通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

开发用于治疗神经退行性疾病的特异性基因和药物递送工具，需要对细胞靶向性进行定量和表征，特别是在重复给药、使用病毒载体或纳米颗粒的情况下。这些方法具备流式细胞术的高通量和多重检测能力，可直接且同时鉴定小鼠脑和脊髓中的多种细胞类型。本次实验操作将由来自 Alexander 实验室的博士后 Francisco Javier Molina Estevez 演示。

从一只八周龄的C57 Black 6小鼠中取出脑和脊髓后，将组织分别放入六孔板的各个孔中，每孔加入2毫升冰上预冷的HPSS，并置于冰上。将每份获取的组织分成大小相等的两部分，用剪刀将每份组织的一半剪切成1至2毫米厚的小块。

当所有组织均被充分破碎后，先用HPSS预润洗一个改良的1,000微升移液枪头，然后用该移液枪将每份组织悬液分别转移至各自的15毫升锥形管中。每孔再用额外的2毫升HPSS冲洗一次，并将冲洗液收集至相应的15毫升锥形管中。

通过离心沉淀样品。每个样品中加入50微升来自神经组织解离试剂盒的酶P和1,900微升试剂盒中的缓冲液X。将酶混合物在37摄氏度下预热至少10分钟。

然后从每个组织收集管中吸除上清液。当酶混合液准备好后，向每个样品中加入1.95毫升该溶液。轻轻涡旋振荡，以重新悬浮沉淀物。

接下来，将样品在37摄氏度下于摇床上孵育15分钟，并为每个样品混合10 µL酶A与20 µL缓冲液Y。在振荡孵育结束前，将第二种酶溶液预热至37摄氏度，然后向每份组织溶液中加入30 µL该溶液。使用经HPSS预冲洗的1,000 µL移液器吸头，轻轻混匀每个样品。

将样本放回转轮，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育结束后，加入 10 毫升冰冻的 HPSS 以终止酶促反应。通过离心沉淀样品。

离心结束后，每管中加入 7 毫升冰上预冷的 HPSS 重悬沉淀。轻轻涡旋混匀每个样品，然后将离心管置于冰上。进行组织匀浆时，向预冷的玻璃研钵（Dounce 组织研磨器）中加入 3 毫升预冷的 HPSS，并将一份收获的脑或脊髓组织样本的后半部分转移至研钵中。

用匀浆器A轻轻研磨组织10次，随后用匀浆器B研磨10次。将匀浆后的混合物转移至一个新的15毫升锥形管中。加入预冷的HPSS，定容至终体积10毫升，用于离心。然后在7毫升新鲜HPSS中通过涡旋重新悬浮沉淀，并将样品置于冰上保存。

为去除碎片，向每份消化或匀质化的样品中加入三毫升预冷的等渗 Percoll 溶液。轻轻涡旋混匀样品，确保其均匀混合。接着，离心样品，并小心移除漂浮在溶液表面的白色碎片和髓鞘层。

弃去碎片后，从每根离心管中收集上清液，仅留下最后100微升，注意不要扰动沉淀。将每份沉淀重悬于1毫升FACS BL溶液中，转移至各自的1.5毫升微量离心管中。与Percoll溶液混合后，必须小心去除碎片层和上清液，避免扰动细胞沉淀，以防样品损失。

离心后，小心吸去每管中的上清液，并将沉淀物重新悬浮于每管 350 微升的新鲜 FACS BL 中。对于分离细胞类型的流式细胞分析，在每管中加入每毫升 5 微克的 FC 封闭剂，于 4 摄氏度孵育 10 分钟，然后根据表格中所述的标准方案向每管加入相应的抗体。每管涡旋振荡 5 秒以混匀。

将样品置于 4°C 避光保存 15 分钟。孵育结束后，每管加入 1 毫升 PBS 洗涤样品，然后离心。每管中加入适量体积的链霉亲和素，重悬沉淀。

充分涡旋混匀后，将样品在4°C避光孵育10分钟。按所示方法，每管加入1毫升PBS洗涤细胞。弃去上清液后，每管用300 µL新鲜FACS BL重悬沉淀。

每份样本加入5 µL的7-AAD进行标记，然后将样本置于4°C避光保存，直至进行流式细胞分析。匀浆法总体上可从脑和脊髓中获得更高的细胞得率，但所获取的细胞大多数通常已死亡，导致脑组织中仅有约14%的活细胞，脊髓中约10%的活细胞。

相比之下，木瓜蛋白酶消化法在整体上能更好地保持细胞活力。采用九色双流式细胞术对脑和脊髓细胞悬液进行分析，结果显示两种组织中均存在 CD45+CD11b+ 小胶质细胞和巨噬细胞，以及 CD45+CD11b- 淋巴细胞。

随后可根据星形胶质细胞、少突胶质细胞标志物，或小胶质细胞和内皮细胞表面标志物的表达情况，区分CD45阴性细胞群体。采用匀浆法时，活细胞中约有32%至38%来源于造血细胞；而酶消化法则可获得极高比例的非造血来源CD45阴性细胞。

值得注意的是，采用匀浆法时，CD45+CD11b+的小胶质细胞和巨噬细胞是含量最丰富的活细胞组分。然而，消化法则能获得更为多样化的细胞类型，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞和神经元。本方案具有良好的通用性，可适用于多种下游应用，例如特定细胞亚群的定量或分离、原代培养，以及生化分析或RNA测序分析。

我们已实施该方案，以评估在内源性肌萎缩侧索硬化小鼠模型的疾病进展过程中或治疗后，不同中枢神经系统群体的基因表达和功能特征。