本文介绍了一种培养和分析从小鼠肾脏中分离的包囊性肾小球的肾小球壁层上皮细胞外生长物的方法。该方法可用于研究参与壁层上皮细胞增殖和迁移的相关通路。
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摘要
摘要
壁上皮细胞（PEC）活化是参与肾小球硬化发生与进展的关键因素之一。因此，抑制参与壁上皮细胞活化的信号通路可能成为减缓肾小球疾病进展的一种手段。本文介绍了一种培养和分析从小鼠肾脏中分离出的包囊性肾小球壁上皮细胞外生长的方法。在解剖分离的小鼠肾脏后，将组织剪碎，并通过筛分法分离肾小球。收集包囊性肾小球，将单个肾小球培养6天，以获得壁上皮细胞的肾小球外生长。在此期间，可通过测定细胞数量或外生长细胞的表面积来分析壁上皮细胞的增殖和迁移情况。因此，该检测方法可用于研究转基因或基因敲除小鼠中基因表达改变，或培养条件对壁上皮细胞生长特性及信号传导的影响。利用该方法，可深入研究参与壁上皮细胞活化过程以及继而参与肾小球硬化的关键信号通路。
引言
肾小球疾病是一类重要的肾脏疾病，也是终末期肾病（ESRD）的主要病因之一。遗憾的是，目前特异性治疗手段有限，疾病进展至终末期肾病往往不可避免。肾小球疾病以存在肾小球损伤为特征，可分为炎症性和非炎症性疾病。尽管初始致病因素不同，但近期研究表明，无论基础病因如何，所有肾小球疾病均通过一种共同的细胞机制导致肾小球上皮细胞增生，最终发展为肾小球硬化1,2,3,4。
研究表明，肾小球硬化性病变主要由活化的壁层上皮细胞构成5,6。在生理条件下，壁层上皮细胞是扁平、静息状态的上皮细胞，衬于肾小球的鲍曼囊内壁。然而，任何导致肾小球损伤的因素，如基因突变（例如足细胞特异性突变或线粒体细胞病变）、炎症或高滤过状态（例如由肾单位减少、高血压、肥胖或糖尿病引起），均可触发壁层上皮细胞的活化。活化的壁层上皮细胞发生增殖并沉积细胞外基质，从而形成细胞性新月体或硬化性病变5,7,8。这些过程的进展将导致肾功能丧失9。因此，壁层上皮细胞的活化是炎症性和非炎症性肾小球疾病中肾小球硬化发生与进展的关键因素1,2,3,4,10。
介导壁层上皮细胞活化的分子过程在很大程度上仍不清楚。近期研究表明，活化的壁层上皮细胞会从头表达CD44，这是一种在细胞增殖和迁移相关多种信号通路激活中起重要作用的受体。此外，在炎症性和非炎症性肾小球疾病的动物模型中，抑制CD44可抑制壁层上皮细胞的活化，并减轻新月体形成和肾小球硬化的进展11,12。
由于壁上皮细胞的活化是肾小球硬化和新月体形成的关键因素，抑制这些细胞的活化可能减缓肾小球疾病的进展。阐明驱动壁上皮细胞活化的分子通路，可能有助于开发特异性治疗干预措施，以减轻肾小球疾病中增生性及肾小球硬化性病变的形成。
在实验性动物模型中，要证明基因表达改变（如基因敲除模型或转基因小鼠模型）或药物处理对壁层上皮细胞具有直接作用，通常十分困难。在传统的基因敲除小鼠中，所观察到的体内变化可能源于壁层上皮细胞的直接改变。然而，由于该基因在小鼠其他细胞类型中也发生了表达改变，因此不能排除由其他细胞类型介导的间接效应。近年来，利用主要在壁层上皮细胞中活跃的启动子驱动的条件性cre-lox小鼠模型，在某些情况下提供了解决方案13。然而，条件性转基因模型构建复杂，尽管越来越多的条件性品系已被开发，但对于许多传统的基因敲除或转基因小鼠品系而言，目前仍缺乏相应的条件性替代模型。
为了研究对壁层上皮细胞的直接作用，我们课题组建立了一种离体检测方法，该方法使用从鼠肾脏中分离出的单个包封肾小球 isolated ，以测量和分析壁层上皮细胞的增殖与迁移。该方法将有助于我们确定壁层上皮细胞的特异性效应，揭示导致其活化的相关通路，并测试抑制这种活化的治疗方案。
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方案
所有动物实验均按照奈梅亨拉德堡德大学动物伦理委员会的指南进行。
注意：未治疗的健康野生型（WT）小鼠（n = 4）和cd44-/-（n = 4）小鼠在12−16周龄时被处死。实验中使用了雄性和雌性小鼠。所有小鼠均处于C57Bl/6遗传背景。
1. 小鼠肾脏解剖
- 通过颈椎脱位法处死健康的野生型小鼠或基因改造小鼠。
- 在处死小鼠后立即解剖完整的小鼠肾脏。操作时，使用腹部剪刀进行正中腹切口，依次剪开皮肤和腹壁肌肉。取出肠管并置于小鼠体侧。
- 用手术镊子分离肾脏周围的结缔组织，夹住肾脏并将其拉出，同时用剪刀切断肾动脉、肾静脉和输尿管。
- 用手术镊子夹住肾脏，再用另一把镊子剥离并去除肾包膜。
- 将肾脏放入已预先加入2 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的6孔细胞培养板中（每孔2个肾脏），并置于冰上。
2. 从小鼠肾脏中分离肾小球
- 将肾脏转移至一个100 mm的培养皿中，使用两把手术刀将肾脏切成1−2 mm大小的小块。用1−2 mL的HBSS保持切碎的肾组织湿润。
- 将切碎的肾组织置于300 µm金属筛网上，使用20 mL注射器的推杆将肾组织压过筛网。在操作过程中反复用HBSS冲洗筛网，并用移液管将滤过液收集至一个干净的培养皿中。用手术刀刮下残留在筛网底面的所有组织/粘附物，并将其转移至已收集的滤过液中（即肾组织匀浆）。
- 用HBSS将肾组织匀浆通过75 µm筛网过滤，收集滤过液，再将该滤过液通过53 µm筛网进行二次过滤。使用HBSS清洗两个筛网，以去除所有较小的结构。
注意：此步骤中仅用HBSS冲洗滤过液，不得用力将组织压过75 µm和53 µm筛网。清洗的目的是去除碎片和较小结构，通常共需使用200−300 mL的HBSS。 - 用添加20%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）冲洗75 µm和53 µm筛网的上表面，收集滞留在筛网上的肾组织/材料，并将其转移至6孔超低吸附细胞培养板中。
注意：为清洗筛网上表面，应将筛网倾斜（>45°）冲洗，并在筛网边缘收集肾组织。所收集的材料富含带包膜和去包膜的肾小球，仅含少量肾小管片段。带包膜的肾小球具有很强的粘附性。为获得单个肾小球，必须防止其粘附在培养皿或孔板表面。为避免粘附，本步骤中应使用含20% FCS的培养基，并采用超低吸附培养板。
3. 肾小球外植体培养
- 将超低吸附微孔板置于倒置光学显微镜下，使用20 µL移液器收集单个包封和/或去包封的肾小球。避免吸取其他结构或碎片。当移液器吸头中已收集到 单个肾小球后，向同一吸头中加入不含已收集肾脏材料的新鲜DMEM培养基，使总体积达到20 µL。
- 将含有20 µL DMEM培养基的单个肾小球转移至24孔细胞培养板的孔中央，于37 °C、5% (v/v) CO2条件下孵育3小时，以使肾小球附着于孔底中央。移动培养板时应小心，避免肾小球漂浮至孔的边缘。
- 孵育3小时后，肾小球已附着于孔中央。小心向每孔中加入500 µL内皮细胞基础培养基（EBM），该培养基需添加含氢化可的松、人内皮细胞生长因子、牛脑提取物和硫酸庆大霉素-两性霉素B的生长因子试剂盒（材料表），并额外补充5% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素/链霉素（pen/strep）。
- 在37 °C、5% (v/v) CO2条件下培养单个肾小球6天。
注意：在6天内将形成由壁层上皮细胞组成的细胞外延生长。若需检测特定化合物或药物对壁层上皮细胞的影响，应在该六天培养期间将其加入培养基中。
4. 壁层上皮细胞增殖的分析
- 在培养6天后分析肾小球的外生长情况。使用数字倒置光学显微镜拍摄显微图像。
- 使用图像分析软件（例如 ImageJ/FIJI）测定肾小球外生长的表面积、直径，以及外生长细胞或外生长肾小球的数量。
- 为测定肾小球外生长的表面积，将带有比例尺的肾小球外生长 tif. 文件在 ImageJ 中打开。在比例尺上绘制一条直线，通过点击 analyze（分析）并选择测量功能，确定其像素距离（例如，1 mm = 460 像素）。
- 点击 analyze（分析），选择“set scale”（设置比例尺），输入已知的像素距离（例如，460），同时输入已知的实际距离（例如，1）和长度单位（例如，mm）。点击 ok（确定）。
- 点击 analyze（分析），然后选择“set measurements”（设置测量项），以确定结果表格中将显示哪些参数。为测定肾小球外生长的表面积，请勾选“area”（面积）和“display label”（显示标签）选项。点击 ok（确定）。
- 为测定肾小球外生长的表面积，使用自由手绘工具围绕肾小球外生长区域绘制轮廓。点击 analyze（分析），然后选择“measure”（测量），ImageJ 将弹出结果表格，显示按照先前设定比例尺计算出的外生长表面积（见步骤 4.4，例如 mm2）。
5. 肾小球细胞生长特性的表征
注意：为了评估出块的细胞组成，需在第6天对肾小球出块进行细胞特异性标志物的免疫荧光染色。
- 小心吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤肾小球两次。
- 使用含4%（w/v）蔗糖的2%（w/v）多聚甲醛（PFA）PBS溶液在室温下固定10分钟，然后用PBS小心洗涤两次。
- 将肾小球与适当浓度的一抗（参见材料表）在含1%（v/v）绵羊血清白蛋白（BSA）的PBS中稀释后，在室温孵育1小时。
- 移除一抗溶液，并用PBS小心洗涤三次。
- 加入适当稀释的二抗（参见材料表），溶于含1%（v/v）BSA的PBS中，避光、室温孵育45分钟。
- 用PBS小心洗涤三次，加入1−2滴含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂封片，并用圆形盖玻片覆盖孔板。
- 使用荧光显微镜采集显微图像。
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结果
执行肾小球外生长实验的方法系统示意图见图1。图2A-D展示了包囊肾小球在不同时间点的外生长情况，通过光学显微镜观察获得。在从小鼠肾脏分离肾小球后，培养第2、4和6天可见外生长现象（图2B-D）。为验证外生长细胞为壁层上皮细胞，还分离并培养了去包囊肾小球6天，结果如图2E,F所示。去包囊肾小球在6天培养期间未见细胞外生长。在图3中，对多种壁层上皮细胞标志物、足细胞特异性标志物以及内皮细胞标志物进行了免疫荧光染色，结果证实外生长细胞确为壁层上皮细胞。图4展示了cd44-/-小鼠与野生型（WT）小鼠分离的包...
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讨论
利用本文所述的实验方案，可通过单个包埋的肾小球来评估壁上皮细胞的增殖情况，而该增殖是壁上皮细胞活化的结果。这种离体模型将使我们能够深入研究参与壁上皮细胞活化的分子通路。该方法基于简单的肾脏解剖与过筛技术，用于分离并培养包埋的肾小球，从而在不同实验条件下比较壁上皮细胞的增殖和/或迁移能力。培养6天后可分析的指标包括：单个包埋肾小球的外生长区域面积或直径，或外生长细胞的数量等。该检测方法的另一应用可能是研究诱导或抑制参与壁上皮细胞活化相关分子通路的药物效应。
免疫荧光染色证实，培养6天后长出的细胞为壁上皮细胞，因为它们对壁上皮细胞标志物（CD44、claudin-1、SSeCKS）呈阳性染色，但不表达足细胞特异性标志物synaptopodin，也不表达内皮细胞标志物CD31。与染色结果一致，在分离并培养单个去包膜肾小球后6天内未观察到细胞长出，表明在此6天期间，细胞爬出物中其他肾小球细胞的污染极为有限。另一项研究也分析了肾小球细胞爬出物，并表明来源于肾小球爬出物的快速增殖细胞确实起源于壁上皮细胞14。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由荷兰肾脏基金会（资助号 14A3D104）和荷兰科学研究组织（NWO VIDI 资助号：016.156.363）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔细胞培养板 | Corning Costar | ||
| 抗CD31抗体 | BD Pharmingen | 内皮细胞标记物（使用浓度1:200） | |
| 鸡抗大鼠Alexa 647 | Thermo Fisher | （使用浓度1:200） | |
| 含DAPI的Fluoromount G封片剂 | Southern Biotech | 含有DAPI的封片介质 | |
| 数字倒置光学显微镜 | Westburg，EVOS fl显微镜 | ||
| 驴抗山羊Alexa 568 | Thermo Fisher | （使用浓度1:200） | |
| 驴抗兔Alexa 568 | Thermo Fisher | （使用浓度1:200） | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Lonza | ||
| EBM培养基 | Lonza | ||
| EBM-MV单种补充剂试剂盒 | Lonza | 包含氢化可的松、hEGF、GA-1000、FBS和BBE | |
| 胎牛血清 | Lonza | ||
| 新生小牛血清 | Lonza | ||
| 荧光显微镜 | Leica Microsystems GmbH | ||
| 山羊抗突触足蛋白抗体 | Santa Cruz | 足细胞标记物（使用浓度1:200） | |
| Hanks平衡盐溶液 | Gibco | ||
| ImageJ软件 | FIJI 1.51n | ||
| 培养皿 | Sarstedt | 尺寸100 | |
| 兔抗claudin1抗体 | Abcam | 壁层上皮细胞标记物（使用浓度1:100） | |
| 兔抗SSeCKS抗体 | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA | 由E. Gelman博士惠赠，用于标记壁层上皮细胞 | |
| 大鼠抗CD44抗体 | BD Pharmingen | 壁层上皮细胞标记物（使用浓度1:200） | |
| 手术刀 | Dahlhausen | 尺寸10 | |
| 筛网 | Endecotts Ltd | 孔径300 µm、75 µm、53 µm，不锈钢材质 | |
| 注射器 | BD Plastipak | 规格：20 ml | |
| 超低吸附微孔板 | Corning Costar | 6孔板 |
参考文献
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