通过不同的均质化方法从小鼠大脑/脊髓中检索到的多种细胞类型的同步流细胞测量特征

Summary

我们提出了一种流式细胞测定方法，用于识别从小鼠大脑或脊髓中检索到的不同细胞类型。该方法可用于分离或描述神经退行性疾病中的纯细胞群，或量化细胞靶向在体内给病毒载体或纳米粒子的靶向范围。

Abstract

病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操纵中枢神经系统（CNS）的新方法开辟了道路。然而，这些技术的进一步优化将受益于在体内病毒载体或纳米粒子的培养后，能够快速和简化地确定中枢神经系统和细胞特定靶向的范围的方法。在这里，我们提出一个协议，利用流式细胞学的高通量和多路复用功能，允许从小鼠大脑或脊髓中分离的不同细胞亚型，即微胶质/巨噬细胞、淋巴细胞、星细胞、寡核苷酸细胞、神经元和内皮细胞进行直接定量。我们应用这种方法来突出两个组织均质方法在细胞产量、活力和组成方面的重要差异。这可以指示用户根据感兴趣的单元格类型和特定应用程序选择最佳方法。此方法不适合分析解剖分布，因为组织是同质化的，以产生单细胞悬浮液。然而，它允许与活细胞一起工作，它可以与细胞分类相结合，为几种应用开辟了道路，这些应用可以扩大神经科学家手中的工具范围，从建立从纯细胞种群衍生的初级培养物，到基因表达分析以及神经退行性疾病背景下明确定义的细胞亚型的基因表达或功能测定，在药物治疗或基因治疗时。

Introduction

基因和药物输送技术（如病毒载体和纳米粒子）已成为一个强大的工具，可以应用来获得对神经退行性疾病中改变的特定分子途径的更好见解，并开发创新的治疗方法1，2，3。这些工具的优化取决于以下方面:（1） 不同管理途径在中枢神经系统的渗透程度，以及（2） 针对特定细胞群。组织学分析通常应用于可视化荧光报告基因或荧光标记纳米粒子在不同的CNS区域和不同的细胞类型，通过免疫染色特定细胞^标记4，5识别。尽管这种方法提供了关于施用基因或药物输送工具的生物分布的宝贵信息，但该技术可能非常耗时和耗费大量人力，因为它需要:（1） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 有时需要抗原检索的特定细胞标记物的染色;（3） 通过荧光显微镜采集，通常允许在同一实验中分析有限数量的不同标记;（4）图像处理，允许对感兴趣的信号进行适当的量化。

流式细胞学已成为一种广泛使用的技术，它利用非常特殊的荧光标记，不仅允许根据表面或细胞内抗原的表达对细胞悬浮液中的不同细胞表型进行快速定量评估，而且还允许功能测量（例如，凋亡率、增殖率、细胞周期分析等）。也可以通过荧光活化细胞分....

Protocol

此处描述的所有方法均已获得达纳法伯癌症研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议号16-024）。

1. 准备实验所需的解决方案

1. 用无菌水稀释10xHBSS，制备1x汉克的平衡盐溶液（HBSS）。在冰上预冷溶液。每个样品至少需要25 mL的溶液。
2. 通过将 10 倍无菌 HBSS 1:10 与密度梯度介质（即 Percoll）混合，制备等值贴贴胶溶液 （IPS）。在冰上预冷。
   注:IPS 可在 4°C 下存储长达 30 天。
3. 制备流式细胞学 （FACS） 阻断 （BL） 溶液 （1% 牛血清白蛋白 [BSA]， 5% 胎儿牛血清 [FBS] 在磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）。在冰上预冷。

2. 通过心脏内灌注和组织解剖进行动物安乐死

注:实验中使用了8周大的C57BL/6J小鼠，无论是性别还是性别。在进行组织消化之前，使用PBS溶液进行灌注以消除器官的血液污染。

1. 使用氯胺酮/木氨酸的混合物（90⁄200毫克/千克氯胺酮，10毫克/千克木兰辛）对小鼠进行麻醉。将鼠标放在其背面，并将每个肢体向下胶带到支架。通过检查戒断反射来验证麻醉的充分深度。
2. 在胸腔入口的水平进行中线皮肤切口，以暴露胸骨。使用钳子抓住胸骨的尖端，然后在肋笼的每一侧切开一个1....

Results

我们比较了应用于小鼠大脑和脊髓的两种不同的均质化方法（DH与PD），以测试检索适合下游应用的不同可行细胞类型的效率。为此，我们利用了一个9色流细胞测定面板，设计成在同一样本中，包括微胶质、淋巴细胞、神经元、星形细胞、寡核苷酸和内皮球在内的不同中枢神经系统细胞类型。

从不同的小鼠（n = 6）中检索大脑和脊髓组织，纵向分成两半，使用Duce均质器（DH方法）进行机械干扰，或者使用基于木瓜（PD方法）的商业NTDK（图1A）轻轻切碎和消化酶。清除碎片后，将大脑或脊髓中的细胞分别稀释1/10或1⁄2+1/5，以Trypan蓝色确定细胞产量和活力，使用Neubauer室（图1B，C）。总体而言，DH 方法从大脑和脊髓中产生更高的细胞产量。然而，大部分被检索到的细胞都死了，结果大脑中只有13.8%~3.3%的活细胞，脊髓中只有10.5%~1.5%（图1B）。

Discussion

本文介绍一种协议，用于对小鼠大脑和脊髓中一些最相关的CNS细胞进行共纯化和并发流细胞学分析。传统上，组织学分析已应用于描述纳米粒子的分布或病毒载体在CNS^5，13的转导效率，或提供在病理学或药理治疗期间特定细胞类型发生的形态和分子变化的^见解14。然而，组织学缺乏过程性，由于可以同时分析的标记数量有限，因此无法全面检查同一组织学样本中的多个特征。我们的方法可以补充传统的组织学分析，它可以与几个下游应用（分类、初级培养、生化或下一代测序分析）相结合，以扩大从单个样本中获取的信息的汇编。但是，必须考虑下面列出的一些关键因素，因为它们会严重影响这种方法的成功:

1. 起始组织的数量。我们已经优化了细胞分离，从一半脊髓或半脑开始。根据我们的经验，使用 PD 方法处理来自 8 周大成人小鼠的半脑或半脊髓，从大脑中产生 1⁄6 x 10⁶个活细胞，在密度梯度步骤后从脊髓中产生大约 0.1±0.5 x 10⁶个活细胞。在新生儿或.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS（不含钙、氯化镁和硫酸镁）	Gibco	14185-052
70 mm 细胞过滤器	康宁	431751
ACSA/ACSA2 抗小鼠抗体	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC 偶联
血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b 大鼠抗小鼠抗体	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 偶联
CD31 大鼠抗小鼠抗体	BD Bioscience	562939	BV421 偶联
CD45 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 偶联
CD90.1/Thy1.1 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	202518	PE/Cy7 偶联
CD90.2/Thy1.2 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	1005325	PE/Cy7 偶联
锥形管 （15 mL）	CellTreat	229411
锥形管 （50 mL）	CellTreat	229422
Dounce 组织研磨机套装（包括研钵以及杵 A 和 B）	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc （CD16/CD32） 封闭大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen	553142
胎牛血清	基准	100-106
神经组织解离试剂盒 （P）	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 抗小鼠/大鼠/人抗体	Miltenyi Biotec	130-095-895	生物素偶联
Percoll	GE Healthcare	10266569	作为非无菌试剂出售
Percoll	Sigma	65455529	无菌试剂（用于需要无菌的应用）
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	试剂，含有极低痕量内毒素
霉亲和素	、Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 偶联