球状外生长作为前维沃分析分析涉及的路径的表皮上皮细胞激活

肾球疾病是肾病的重要群体，是最终期肾病（ESRD）的一个根本原因。不幸的是，具体的治疗选择是有限的，进展到ESRD是不可避免的。球状疾病由球状损伤的存在定义，可分组在炎症和非炎症性疾病中。虽然最初的侮辱是不同的，最近的研究表明，一个共同的细胞机制导致球状上皮细胞增生，并最终导致所有球状疾病的球状硬化症，无论根本原因^{1，2，3，4。2,3,41}

具体来说，它表明，球状硬化病变主要由活化的表皮上皮细胞^5，6,组成。在生理条件下，表皮上皮细胞是平的静态上皮细胞，与鲍曼的球状胶囊一起。然而，任何由于基因突变（如足细胞特异性或线粒体细胞病变）、炎症或超滤（例如，由肾质量降低、高血压、肥胖或糖尿病肌酸引起的肾球菌损伤）都可能引发表皮上皮细胞的激活。活性的表皮上皮细胞增殖并沉积细胞外基质，导致细胞新月或^,硬化病变^{5、7、87的形成}。⁵这些过程的进展导致肾功能丧失^9。因此，在炎症和非炎症性球菌疾病1、2、3、4、10中，皮皮上皮细胞活化是^球,2,3,菌硬化^的发育^{和进展的关键因素}。

分子过程调解表皮上皮细胞活化仍然在很大程度上未知。最近的研究表明，激活的皮皮上皮细胞d novo快递CD44，一种受体，是重要的激活参与细胞增殖和迁移的不同途径。此外，CD44的抑制作用被证明能抑制表皮上皮细胞活化，并减轻炎症和非炎症性球菌病动物模型中新月形成和球状硬化的进展^。,12

由于单体上皮细胞活化是发展球状硬化和新月形成的关键技术，抑制这些细胞可以减缓球状疾病的进展。促进单体上皮细胞活化的分子通路的阐释可能导致特定治疗干预措施的发展，减少球状疾病中超塑料和球状硬化病变的形成。

在实验动物模型中，通常很难提供证据，证明基因表达的改变（淘汰模型或转基因小鼠模型）或药物治疗对表皮上皮细胞的直接影响。在传统的敲出小鼠中，观察到的体内变化可以通过皮皮上皮细胞的直接变化来解释。然而，由于基因表达在小鼠中的其他细胞类型中也发生了变化，因此不能排除由其他细胞类型调解的间接效应。由主要活跃在表皮上皮细胞中的启动子驱动的有条件的 cre-lox 小鼠的发展，在某些情况下^{提供了一个解决方案。}然而，有条件的转基因模型是复杂的，虽然有更多的条件线可用，对于许多传统的淘汰或转基因小鼠线，还没有一个有条件的替代品。

为了研究对单体上皮细胞的直接影响，我们组开发了一种前体外测定，使用从小鼠肾脏分离出的单封装球蛋白来测量和分析表皮上皮细胞增殖和迁移。此方法将使我们能够确定单皮上皮细胞特异性效应，并找到负责任的途径，为单皮上皮细胞激活和测试治疗选项，以抑制这种激活。

所有动物实验都是按照拉德布德大学尼梅根大学动物伦理委员会的指导方针进行的。

注:未经治疗的、健康的野生型小鼠（n = 4） 和cd44-/--（n = 4）小鼠在12~16周龄被牺牲。使用雄性小鼠和雌性小鼠。所有小鼠都在C57Bl/6背景。

1. 小鼠肾脏解剖

1. 通过宫颈脱位牺牲健康的WT小鼠或基因改变的小鼠。
2. 牺牲老鼠后直接解剖整个小鼠肾脏。为此，使用腹部剪刀进行腹腔切除中位手术，切割皮肤，然后切割腹部肌肉。取出肠子，放在鼠标旁边。
3. 释放肾脏从连接组织，并拉出肾脏使用手术钳，用剪刀切割肾动脉，肾静脉和尿道。
4. 用手术钳握住肾脏，取出肾脏胶囊，用另一对钳子取出胶囊。
5. 将肾脏放在一个6井细胞培养板（2个肾脏/井）准备与2 mL的汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）每井，并放在冰上。

2. 从小鼠肾脏分离球状

1. 将肾脏转移到100毫米培养皿中，用两个手术刀将肾脏切成1×2毫米的小碎片。使用 1~2 mL 的 HBSS 保持碎肾片湿润。
2. 将切碎的肾脏片放在 300 μm 金属筛的顶部，并使用 20 mL 注射器的柱塞压压肾脏。在两者之间用HSS反复冲洗筛子，并使用血清学移液器在干净的培养皿中收集流经。收集所有留在/粘在筛子底部的，用手术刀刮掉它，并转移到收集的流（肾同质）。
3. 用HSSS通过75μm筛冲洗肾脏均质。收集流经，然后通过 53 μm 筛子冲洗此流。使用 HBSS 清洗两个筛子，以清除所有较小的结构。
   注意:在此步骤中，流量虽然只冲洗，但压过75μm和53μm筛。使用 HBSS 进行清洗，以清除筛子上的碎屑和较小的结构。因此，通常总共使用 200~300 mL 的 HBSS。
4. 使用 Dulbecco 的改良 Eagle 介质 （DMEM） 辅以 20% 胎儿小牛血清 （FCS） 来清洗筛子的上表面，并转移材料到 6 孔超低附着微孔板中，收集留在 75 μm 和 53 μm 筛子上的肾脏结构/材料。
   注:要清洗筛子的上表面，请以倾斜位置（>45°）冲洗筛子，并在筛子边缘收集肾脏材料。收集的材料被丰富为封装以及斩首的糖，只显示几个管状碎片。封装的球状非常粘。因此，要收集单球蛋白，必须防止球状粘附在培养皿或井盘的表面。为避免粘附，请使用具有 20% FCS 的介质，并在此步骤中使用超低附件板。

3. 球状生长的培养

1. 将超低附件微孔板置于倒置光学显微镜上，并收集带有 20 μL 移液器的单封装和/或斩首的 glomeruli。避免移液其他结构和碎屑。在移液器尖端收集单个球状后，将新鲜的 DMEM 介质添加到同一移液器尖端中，而不收集肾脏材料，达到 20 μL 的体积。
2. 将带有 20 μL DMEM 介质的单球蛋白转移到 24 井细胞培养板的井的中心，并在 37 °C 和 5% （v/v） CO 2 下孵育₃ 小时，以便将球状附着到井的中心。小心地移动板，以避免球状物漂浮到井的板子上。
3. 经过3小时孵育，球状体附着在井的中心。小心地添加 500 μL 的内皮基底介质 （EBM）， 辅以含有氢皮质松、人类内皮生长因子、牛脑提取物和硫酸氨基素 B （材料表） 的生长因子套件， 以及额外的 5% （v/v） FBS 和 1% （v/v） 青霉素 / 链霉素 （笔/链霉素） 到每个井。
4. 培养单球菌在37°C下6天，5%（v/v）CO_2。
   注:在6天内形成由表皮上皮细胞组成的外向。如果一个人打算测试特定化合物或药物对表皮上皮细胞的影响，它应该在这六天期间添加到介质中。

4. 表皮上皮细胞增殖分析

1. 分析6天后的球状生长。使用数字反光显微镜拍摄显微图像。
2. 使用图像分析软件（例如 ImageJ/FIJI）确定球状生长的表面面积和直径，以及生长的细胞数量或生长的球状球蛋白的数量。
   1. 要确定球状生长的表面面积，请打开 tif。在 ImageJ 中具有比例条的球状增长文件。在比例栏上画一条直线，通过单击分析和测量（例如 1 mm = 460 像素）确定以像素为单位的距离。 analyze
   2. 通过单击分析、设置比例并在像素（例如 460）中键入已知距离、键入已知距离（例如 1）和长度单位（例如 1 mm）来确定比例。单击"确定"。
   3. 通过单击分析并设置测量值，确定结果将显示在结果表中的结果。要确定球状生长的表面面积，请激活选项区域并显示标签。单击"确定"。
   4. 要确定球状生长的表面面积，请围绕球状生长图绘制一个徒手选择。单击 分析 ，然后测量结果表，将在 ImageJ 中弹出一个结果表，显示早期确定比例中增长的表面面积（参见步骤 4.4，例如 mm²）。

5. 球状细胞生长的特征

注:为了评估生长的细胞组成，在t=6天的球状外培养上对细胞特异性标记物进行免疫荧光染色。

1. 小心地取出介质，使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻清洗球状两次。
2. 在室温下固定 10 分钟，使用 2% （w/v） 半成甲醛 （PFA）， 辅以 4% （w/v） 蔗糖在 PBS 中，并使用 PBS 小心洗涤 2 倍。
3. 用适当浓度（材料表）在PBS-牛Table of Materials血清白蛋白（BSA）1%（v/v）中稀释的原抗体孵育1小时室温。
4. 取出抗体溶液，用PBS小心洗涤3x。
5. 用二次抗体（材料表）在黑暗中稀释PBS-BSA 1%（v/v）45分钟室温。
6. 用 PBS 小心地清洗 3 倍，并使用 1~2 滴水性安装介质与 4°，6-6-6-2-苯酚多烯 （DAPI） 进行安装，以可视化核，并使用圆形盖滑盖住井。
7. 使用荧光显微镜拍摄显微图像。

图1显示了执行球状生长分析方法的系统图。图 2A-D显示了在使用光显微镜观察到的不同时间点的封装球状球蛋白的球状增长。在从小鼠肾脏分离后，在培养中的第2天、第4天和6天（图2B-D）显示出树。为了验证外生长的细胞是表皮上皮细胞，斩首的球状体也分离和培养了6天，如图2E，F所示。在6天内，被斩首的球蛋白在潜伏期内没有细胞外培养。在图3中，针对不同的表皮上皮细胞标记、足细胞特异性标记以及内皮细胞标记进行了免疫荧光染色。结果证实，外生长细胞确实是表皮上皮细胞。图4显示了在培养6天后从cd44-/-----与WT小鼠中分离的封装球蛋白的外培养。与从WT小鼠分离出的球状体相比，从cd44-/-小鼠中分离出的球蛋白显示，生长细胞数量减少，球状生长表面积减少，这表明CD44在上皮细胞活化中具有重要作用，如先前发表的11。在图5中，给出一个示例，其中使用 ImageJ 确定外生长的表皮上皮细胞的表面积。

图1:执行球状生长测定方法的示意图概述，分析表皮上皮细胞增殖。 （1） 肾脏从牺牲的老鼠解剖，并切碎成小块。（2） 肾脏组织通过300μm筛压，通过75μm和53μm筛冲洗。（3） 保持筛子顶部的 Glomeruli 使用中等 ± 20% （v/v） FCS 收集，并转移到超低附件板上。（4） 使用倒置光学显微镜收集单球蛋白，并转移到24孔培养板。（5） 在37°C、5%（v/v）CO2下孵 育6天后，可使用数字倒置光学显微镜分析球状生长。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:从WT小鼠解剖的肾脏中分离的封装球状球蛋白的球状生长。 在37°C孵育的封装球蛋白的外长在不同时间点显示:（A） 0天，（B） 2天，（C） 4天，和（D） 6天。斩首的球蛋白也被分离和培养在37°C和微观图像被拍摄在第（E）天0和（F）第6天显示没有生长细胞。比例线:A， E， F） 200 μm， （B） 400 μm， （C， D） 1000 μm . 请点击这里查看这个数字的较大版本.

图3:外生长的肾上皮细胞显示表皮上皮细胞标记的表达。 免疫荧光染色在第6天进行后，分离单封装球菌，以表征外生长的上皮细胞。外生长细胞染色阳性的表皮上皮细胞标记:（A） CD44， （B） SSeCKS ， 和 （C） claudin-1， 但没有显示表达的足细胞特异性标记突触， 或 （E） 内皮细胞特异性标记 CD31， 这是专门本地化在球状体内.比例线:A， B， D， E） 100μm， （C） 50 μm. 请点击这里查看这个数字的较大版本.

图4:从CD44敲除小鼠分离出来球状生长的球状生长受损。从 （ A ）WT小鼠和 （ B ） cd44-/- 小鼠的解剖肾脏中分离出密封的球状体.显微镜照片是在培养6天后使用数字反光显微镜拍摄的。与cd44-/---小鼠相比，WT小鼠的外显性表皮上皮细胞数量以及外显细胞的表面积增加，表明CD44在表皮上皮细胞活化中具有重要作用。比例线: 10 μm.请单击此处查看此图的较大版本。

图5:使用 ImageJ （FIJI） 分析球状生长的表面积作为表皮上皮细胞增殖标记的示例。（A） 在37°C的培养中，6天后，WT小鼠的封装球状的球状生长。（B） 首先，确定刻度以毫米2为单位分析表面积。这里: 1 毫米 × 460 像素。（C） 设置比例后，在球状生长面积周围绘制一条选择线。（D） 然后可以测量此选定区域（本例中的表面积 = 2.235 mm2）。比例线: 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

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