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方法文章

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

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DOI：

10.3791/60335

⸱

2019年11月19日

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。

摘要

病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操控中枢神经系统（CNS）开辟了新的前沿方法。然而，这些技术的进一步优化将受益于能够快速、高效地评估病毒载体或纳米颗粒在体内给药后对中枢神经系统及特定细胞靶向程度的方法。本文介绍了一种利用流式细胞术高通量和多重检测能力的实验方案，可对从小鼠脑或脊髓中分离出的不同细胞亚群（包括小胶质细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和内皮细胞）进行直接定量分析。我们应用该方法揭示了两种组织匀浆方法在细胞得率、活力和组成方面的关键差异，从而指导研究者根据所关注的细胞类型及具体应用选择最佳方法。该方法不适用于解剖分布的分析，因为组织需被匀浆以制备单细胞悬液。但该方法可获得活细胞，并可与细胞分选技术联用，为神经科学研究人员提供多种应用可能，例如从纯化的细胞群体建立原代培养，到在神经退行性疾病、药理学处理或基因治疗背景下，对明确定义的细胞亚群进行基因表达分析以及生化或功能检测。

引言

基因和药物递送技术（如病毒载体和纳米颗粒）已成为一种强大工具，可用于深入研究神经退行性疾病中发生改变的特定分子通路，并推动创新治疗策略的开发1,2,3。这些工具的优化依赖于对以下两个方面的定量分析：（1）不同给药途径下进入中枢神经系统（CNS）的渗透程度；（2）对特定细胞群体的靶向能力。通常采用组织学分析方法，通过针对特定细胞标志物的免疫染色来识别不同CNS区域和不同细胞类型，从而可视化荧光报告基因或荧光标记的纳米颗粒4,5。尽管该方法可提供有关所给予基因或药物递送工具生物分布的宝贵信息，但该技术通常耗时且劳动密集，因其需要完成以下步骤：（1）组织固定、冷冻保存或石蜡包埋及切片；（2）针对特定细胞标志物的染色，有时需进行抗原修复；（3）荧光显微镜成像，而该方法通常在同一实验中仅能分析有限数量的不同标志物；（4）图像处理，以实现对目标信号的准确定量。

流式细胞术已成为一种广泛应用的技术，该技术利用高度特异性的荧光标记物，不仅能够根据细胞表面或胞内抗原的表达情况，对细胞悬液中不同细胞表型进行快速定量分析，还可实现功能检测（例如细胞凋亡速率、增殖能力、细胞周期分析等）。通过荧光激活细胞分选实现细胞的物理分离也是可行的，从而支持后续多种应用（例如细胞培养、RNA测序、生化分析等）6,7,8。

组织匀浆是获得单细胞悬液的关键步骤，可确保后续流式细胞术分析的可靠性和可重复性。已有多种方法被用于成年脑组织的匀浆，主要目的是分离小胶质细胞9,10,11；这些方法总体上可分为两大类：（1）机械解离法，通过Dounce匀浆器（DH）施加研磨或剪切力，将细胞从其微环境中剥离，形成相对均一的单细胞悬液；（2）酶消化法，将切碎的组织块在37 °C条件下与蛋白水解酶（如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶）共同孵育，促进细胞外基质降解，从而获得较为均一的细胞悬液12。

无论采用哪种方法，在进行后续应用之前，建议在组织匀浆后通过密度梯度离心或磁性分选去除髓鞘，以实现纯化步骤9,12。

本文介绍了一种基于木瓜蛋白酶消化（PD）的组织处理方法，随后通过密度梯度离心进行纯化，该方法经过优化，可快速获得来自小鼠脑或脊髓的具有活性的异质性单细胞悬液，适用于流式细胞术分析。此外，我们还描述了实验室采用的9色流式细胞术检测方案及其设门策略，可同时区分中枢神经系统中的不同细胞群体、活细胞与死细胞，以及绿色荧光蛋白或罗丹明染料等荧光报告分子的表达情况。通过应用该流式细胞术分析方法，我们能够比较不同组织处理方式（如PD与DH）在细胞活性保持及各类细胞得率方面的差异。

本文提供的细节可根据特定的目标细胞类型及下游分析（例如温度敏感型应用、特定荧光标记的追踪、体外培养、功能分析）指导均质化方案以及流式细胞术检测面板中抗体组合的选择。

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方案

本文所述所有方法均已获得丹娜—法伯癌症研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 16-024）。

1. 实验所需溶液的配制

  1. 通过将10倍浓度的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）用无菌水稀释，制备1倍浓度的HBSS溶液。将溶液预先在冰上预冷。每个样品至少需要25 mL溶液。
  2. 通过将10倍无菌HBSS以1:10比例与密度梯度介质（如Percoll）混合，制备等渗Percoll溶液（IPS）。在冰上预冷。
    注意：IPS可在4 °C下保存最多30天。
  3. 制备流式细胞术（FACS）封闭（BL）溶液（含1%牛血清白蛋白[BSA]和5%胎牛血清[FBS]的磷酸盐缓冲液[PBS]）。在冰上预冷。

2. 通过心脏内灌注实施动物安乐死及组织解剖

注意：实验中使用8周龄的C57BL/6J小鼠，性别不限。在进行组织消化前，需用PBS溶液灌注以清除器官中的血液污染。

  1. 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮90−200 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。将小鼠仰卧固定于支撑面上，并用胶带固定四肢。通过检测缩足反射确认麻醉深度是否充分。
  2. 在胸廓入口水平沿中线做皮肤切口，暴露胸骨。用镊子夹住胸骨尖端，然后在肋骨两侧各做一个1 cm的切口。最后切开膈肌，充分打开胸骨以暴露心脏。
  3. 用镊子轻轻夹住右心室，将心脏提起至中线位置并稍移出胸腔。
  4. 将23 G蝶形针插入左心室尖部，朝向主动脉方向，并牢固固定。
  5. 开始以1x PBS进行灌注。用剪刀刺穿右心耳，使灌注液得以流出循环系统。将PBS流速设定为3 mL/min。至少灌注15 mL的1x PBS，以确保组织内血液完全清除。
    注意：肝脏和肠系膜血管变白是良好灌注的标志。如有必要，可增加预灌注体积，直至从心脏流出的液体无血，此时可停止冲洗管路。
  6. 灌注完成后，用剪刀和镊子将脑组织与脊髓分离，并取出颅骨内的脑组织。去除毛发以提高解剖过程中的可视性和操作控制，并避免毛发污染物带入。使用装有PBS的3 mL注射器冲洗脊髓，使其从椎管中脱出。
  7. 将每种组织转移至已预先加入2 mL冰上预冷的1x HBSS的6孔板中的一个孔内，并在冰上保存直至消化处理。
  8. 沿纵轴方向将脑和脊髓各切成两半。
    注意：每种组织的一半用于匀浆处理（见下文），以便进行流式细胞术分析；另一半可根据需要进行其他处理，用于替代性分析（例如，浸入多聚甲醛固定液中用于组织学分析）。

3. 脑和脊髓的酶消化

注意：本节所述体积适用于半份脑组织或脊髓组织的消化处理。

  1. 使用剪刀将组织剪切成 1−2 mm 厚的小块。
  2. 用剪刀剪去 1000 µL 移液枪枪头的尖端，使其足够粗大，以便收集组织块。用 1× HBSS 预润洗枪头。然后用移液枪将含有剪碎组织的 2 mL HBSS 溶液转移至 15 mL 锥形管中。
    注意：预润洗移液枪头至关重要，可防止组织块黏附在枪头内部。
  3. 用额外的 2 mL 冰冷 1× HBSS 清洗孔板孔，并将清洗液转移至含有组织块的相应 15 mL 锥形管中。
  4. 将每个样品在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。
  5. 通过将每份样品加入 50 µL 酶 P 和 1900 µL 缓冲液 X，配制神经组织解离试剂盒（NTDK；材料表）的酶混合液 1。将酶混合液 1 置于 37 °C 水浴中预热。使用前在 37 °C 孵育至少 10 分钟，以确保酶充分活化。
  6. 吸除 15 mL 锥形管中的上清液，向每份样品中加入 1.95 mL 酶混合液 1。轻轻涡旋振荡，确保沉淀完全重悬。
  7. 将样品置于摇床或振荡器上，在 37 °C 孵育 15 分钟。
  8. 在此期间，通过将每份样品加入 10 µL 酶 A 和 20 µL 缓冲液 Y，配制 NTDK 的酶混合液 2；将该溶液在 37 °C 水浴中预热。
  9. 酶混合液 1 孵育结束后，向每份样品中加入 30 µL 酶混合液 2。
  10. 使用经 1× HBSS 预润洗的 1000 µL 移液枪头，通过上下吹打轻轻混匀样品。
  11. 将样品置于摇床或振荡器上，在 37 °C 孵育 15 分钟。
  12. 孵育结束后，向每根试管中加入 10 mL 冰冷 1× HBSS，以灭活酶混合液 1 和酶混合液 2。
  13. 将每个样品在 4 °C 条件下以 320 × g 离心 10 分钟。
  14. 弃去上清液；向每根试管中加入冰冷 1× HBSS 至终体积为 7 mL，并通过涡旋振荡轻轻重悬沉淀。
  15. 继续进行第 5 节以去除碎片。

4. 脑和脊髓的机械匀浆

注意：本节所述体积适用于半只脑或脊髓的匀浆。本节所述方案可作为第3节所述方法的替代方案，具体选择取决于用户需求，如下文所述。

  1. 将Dounce组织研磨器的玻璃研钵（材料表）置于冰上预冷。
  2. 向研钵中加入3 mL预冷的1×HBSS。
  3. 将组织（脑或脊髓）从6孔板的孔中转移至玻璃研钵中，确保其浸没在1×HBSS中并沉至研钵底部。
  4. 先用研杵A轻轻研磨10次，再用研杵B研磨10次。将匀浆后的混合液转移至一个新的15 mL锥形管中。
  5. 用预冷的1×HBSS补加液体至终体积10 mL，于4 °C以320 × g 离心10分钟。
  6. 吸除上清液，向每根离心管中加入冰冷的1×HBSS至终体积7 mL，并通过涡旋轻轻重悬沉淀。
  7. 继续进行第5节操作以去除碎片。

5. 去除碎片

注意：去除主要由未消化的组织和髓鞘组成的碎片是关键步骤，可实现对组织匀浆的有效染色，以便后续进行流式细胞术分析。

  1. 将每个样品通过70 µm细胞滤筛过滤，以去除任何未消化的组织块。此步骤尤为重要，特别是在处理脊髓组织时，因为这些样品更可能含有未消化的神经碎片或脑膜，可能会影响后续步骤。
  2. 确保每个样品管中的终体积为7 mL。若不足，用预冷的1× HBSS补至7 mL。
  3. 向每个样品中加入3 mL预冷的IPS，使终体积为10 mL，其中密度梯度介质的终浓度为30%。轻轻涡旋混匀样品，确保其均匀混合。
  4. 在18 °C下以700 × g离心15分钟，离心时确保加速度设为7，刹车设为0。
    注意：离心过程总共约需30分钟。
  5. 小心地从离心机中取出样品。
    注意：应可见一层由碎片和髓鞘组成的白色盘状物漂浮在溶液表面，同时在管底可见一细胞沉淀（含目标细胞）。
  6. 小心吸除全部白色碎片层及剩余上清液，注意不要扰动沉淀。在细胞沉淀上方保留约100 µL溶液，以避免意外吸走沉淀。
  7. 加入1 mL FACS BL，用1000 µL移液枪头反复吹打重悬沉淀，并将样品转移至1.5 mL离心管中。
  8. 在室温（RT）下以450 × g离心5分钟。
  9. 轻轻吸除上清液，并将沉淀重悬于适合下游分析的适当缓冲液中（参见第6节中用于多细胞类型流式细胞术分析的方案）。

6. 多种细胞类型的流式细胞术检测染色

  1. 用350 µL FACS BL重悬第5.9步获得的沉淀。向每个样品中加入Fc阻断剂，终浓度为5 µg/mL。
    注意：每个染色反应至少应使用100 µL样品，以确保处理足够数量的细胞，从而进行可靠的分析。
  2. 将样品在4 °C孵育10分钟，然后进行染色步骤。
  3. 根据表1配制抗体混合液。
  4. 将抗体混合液加入各管中，涡旋振荡5秒，并在4 °C避光孵育15分钟。
  5. 向每管中加入1 mL PBS，涡旋振荡后在室温下以450 × g离心5分钟。
  6. 同时根据表1配制链霉亲和素混合液。
  7. 弃去上清液，将沉淀重悬于第6.6步配制的链霉亲和素混合液中。每个样品所用体积应与第6.4步染色时使用的体积相同。
  8. 涡旋振荡5秒，并在4 °C避光孵育10分钟。
  9. 向每管中加入1 mL PBS，涡旋振荡后在室温下以450 × g离心5分钟。
  10. 弃去上清液，将沉淀重悬于FACS BL中。每100 µL已染色样品使用300 µL FACS BL。
  11. 向每个样品中加入7-氨基放线菌素D（7-AAD）溶液。每300 µL第6.10步制备的样品加入5 µL 7-AAD。
  12. 将样品置于4 °C避光保存，直至进行流式细胞分析。样品制备后应在16小时内完成分析，以保证>60%的细胞活力。

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结果

我们比较了两种不同的匀浆方法（DH法与PD法）在小鼠脑和脊髓组织中的应用，以评估其获取适用于下游应用的不同活细胞类型的效率。为此，我们采用了一个9色流式细胞术检测 panel，旨在同一样本中对包括小胶质细胞、淋巴细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞在内的多种中枢神经系统细胞类型进行表征。

脑和脊髓组织取自不同的小鼠（n ≥ 6），沿纵轴方向将组织切成两半，称重后平行处理：一部分采用Dounce匀浆器进行机械破碎（DH法），另一部分则轻轻剪碎后使用基于木瓜蛋白酶的商用神经组织解离试剂盒（NTDK）进行酶消化处理（PD法）（图1A）。去除碎片后，将脑或脊髓来源的细胞分别用台盼蓝按1/10或1/2−1/5的比例稀释，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）测定细胞得率和活力（图1B,C）。总体而言，DH法从脑和脊髓中获得的细胞数量更高。然而，所获得的细胞中大部分已死亡，脑组织中仅有13....

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讨论

本文介绍一种从小鼠脑和脊髓中共同纯化并同时进行流式细胞术分析中枢神经系统（CNS）中若干最重要细胞类型的实验方案。传统上，组织学分析被用于描述纳米颗粒在中枢神经系统中的分布情况，或评估病毒载体在中枢神经系统中的转导效率5,13，也可用于揭示特定细胞类型在病理过程中或药物处理后发生的形态学和分子水平变化14。然而，组织学方法通量较低，且由于可同时检测的标记物数量有限，难以在同一组织样本中对多个特征进行全面分析。本方法可作为传统组织学分析的补充，并可与多种后续实验技术（如细胞分选、原代培养、生物化学分析或新一代测序分析）相结合，从而扩展从单个样本中获取的信息量。但需注意以下若干关键因素，因其可能显著影响本方法的实验成败：

  1. 起始组织量。我们已优化细胞分离流程，起始材料可少至半份脊髓或半份脑组织。根据我们的经验，采用PD法处理一只8周龄成年小鼠的半份脑或半份脊髓，在密度梯度分离步骤后，可获得1−6 × 106个脑来源的活细胞，以及约...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由波士顿儿童医院向 A.B. 提供的启动资金、美国肌萎缩侧索硬化协会（ALSA）授予 M.P. 的项目编号 17-IIP-343 的资助，以及美国国防健康事务助理部长办公室通过肌萎缩侧索硬化研究计划向 M.P. 提供的 W81XWH-17-1-0036 号奖项资助。我们感谢 DFCI 流式细胞术核心设施提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X HBSS（不含钙、氯化镁和硫酸镁）Gibco14185-052
70 mm 细胞筛Corning431751
ACSA/ACSA2 抗小鼠抗体Miltenyi Biotec130-117-535APC 标记
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9647-1KG
CD11b 大鼠抗小鼠抗体Invitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 标记
CD31 大鼠抗小鼠抗体BD Bioscience562939BV421 标记
CD45 大鼠抗小鼠抗体Biolegend1031138Brilliant Violet 510 标记
CD90.1/Thy1.1 大鼠抗小鼠抗体Biolegend202518PE/Cy7 标记
CD90.2/Thy1.2 大鼠抗小鼠抗体Biolegend1005325PE/Cy7 标记
锥形管（15 mL）CellTreat229411
锥形管（50 mL）CellTreat229422
Dounce 组织研磨器套装（包含研钵及 A、B 型研杵）Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc（CD16/CD32）阻断大鼠抗小鼠抗体BD Pharmingen553142
胎牛血清Benchmark100-106
神经组织解离试剂盒（P 型）Miltenyi Biotec130-092-628
O4 抗小鼠/大鼠/人抗体Miltenyi Biotec130-095-895生物素标记
PercollGE Healthcare10266569以非无菌试剂形式出售
PercollSigma65455529无菌试剂（用于需要无菌条件的应用）
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01内毒素含量极低的试剂
链霉亲和素InvitrogenS3258Alexa Fluor 680 标记

参考文献

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