通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

摘要

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。

摘要

病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操控中枢神经系统（CNS）开辟了新的前沿方法。然而，这些技术的进一步优化将受益于能够快速、高效地评估病毒载体或纳米颗粒在体内给药后对中枢神经系统及特定细胞靶向程度的方法。本文介绍了一种利用流式细胞术高通量和多重检测能力的实验方案，可对从小鼠脑或脊髓中分离出的不同细胞亚群（包括小胶质细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和内皮细胞）进行直接定量分析。我们应用该方法揭示了两种组织匀浆方法在细胞得率、活力和组成方面的关键差异，从而指导研究者根据所关注的细胞类型及具体应用选择最佳方法。该方法不适用于解剖分布的分析，因为组织需被匀浆以制备单细胞悬液。但该方法可获得活细胞，并可与细胞分选技术联用，为神经科学研究人员提供多种应用可能，例如从纯化的细胞群体建立原代培养，到在神经退行性疾病、药理学处理或基因治疗背景下，对明确定义的细胞亚群进行基因表达分析以及生化或功能检测。

引言

基因和药物递送技术（如病毒载体和纳米颗粒）已成为一种强大工具，可用于深入研究神经退行性疾病中发生改变的特定分子通路，并推动创新治疗策略的开发^1,2,3。这些工具的优化依赖于对以下两个方面的定量分析：（1）不同给药途径下进入中枢神经系统（CNS）的渗透程度；（2）对特定细胞群体的靶向能力。通常采用组织学分析方法，通过针对特定细胞标志物的免疫染色来识别不同CNS区域和不同细胞类型，从而可视化荧光报告基因或荧光标记的纳米颗粒^4,5。尽管该方法可提供有关所给予基因或药物递送工具生物分布的宝贵信息，但该技术通常耗时且劳动密集，因其需要完成以下步骤：（1）组织固定、冷冻保存或石蜡包埋及切片；（2）针对特定细胞标志物的染色，有时需进行抗原修复；（3）荧光显微镜成像，而该方法通常在同一实验中仅能分析有限数量的不同标志物；（4）图像处理，以实现对目标信号的准确定量。

流式细胞术已成为一种广泛应用的技术，该技术利用高度特异性的荧光标记物，不仅能够根据细胞表面或胞内抗原的表达情况，对细胞悬液中不同细胞表型进行快速定量分析，还可实现功能检测（例如细胞凋亡速率、增殖能力、细胞周期分析等）。通过荧光激活....

方案

本文所述所有方法均已获得丹娜—法伯癌症研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 16-024）。

1. 实验所需溶液的配制

1. 通过将10倍浓度的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）用无菌水稀释，制备1倍浓度的HBSS溶液。将溶液预先在冰上预冷。每个样品至少需要25 mL溶液。
2. 通过将10倍无菌HBSS以1:10比例与密度梯度介质（如Percoll）混合，制备等渗Percoll溶液（IPS）。在冰上预冷。
   注意：IPS可在4 °C下保存最多30天。
3. 制备流式细胞术（FACS）封闭（BL）溶液（含1%牛血清白蛋白[BSA]和5%胎牛血清[FBS]的磷酸盐缓冲液[PBS]）。在冰上预冷。

2. 通过心脏内灌注实施动物安乐死及组织解剖

注意：实验中使用8周龄的C57BL/6J小鼠，性别不限。在进行组织消化前，需用PBS溶液灌注以清除器官中的血液污染。

1. 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮90−200 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。将小鼠仰卧固定于支撑面上，并用胶带固定四肢。通过检测缩足反射确认麻醉深度是否充分。
2. 在胸廓入口水平沿中线做皮肤切口，暴露胸骨。用镊子夹住胸骨尖端，然后在肋骨两侧各做一个1 cm的切....

结果

我们比较了两种不同的匀浆方法（DH法与PD法）在小鼠脑和脊髓组织中的应用，以评估其获取适用于下游应用的不同活细胞类型的效率。为此，我们采用了一个9色流式细胞术检测 panel，旨在同一样本中对包括小胶质细胞、淋巴细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞在内的多种中枢神经系统细胞类型进行表征。

脑和脊髓组织取自不同的小鼠（n ≥ 6），沿纵轴方向将组织切成两半，称重后平行处理：一部分采用Dounce匀浆器进行机械破碎（DH法），另一部分则轻轻剪碎后使用基于木瓜蛋白酶的商用神经组织解离试剂盒（NTDK）进行酶消化处理（PD法）（图1A）。去除碎片后，将脑或脊髓来源的细胞分别用台盼蓝按1/10或1/2−1/5的比例稀释，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）测定细胞得率和活力（图1B,C）。总体而言，DH法从脑和脊髓中获得的细胞数量更高。然而，所获得的细胞中大部分已死亡，脑组织中仅有13........

讨论

本文介绍一种从小鼠脑和脊髓中共同纯化并同时进行流式细胞术分析中枢神经系统（CNS）中若干最重要细胞类型的实验方案。传统上，组织学分析被用于描述纳米颗粒在中枢神经系统中的分布情况，或评估病毒载体在中枢神经系统中的转导效率^5,13，也可用于揭示特定细胞类型在病理过程中或药物处理后发生的形态学和分子水平变化¹⁴。然而，组织学方法通量较低，且由于可同时检测的标记物数量有限，难以在同一组织样本中对多个特征进行全面分析。本方法可作为传统组织学分析的补充，并可与多种后续实验技术（如细胞分选、原代培养、生物化学分析或新一代测序分析）相结合，从而扩展从单个样本中获取的信息量。但需注意以下若干关键因素，因其可能显著影响本方法的实验成败：

1. 起始组织量。我们已优化细胞分离流程，起始材料可少至半份脊髓或半份脑组织。根据我们的经验，采用PD法处理一只8周龄成年小鼠的半份脑或半份脊髓，在密度梯度分离步骤后，可获得1−6 × 10⁶个脑来源的活细胞，以及约.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X HBSS（不含钙、氯化镁和硫酸镁）	Gibco	14185-052
70 mm 细胞筛	Corning	431751
ACSA/ACSA2 抗小鼠抗体	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC 标记
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b 大鼠抗小鼠抗体	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 标记
CD31 大鼠抗小鼠抗体	BD Bioscience	562939	BV421 标记
CD45 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	1031138	Brilliant Violet 510 标记
CD90.1/Thy1.1 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	202518	PE/Cy7 标记
CD90.2/Thy1.2 大鼠抗小鼠抗体	Biolegend	1005325	PE/Cy7 标记
锥形管（15 mL）	CellTreat	229411
锥形管（50 mL）	CellTreat	229422
Dounce 组织研磨器套装（包含研钵及 A、B 型研杵）	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc（CD16/CD32）阻断大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen	553142
胎牛血清	Benchmark	100-106
神经组织解离试剂盒（P 型）	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 抗小鼠/大鼠/人抗体	Miltenyi Biotec	130-095-895	生物素标记
Percoll	GE Healthcare	10266569	以非无菌试剂形式出售
Percoll	Sigma	65455529	无菌试剂（用于需要无菌条件的应用）
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	内毒素含量极低的试剂
链霉亲和素	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 标记