мл средств поляризации M1 в одну из посуды, позволяют RAW 264.7 клеткам индуцировать фенотип макрофага M1, и инкубировать 2-3 ч при 37 C с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена RAW 264.7 макрофагов в изображении блюдо с DMEM дополняется 10% FBS в качестве контроля для анти-iNOS антитела окрашивания. Этикетка изображений блюда RAW (контроль) и M1 макрофагов (LPS и IFN-я поляризованы), соответственно. - Перед иммуноанализом исправьте клетки макрофагов RAW 264.7 и M1, используя 2 мл параформальдегида и инкубируя 15 мин при температуре 37 градусов по Цельсию (комнатная температура, RT).
- Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
- Утолить 2 мл 50 мм хлорида аммония в PBS и инкубировать в течение 15 минут на RT.
- Пермяки с использованием 2 мл 0,3% Тритон X-100 в PBS в течение 15 минут на RT.
- Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
- Блок с использованием 2 мл 10% FBS в PBS в течение 30 минут на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий шаг в иммуностоидинге заключается в том, чтобы свести к минимуму неспецифические связывания антител в клетке. - Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
- Инкубировать с 2 мл анти-iNOS-FITC в PBS и 1% FBS ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка клетки с использованием соответствующего разбавления антител в соответствии с рекомендациями производителя. Защитите блюда от света, покрывая их алюминиевой фольгой с этого момента. - Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
- Инкубировать 1 мл 300 нм 6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) в визуализации блюда для изображений в течение 10 минут в 37 градусов по Цельсию, в темноте, покрывая алюминиевой фольгой.
- Вымойте клетки с 1 мл PBS по крайней мере 3x и добавить 1 мл полного DMEM среды в изображении блюд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь готовы к флуоресценции изображений. Установка микроскопа потребует перевернутой стадии и возбуждания фильтров для выбранных пятен (в данном случае, FITC и DAPI). - Включите микроскоп и загрузите программное обеспечение для визуализации. Установите изображение блюдо на микроскоп и настроить фокус для наблюдения RAW 264.7 и M1 макрофагов. Оптимизируйте внешний вид фазовых контрастных изображений FITC и DAPI, регулируя передаваемые свет и время экспозиции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните визуализацию, когда все точки находятся в фокусе и каналы оптимизированы. - Захват фазового контраста FITC и DAPI изображения(рисунок 1).
3. Посев 4T1 мыши молочных клеток карциномы
- По мере того как вслюхость 4T1 клеток достигает 70-80%, откажитесь от культурных носителей и аккуратно промыть 2x, по крайней мере, 2 мл PBS. Добавьте 1 мл претеплового трипсина, чтобы разъединить клетки и инкубировать до 20 мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за клетками под микроскопом. Отдельные ячейки будут округлены. - После того, как клетки отсоединяются, перенесите их в коническую трубку 15 мл и добавьте 2 мл предварительно разогретого полного DMEM-среды для активации трипсина. Аккуратно рассеять среду путем pipetting поверхности слоя клетки для восстановления клеток. Затем, центрифуга на 600 х г в течение 5 минут, чтобы получить клетку гранулы.
- Удалите супернатант и resuspend гранулы в 10 мл предварительно разогретой полной среды DMEM.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 1 х 105 4T1 клеток в 2 мл полной среде DMEM в каждом из двух 35 мм стеклянного дна визуализации блюда, обработанные тканью культуры. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура 4T1 клетки в одном из изображений блюда с M1 поляризации средств массовой информации и этикетки 4T1-индуктор (контроль). Это необходимо для обеспечения нормального роста 4T1 клеток при воздействии индукторов.
4. Маркировка жизни 4T1 мыши молочных клеток карциномы с использованием CFSE окрашивания
- Во-первых, удалить существующие средства массовой информации из 4T1 клеток изображений блюд. Вымойте монослой клетки по крайней мере 2x с 1 мл PBS.
- Приготовьте 5 КМ раствора окрашивания CFSE, разбавив CFSE в 1 мл PBS. Добавьте 1 мл из 5 мкм CFSE окрашивающий раствор в каждое блюдо для визуализации и инкубировать клетки в течение 20 минут при РТ или 37 градусов по Цельсию, в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка клеток, используя соответствующую концентрацию CFSE рабочей в соответствии с рекомендациями производителя и предварительных экспериментов для получения оптимальной концентрации окрашивания CFSE. Эффективность маркировки будет выше, если CFSE разбавляется в PBS. - Утолить окрашивание, добавив равный объем полной среды DMEM, содержащей 10% FBS и окрашивающий раствор для клеток и инкубировать в течение 5 мин на RT в темноте.
- Откажитесь от CFSE-содержащего раствора и промойте клетки 1x с равным объемом культурных носителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 клетки в настоящее время флуоресцентно помечены. - Верните ячейки 4T1-CFSE в стандартные условия культуры на RT с 5% CO2.
5. Посев RAW 264.7 мышь макрофаги и coculture с 4T1
- Как вольность RAW 264.7 достичь 70-80%, отказаться от культуры средств массовой информации и мягко промыть 2x, по крайней мере 2 мл PBS.
- Подготовьте макрофаги для сбора, аккуратно выбив аяде клеточного клеточного с помощью клеточного скребока и перенесите их в коническую трубку 15 мл.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовьте клеточную суспензию 1 х 105 ячеек/мл, разбавив оставшийся раствор полной средой DMEM в соответствии с плотностью посева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно сливочные клетки в кокультурах могут серьезно уменьшить фагоцитоз. В этом исследовании, посев носоотношение макрофагов: раковые клетки были скорректированы в соотношении 1:1. Соотношение может быть скорректировано в зависимости от агрессивности опухолевых клеток и происхождения макрофагов. - Перед сокультивом отбросьте культурный супернатант из 4Т1 клеток, посеянных за день до этого (шаг 4.5) и тщательно промойте монослои 2x с не менее 1 мл PBS.
- Семена 1 х 105 RAW 264,7 ячеек на 2 мл полной среды DMEM в один из 4T1 изображений блюд. Инкубировать клетки 2'3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2, чтобы позволить присоединение клеток. Этикетка изображения блюдо 4T1-M1 кокультуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 (контрольные) клетки не были cocultured с макрофагами.
6. M1 поляризация RAW 264.7 макрофагов
- Подготовка M1 поляризации средств массовой информации, добавив 100 нг / мл LPS и 20 нг / мЛ IFN-- в полной среде DMEM дополнены 10% (v/v) FBS10,11.
- Откажитесь от культуры супернатанта из макрофагов, инкубированных ранее (шаг 5.5) и тщательно мыть монослой в блюде 2x с по крайней мере 1 мл PBS.
- Затем добавьте 2 мл средств поляризации M1 в блюдо для визуализации и позвольте RAW 264.7 клеткам вводить фенотип макрофага M1, инкубируя при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: M1 макрофаг клетки могут занять 2'3 ч инкубации для достижения полной поляризации. Необходимо провести предварительные эксперименты для обеспечения подходящего инкубационного периода, чтобы обеспечить полную поляризацию макрофагов.
7. Видеомикроскопия фагоцитоза в живых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие факторы должны быть рассмотрены при выполнении изображения в живых клетках, чтобы получить продуцируемое видео, включая оптимизацию экспозиции изображения, измерение времени и автоматическую коррекцию фокусировки.
- Перед экспериментом навештатите инкубатор клеточной культуры, включив термостат при 37 градусах Цельсия и поставив 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка микроскопа требует перевернутой стадии, инкубатора верхней стадии, контроля влажности (95%) и системы инкубации газа. Эта установка имеет решающее значение для поддержания клеток для долгосрочной оценки видеомикроскопии в живых клетках. - Включите микроскоп, включая стадию пьезо и загрузите программное обеспечение для визуализации микроскопа.
- Расположите семенные клетки кокультуры в 35-миллиметровой стеклянно-нижней части изображения блюдо в центре сцены и аккуратно винт на верхней камере. Используйте джойстик для моторизации сцены, выбрав положение для изображения.
- Для просмотра образца выберите фильтр фазового контраста на башне. После первоначального просмотра образца, найти соответствующие поля и привести образец в фокусе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Imaging программное обеспечение позволяет использовать полностью автоматизированный объективный выбор, Perfect Focus System, замедленной серии, многоканального приобретения изображений, а также многоточечного приобретения изображения. - Чтобы настроить многоканальную флуоресценцию для маркировки CFSE и дифференциального взаимодействия контрастного приобретения, открыть изображение программного обеспечения приобретения диалогового ящика и выберите "Lambda" вкладка флаконт -Ruбию(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 13-часовой визуализации следует использовать фазово-контрастный канал. - Выберите вкладку «Ламбда» «Оптическая конфигурация» и выберите «10X DIC» для контраста дифференциальных интерференций и «GFP-R» для зеленого флаоресцентного фильтра флабокса. Под «Ламбдой» Колонка «Фокус», выберите флажок «10X DIC», чтобы установить в качестве фокусировки.
- Откройте диалоговую коробку для приобретения программного обеспечения для визуализации и нажмите кнопку «XY» Time и выберите вкладку «XY».
- Перейдите к точке приобретения изображения с помощью джойстика на моторизованной стадии при проверке живого изображения или выберите другое положение через окуи. Затем нажмите на флажок под столбцом «Имя точки», чтобы установить каждую точку в каждом месте для захвата изображения (см. рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная стадия позволяет многоточечному приобретению изображений различных координат XY захватывать несколько полей. - Изобразить фокус для каждого просмотрели на экране. Используйте элементы управления при коррекции автофокусировки.
- Используйте программное обеспечение для настройки замедленного захвата изображения. В диалоговом окне приобретения программного обеспечения для визуализации проверьте вкладку «Время» (см. рисунок 4).
- Определите «Interval» (задержка между началом одного времени в другой момент времени) и «Длительность» (общая продолжительность времени эксперимента). Единицы времени различаются и могут быть выбраны в миллисекундах (мс), секундах (ы), минутах (м) или часах (ч) из меню выпадения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность периода изображения для замедленного изображения флуоресценции и DIC замедленного многоканального приобретения может варьироваться в зависимости от флуоресцентного красителя, используемого в этом анализе. Фотоотрахинг может произойти, если помеченные клетки подвергаются воздействию слишком долго. - Проверить флажок «Сохранить файл», чтобы сохранить приобретенные изображения. В рамках вкладки «Расписание времени» нажмите кнопку «Беги сейчас», чтобы получить многоточечные изображения временных рядов (см. рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: В программном обеспечении для визуализации изображения сохраняются в формате файлов nd2. Каждый промежуток времени может быть индивидуально сохранен в формате файла MP4 позже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По времени двухмерные (2D) изображения модели кокультуры 4T1 мыши mammary карциномы клеточных линий показывают 4T1 клетки поглощается M1 макрофагов в течение 13 ч период. Важно обеспечить полную поляризацию макрофагов М1, выполняя иммуностоинг. Результаты(Рисунок 1) показывают, что концентрация 100 нг/мл липополисахаридов (LPS) и 20 нг/мЛ IFN-й поляризованных RAW 264.7 макрофагов в состояние M1. Маркировка целевых клеток с флуоресцентным красителем и оставляя эффектор ные клетки неокрашенные позволяет жить-клеточной модели кокультуры (Фильм 1). На протяжении 13 ч и 15 минут интервал, фагоцитическая активность макрофагов M1 в кокультуре с 4T1 клетки была задокументирована (Фильм 2). Шесть многоточек видео(A'F в фильме 2) были записаны для оценки нескольких событий в рамках одного 35 мм стеклянное дно изображения блюдо. Фильм 3 показывает 4T1 клетки фагоцитозные макрофаги M1. Фильм 4 был выбран в качестве примера углубленного видео, снятого из этого эксперимента, а фильм 5 показывает поглощение 4T1 клеток макрофагами M1.
Рисунок 1: Иммунофлуоресценция окрашивание с анти-iNOS-FITC зеленым цветом, маркером ядер DAPI синим цветом и расширенными версиями слитых изображений. Эти панели представляют RAW 264.7 макрофагов (контроль) и M1 макрофаги (LPS и IFN-я стимулировали) иммуноокрашенные с анти-iNOS-FITC (M1 маркер) в зеленом и противопоставить ядра маркера, DAPI в синий цвет. (A) DAPI пятно можно наблюдать как RAW 264.7 и M1 макрофагов. (B) Anti-iNOS-FITC (зеленый) только флуоресцирует на макрофагах M1. (C) Слияние изображений Пятна DAPI и анти-iNOS-FITC. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Настройка флуоресценции и приобретение изображений DIC при управлении диалогом по приобретению программного обеспечения для создания изображений. Выберите флажок «Lambda», выберите «Оптическую конфигурацию» и выберите «10X DIC» и «GFP-R» для контрольного ящика фильтра зеленой флуоресценции, выберите «10X DIC» «Установить этот канал в качестве ссылки фокуса». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Настройка многоточечного приобретения изображения в управлении диалогом по приобретению программного обеспечения для создания изображений. Выберите вкладку «XY» и следующий —5, выберите флажок под столбцом «Имя точки», чтобы установить каждую точку для захвата изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Настройка интервалов и продолжительности для измерения времени захвата изображения. Управление диалогом по приобретению программного обеспечения для создания замедленного захвата изображений. Чтобы настроить приобретение изображения замедленного действия ( Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Настройка многоточечных кинопанелей для захвата изображения замедленного измерения. Предварительный просмотр шести многоточечных панелей фильмов, объединенных после завершения 13 ч кокультуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 1: Репрезентативный фильм неокрашенных макрофагов M1 и 4T1 CFSE окрашенных клеток карциномы мыши в coculture захватили с помощью многоканального приобретения флуоресцентной и DIC микроскопии. Результаты демонстрации CFSE в зеленой маркировке клеточной стенки 4T1 мыши молочных клеток карциномы cocultured с неокрашенными m1 макрофагов. Замедленное изображение было приобретено в течение 13 ч периода кокультуры с интервалом в 15 минут с использованием многоканального приобретения (шаг 7.3, см. Рисунок 2). (A) Дифференциальная интерференционная контрастность, (красный круг) показывает небольшие, круглые макрофаги M1, придерживающиеся 4T1 клеток, которые имеют эпителиальную морфологию. (B) Флуоресценция микроскопии изображение 4T1 клеток окрашенных CFSE до фагоцитоза макрофагов. (C) Слияние DIC и флуоресценции микроскопических изображений CFSE окрашенных 4T1 клеток, поглощенных неокрашенных макрофагов M1. Синие стрелки показывают неокрашенные макрофаги M1, флуоресцентные зеленые, поскольку они поглощают клетки 4T1 с маркировкой CFSE. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Фильм 2: Live-клеток видео микроскопии фильмы из нескольких точек стадии в одной визуализации блюдо, показывающее фагоцитоз 4T1 мыши мятрой клетки карциномы индуцированных M1 макрофагов. Результаты представляют шесть различных точек(Фильм 2A'F) создан и скоординирован с помощью программного обеспечения изображений (шаг 7.4, см. Рисунок 3иРисунок 5). M1 макрофаги имеют нерегулярные, блиноподобные морфологии с пористой цитоплазмы, в то время как 4T1 мыши молочных карцином имеют эпителиальной морфологии. M1 макрофаги и 4T1 клетки были cocultured для 13 h внутри инкубатора этапа на 37 C с 5% CO2 перед быть наблюдаемым для видеомикроскопии видеолайты в реальном маштабе времени. Изображения были захвачены с интервалом в 15 минут в течение 13 ч. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Фильм 3: Live-клеточная видео микроскопия фильм одной точки координат (см. Movie 2) выбрали, чтобы показать фагоцитоз 4T1 мыши молочных карциномы индуцированных M1 макрофагов в деталях. Красная стрелка показывает фагоцитоз. Желтый круг показывает, что число 4T1 клеток, которые угасают поглощение 4T1 клеток. Шкала бар No 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Фильм 4: Подробное видео для дальнейшей визуализации процесса фагоцитоза 4T1 клеток макрофагов M1. Эта панель показывает живые клетки макрофага M1 с пористым фенотипом цитоплазмы. Шкала бар No 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Фильм 5: Макрофаги движутся к 4T1 клетки для установления контакта между клетками к клеткам, а затем поглощение 4T1 клеток M1 макрофагов (см. Фильм 2A). Фазовая контрастная микроскопия замедленного видео была изображена в 15 минут времени интервалы для 13 ч кокультуры внутри сцены верхней инкубатора на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Шкала бар No 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол требует двух шагов: 1) кокультуры 4T1 мыши клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов, и 2) оценка макрофагов фагоцитной активности с использованием замедленной микроскопии. Сокультура живых клеток широко используется в фагоцитозных и миграционных анализах. Модель сокультуры живых клеток здесь является простой, адаптируемой процедурой in vitro(Рисунок 2),которая использует флуоресцентный краситель, CFSE, который используется для обозначения целевых клеток 4T1. Это используется для правильного отслеживания типов клеток во время визуализации живых клеток. Time-lapse живо-клеточная визуализация была использована для оценки фагоцитарной активности макрофагов M1 с помощью многоточечного замедленного 2D-изображения до 13 ч кокультуры.
Модель сокультуры живых клеток была создана с использованием клеток карциномы 4T1 мыши и макрофагов мыши M1. Чтобы отличить клетки друг от друга, 4T1 клетки были окрашены с помощью ФЛуоресцентного красителя CFSE (см. раздел 4). CFSE позволяет отслеживать ячейки и контролировать деление клеток. CFSE может пассивно рассеиваться в клетки, что делает CFSE окрашивания подходящий трекер клеток для визуализации фагоцитоза целевых клеток. Как фагоцитные макрофаги переваривают и поглотить раковые клетки, они занимают красителя CFSE и в конечном итоге стать флуоресцентными12,13. Очень важно, чтобы семена 4T1 клеток в изображении блюдо до M1 макрофагов. Это связано с различными размерами и формами обеих клеток. Клетки 4T1 имеют эпителиальную морфологию, которая размножается в небольших кластерах. Кроме того, 4T1 клетки должны быть окрашены CFSE до кокультуры с неокрашенными m1 макрофагов. Перед поляризизацией макрофагов с помощью LPS и IFN-я, макрофаги RAW 264.7 являются круглыми, небольшими и обычно растут как одиночные клетки. После LPS и IFN-я поляризации, индуцированных M1 макрофаги имеют относительно уплощенные, блиноподобные формы, с пористой цитоплазмы14,15. Для обеспечения надлежащей поляризации RAW 264.7 к m1 состоянию, 100 нг/мл LPS и 20 нг/мЛ IFN-я стимулировали макрофаги были immunostained с маркером M1, анти-iNOS антитела сопряжены с FITC (Рисунок 1). Этот протокол выполняется перед сокультивированием макрофагов и целевых клеток, чтобы гарантировать, что макрофаги полностью поляризованы в состояние M1.
Это исследование описывает метод флуоресцентной микроскопии для визуализации фагоцитарной активности живых макрофагов. Чтобы свести к минимуму фотоотрубацию и обеспечить лучшую визуализацию флуоресценции, флуоресцентная микроскопия может быть объединена с другими методами визуализации, которые не разрушают флюорохром, подобно DIC. В настоящем протоколе описываются материалы и методы, необходимые для оценки фагоцитоза клеток карциномы мыши, lpS и IFN-я стимулировали макрофаги с использованием флуоресцентной и DIC замедленной микроскопии. Тем не менее, флуоресцентные исследования микроскопии имеют ограничения при изучении живой клетки изображения по сравнению с фазовой контрастной замедленной визуализации. Во время флуоресцентной визуализации живых клеток длительное воздействие большого количества возбуждания может вызвать серьезное повреждение клеток16. Фотоотрубья может вызвать значительные проблемы в живой клетке изображения. Высокоинтенсивное освещение, используемое в живой клетке изображения может уменьшить способность красителя CFSE флуоресцировать. Тем не менее, 13 h фагоцитоз оценка была достигнута во второй части этого исследования с использованием фазового контрастного покадровой 2D-изображения(фильмы 2-5).
Микроскопия замедленного действия предлагает такие преимущества, как генерация данных из одного эксперимента в любой момент времени в течение желаемого периода продолжительности, и значительно, несколько этапных точек в рамках одной визуализации блюдо может быть захвачен для одного эксперимента. Это позволяет наблюдать различные позиции в одном эксперименте. Протокол также может быть использован с использованием нескольких колодцев из культурных плит (например, 6, 24, 96 колодцев). Среди наиболее важных технических задач для выполнения успешных живых клеток визуализации эксперимент включает в себя поддержание клеток в здоровом состоянии с помощью инкубатора верхней стадии, чтобы обеспечить стабильную температуру 37 градусов по Цельсию, 95% влажности, и 5% CO2. Поскольку эксперимент занял 13 ч, обеспечение нормального функции микроскопа на протяжении всего этого процесса имеет решающее значение.
В ходе этого исследования, шесть различных точек в изображении блюдо были захвачены в течение 13 ч продолжительность 15 минут интервалы на точку (фильм 2). Точки могут быть скорректированы в зависимости от события исследуемой ячейки. Учитывая, что в ходе эксперимента необходимо уфиксировать несколько этапов, важно убедиться, что каждая точка имеет стабильный фокус перед выполнением видеозаписи с живой ячейкой. Интервал времени для исследования должен быть оптимизирован. Снижение интервала времени будет иметь более подробные точки, которые могут быть изображены; однако размер файла будет очень большим. Увеличение интервала времени приведет к длительным видео и сделает фильм потерять преемственность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была финансово профинансирована Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Мы хотели бы поблагодарить Агро-Биотехнологический институт, Малайзия (ABI) лаборатории, и микроскопии изображений объекта. Особая благодарность Мохду Даниэлю Хазиму за помощь в редактировании и записи экспериментального видео для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
