通过不同的均质化方法从小鼠大脑/脊髓中检索到的多种细胞类型的同步流细胞测量特征

开发选择性基因和药物输送工具来治疗神经退行性疾病，需要细胞靶向的定量和表征，在重新给药时，或病毒载体，或纳米粒子。它们具有流量细胞学的吞吐量和多路复用能力，能够从小鼠大脑和脊髓中直接同时识别多种细胞类型。展示这个程序的将是弗朗西斯科·哈维尔·莫利纳·埃斯特维兹，亚历山大实验室的博士后。

从一只八周大的C57 Black 6小鼠中采集大脑和脊髓后，将组织放入六孔板的单个孔中，每口冰井含有两毫升冰冷HPSS。将每个收获的组织分成两个相等的部分。用剪刀把每个组织样本的一半切碎成一到两毫米厚的碎片。

当所有组织都支离破碎时，在HPSS中预冲洗经过修改的1000微升移液器尖端，并使用移液器将每个组织悬浮液转移到单独的15毫升锥形管中。每口井再冲洗两毫升 HPSS。并在相应的15毫升锥形管中拉洗涤。

通过离心沉淀样品。从神经组织分离套件中混合 50 微升酶 P，每个样品的试剂盒中混合 1，900 微升缓冲 X。在37摄氏度下加热酶混合物至少10分钟。

并且从每个组织收集管中吸出上因。当酶混合物准备就绪时，在每个样品中加入1.95毫升溶液。轻轻的涡流重新悬浮颗粒。

接下来，在37摄氏度的车轮上孵育样品15分钟，将10微升酶 A 与每个样品20微升缓冲Y混合。在37摄氏度下预热第二个酶溶液，在摇动孵育结束时将溶液的30微升添加到每个组织溶液中。使用 1，000 微升移液器尖端，用 HPSS 预冲洗，轻轻混合每个样品。

在37摄氏度下将试样返回车轮15分钟。在孵育结束时，用10毫升的冰冷HPSS来阻止酶反应。通过离心沉淀样品。

离心结束时，将颗粒重新悬浮在每管 7 毫升冰冷的 HPSS 中。轻轻旋转每个样品，然后把管子放在冰上。为了组织均质化，在豆组织研磨机的预冷玻璃砂浆中加入三毫升预冷却HPSS，并将收获的大脑或脊髓组织样本的后半部分转移到砂浆中。

用 10 次佩斯特尔 A 轻轻搅拌组织，然后进行 10 次佩斯特尔 B，然后将均质化混合物转移到新的 15 毫升锥形管中。用预冷的 HPSS 将管子填充到 10 毫升的最终体积，用于离心。在将样品放在冰上之前，将颗粒重新悬浮在7毫升新鲜HPSS中，并带漩涡。

对于清除碎屑，在每个消化或均质样品中加入三毫升预冷却同位素珀科尔溶液。轻轻旋转样品，确保样品均匀混合。接下来，将样品离心，小心地清除漂浮在溶液表面的碎屑和梅林的白盘。

丢弃碎屑后，从每个管中收集上最后100微升的上一部分，而不会干扰颗粒。将每个颗粒重新悬浮在一毫升的 FACS BL 溶液中，将其转移到单独的 1.5 毫升微离心管中。与 Percoll 解决方案集成后，必须非常小心地清除碎屑盘和上经剂，而不会使细胞颗粒脱去，以避免样品损失。

离心后，小心地从每个管中吸出上经剂，并在每管350微升新鲜FACS BL中重新悬浮颗粒。对于分离细胞类型的流动细胞测量分析，每管每毫升FC块孵育5微克，在4摄氏度下孵育10分钟，然后根据表中概述的站立协议向每个管中加入适当的抗体。漩涡每个管五秒钟混合。

将样品放在4摄氏度，15分钟，防止光线。在孵育结束时，用每管一毫升 PBS 清洗样品，并离心机。每管中适当体积的链球素中重新悬浮颗粒。

在涡旋混合后，在4摄氏度下孵育样品10分钟，防止光线。并清洗细胞与一毫升PBS每管如证明。丢弃超钠后，每管将300微升新鲜FACS BL中的颗粒重新悬浮。

并给每个样品贴上5个7-AAD微升的标签。然后将样品储存在四摄氏度，防止光线，直到细胞氟测量分析。同质化方法从大脑和脊髓整体产生更高的细胞产量，但检索到的大多数细胞通常都已经死亡，结果只有大约14%的活细胞从大脑中愈合，大约10%的细胞从脊髓愈合。

相比之下，木瓜消化方法可整体上更好地保存细胞的生存能力。通过九色双流细胞学分析大脑和脊髓细胞悬浮液，可以发现CD45+CD11b+微胶质和巨噬细胞的存在。和CD45+CD11b淋巴细胞在两个组织。

然后，CD45细胞群群可以根据其对星细胞或寡头细胞标记或铁皮和内皮表面标记表达式的积极性进行区分。使用均质法，32%至38%的活细胞为造血源。虽然酶消化方法导致获得一个非常大的非造血CD45细胞的很大一部分。

值得注意的是，CD45+CD11b+微胶质和巨噬细胞代表了最丰富的可行细胞分数与均质化方法。然而，消化方法产生细胞类型的异构表示，包括星细胞、寡头细胞、内皮细胞和神经元。该协议用途广泛，可用于多种下游应用，如特定细胞亚细胞的定量或分离、原培养、生化或RNA测序分析。

我们实施了此协议，以评估不同CNS种群的基因表达和功能特征，或在小鼠模型内萎缩性侧索硬化治疗后。