从人尿源性细胞直接重编程获得的肌管中的外显子跳跃

摘要

本文介绍了一种利用MYOD1转分化的尿液来源细胞高效构建杜氏肌营养不良症肌肉模型的详细方案，用于评估外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白mRNA和蛋白水平的恢复情况。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种进行性且致命的肌肉疾病，由 DMD 基因突变导致肌营养不良蛋白缺失而引起。迄今为止，我们在国立神经与精神卫生研究中心开展了一项研究者发起的全球首个人体研究，基于全身注射易于引发外显子53跳跃的吗啉寡核苷酸。为了实现对DMD的有效治疗，普遍认为在开展临床试验前，利用DMD患者来源的成肌细胞进行体外药物筛选和患者入组资格评估至关重要。最近，我们报道了一种新型的经 MYOD1 转分化并使用组蛋白甲基转移酶抑制剂（盐酸去氮埃普诺星A）处理的尿源性细胞（UDC），作为DMD的细胞模型。这种新型自体UDC可能模拟DMD特异性表型，从而推动精准医学在多种肌肉相关疾病中的应用。本文中，我们详细描述了一种利用 MYOD1 转分化的UDC高效构建DMD肌肉细胞模型的实验方案，并结合逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白质印迹（Western blotting）和免疫细胞化学方法，评估外显子跳跃后肌营养不良蛋白mRNA和蛋白水平的恢复情况。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种进行性、致命性的肌肉疾病，由DMD基因的移码突变引起，导致抗肌萎缩蛋白缺失¹。基于反义寡核苷酸的外显子跳跃疗法被认为在DMD治疗中具有广阔前景。该疗法通过改变前体mRNA的剪接方式，恢复DMD基因的阅读框，从而将严重的DMD表型转化为较温和的类似贝克型肌营养不良症的表型²。我们近期完成了一项首次人体研究，该研究基于重复静脉输注磷酸二酰胺吗啉代寡聚物（PMO）viltolarsen，该药物可诱导DMD患者发生53号外显子跳跃，研究结果表明其具有优异的安全性、良好的疗效以及可接受的药代动力学参数（注册号：UMIN: 000010964 和 ClinicalTrials.gov: NCT02081625）³。

然而，为了开发具有成本效益且高效的疾病治疗方法，在开展临床试验之前，使用来自杜氏肌营养不良症（DMD）患者原代肌肉细胞进行体外检测，对于药物筛选和患者入组资格验证至关重要；同时，在人体试验期间，也需要能够反映外显子跳跃疗法疗效的生物标志物⁴。最近，我们报道了一种新型技术，可将患者特异性的MYOD1转化尿源性细胞（UDCs）^5,6作为DMD的原代成肌细胞模型⁷。因此，仅需收集患者的尿液即可获得成肌细胞，无需侵入性操作。本文中，我们详细描述了一种利用经盐酸3-脱氮新普诺西林A处理的MYOD1转化UDCs高效构建DMD肌肉模型的实验方案，用于评估外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白mRNA和蛋白的恢复情况。

方案

国家神经病学与精神病学中心伦理委员会批准了本研究（批准号：A2017-018，A2018-029）。所有个体在提供尿液样本前均签署了知情同意书。所有实验均在相关指南和法规的指导下进行。

1. UDCs 的分离与原代培养

注意：UDC 的分离依据先前发表的方案^8,9,10，并进行了一些修改。

1. 在自发排尿期间，使用无菌塑料瓶收集尿液样本。
   注意：无需对外尿道口进行消毒。建议采集中段尿，以降低病毒污染的风险。如果在下次操作前的存放时间 >1 小时，应将尿液样本转移至 4 °C 以维持细胞活性。但应避免温度 <4 °C，因为可能出现不溶性沉淀。
2. 在室温下，将全部尿液样本以 400 × g 离心 10 分钟。
3. 吸除上清液，管中保留 1 mL。
4. 将沉淀物各自用剩余的 1 mL 尿液重悬，然后收集至一个 50 mL 离心管中。
5. 加入 10 mL 洗涤缓冲液（由不含钙和镁的 99 mL PBS、1% 青霉素/链霉素（P/S）、0.5 µg/mL 两性霉素 B 组成），在室温下以 200 × g 离心 10 分钟。
6. 吸除上清液，管中保留 0.2 mL。
7. 将细胞沉淀重悬于 4.5 mL 原代培养基中，该培养基由高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，不含丙酮酸钠）与 Ham's F-12 营养混合物（1:1 混合）组成，并添加重组人表皮生长因子（EGF）、胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、T3、转铁蛋白、10% 无四环素胎牛血清（FBS）、1% P/S 和 0.5 µg/mL 两性霉素 B。
8. 将细胞接种至三个明胶包被的六孔板孔中（每孔总体积为 1.5 mL）。在 37 °C、5% CO₂ 条件下湿化培养 24 小时。
9. 在接下来的 3 天内，每天添加 1.5 mL 原代培养基。
10. 第 4 天，更换为 1.5 mL 生长培养基，该培养基补充有重组人 EGF、胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、T3、转铁蛋白、15% 无四环素 FBS、0.5% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.5% 非必需氨基酸、2.5 ng/mL 成纤维细胞生长因子-碱性（bFGF）、重组人血小板源性生长因子（PDGF）、EGF 以及 1% P/S。
11. 每隔一天更换一次生长培养基。
    注意：尿源性细胞（UDC）克隆通常在一周内出现。
12. 当 UDC 培养物达到 80−90% 汇合度时，移除培养基，用 PBS 洗涤细胞，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化全部细胞，并以 3,000–5,000 个细胞/cm² 的密度接种至新的明胶包被的 60 mm 培养皿中（第 1 代）。
    注意：UDC 可在液氮中保存。通常在 60−70% 汇合度时，将 60 mm 培养皿中的 UDC 分为三份，储存于三个冻存管中。

2. 逆转录病毒载体构建

1. 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增 MYOD1（NM_002478.4）质粒的编码区。
   注意：MYOD1 扩增反应体系及热循环仪反应条件分别见表1和表2。
2. 取1 µL扩增后的PCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，检测到一条约1,000 bp大小的单一条带，以确认MYOD1序列已成功扩增。
3. 使用纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并用分光光度计测定其浓度。
4. 按照表3所示混合物在37 °C过夜孵育，以在多克隆位点的限制性酶切位点处，对带有Tet-on系统和嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒载体进行消化。
5. 取1 µL消化产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，检测单一条带，以确认逆转录病毒载体已成功消化。
6. 使用纯化试剂盒对消化产物进行纯化，并用分光光度计测定其浓度。
7. 为将扩增的MYOD1片段（由步骤2.1−2.3制备）克隆至消化后的逆转录病毒载体（由步骤2.4−2.6制备），进行In-Fusion克隆反应。按表4所示设置反应体系，在50 °C孵育15分钟，然后置于冰上。
8. 根据制造商说明书（材料表）使用大肠杆菌（E. coli）感受态细胞进行转化。
9. 将转化后的感受态细胞接种于LB培养板上进行筛选，LB培养板成分包括：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、15 g/L琼脂粉和50 mg/L氨苄青霉素。
10. 挑取筛选出的单克隆菌落，在不含琼脂粉的LB液体培养基中，于37 °C、200 rpm条件下过夜培养。
11. 使用质粒纯化试剂盒（材料表）纯化插入MYOD1的逆转录病毒载体，并用分光光度计进行定量。
12. 通过直接测序法确认MYOD1是否正确插入逆转录病毒载体，测序所用引物为分别靶向插入的MYOD1序列两侧的正向和反向引物扩增得到的PCR产物。
    注意：若In-Fusion克隆成功，测序结果中应可见MYOD1序列被夹在逆转录病毒载体序列之间。
13. 为生产逆转录病毒，将包装细胞以50,000 个细胞/cm²的密度接种于10 cm胶原蛋白包被的培养皿中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养24小时。
14. 当包装细胞增殖至80%融合度时，将30 µg插入MYOD1的逆转录病毒载体、30 µg包装载体以及含有穿膜肽的转染试剂（材料表）混合，涡旋混匀后孵育10分钟。
15. 将孵育后的混合物加入包装细胞培养基中，在37 °C、5% CO₂的湿润环境中继续培养。
    注意：必须进行胶原蛋白包被。接种后24小时或更长时间进行转染效果更佳，因为包装细胞容易从培养皿上脱落。
16. 4小时或过夜后，更换为新鲜的生长培养基。
17. 在共转染后24小时和48小时分别收集病毒上清液并更换新鲜培养基，将两次收集的上清液合并。
18. 为浓缩病毒上清液，将其与浓缩试剂混合后在37 °C过夜孵育，然后在4 °C以1,500 x g离心45分钟。
19. 使用孔径为0.45 µm的PVDF滤器过滤逆转录病毒上清液。
20. 根据制造商说明书，使用定量PCR试剂盒和热循环仪系统检测逆转录病毒载体的滴度。
21. 将病毒上清液分装成小份，于-80 °C保存。

3. 使用 MYOD1-逆转录病毒载体感染 UDCs

1. 将UDCs以3,000-5,000个细胞/cm²的密度接种于明胶包被的60 mm培养皿中。
2. 接种24 h后，加入已解冻的逆转录病毒（步骤2.21），同时添加终浓度为8 µg/mL的六亚甲基溴化物，感染复数为200。
3. 在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育24 h后，更换为含1 µg/mL嘌呤霉素的新鲜生长培养基，以筛选MYOD1转导的细胞。每隔一天更换一次培养基。
   注意：筛选MYOD1阳性细胞时，通常使用1 µg/mL嘌呤霉素进行筛选，但应确定最适浓度。可使用未转染的细胞进行剂量预实验，选择能在3−5天内完全杀死细胞的浓度。MYOD1阳性细胞的筛选应在添加嘌呤霉素后7−10天内完成。MYOD1转导的UDCs可储存于液氮中。

4. 经盐酸3-脱氮新普拉诺霉素A（DZNep）处理的MYOD1转导UDC细胞的成肌分化

注意：最近有报道称，组蛋白甲基转移酶抑制剂 DZNep 能显著促进晚期肌源性调节因子之一的 MYOGENIN 的表达，并诱导肌管分化⁷。

1. 将转导 MYOD1 的 UDC 以 3.5 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种于胶原蛋白包被的孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下进行湿润培养。
2. 24 小时后，将生长培养基更换为分化培养基，分化培养基由高糖 DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5% 马血清、ITS 补充剂、1 µg/mL 多西环素和 5 µM DZNep 组成。
   注意：10 mM DZNep 溶液可在 -80 °C 保存 3 个月。使用解冻冰箱，并避免反复冻融。由多西环素激活的 MYOD1 和 DZNep 均可抑制细胞增殖并促进 UDC 的成肌分化。因此，建议在诱导成肌分化后添加多西环素和 DZNep。DZNep 以剂量依赖性方式促进 MYOD1-UDC 的成肌分化，但在高浓度下具有细胞毒性。因此，应根据 DZNep 对成肌分化和细胞生物可及性的影响，确定其适宜浓度，范围为 1−10 µM。
3. 3 天后，将分化培养基更换为不含 DZNep 的新鲜分化培养基，之后每 3 天更换一次培养基。
   注意：UDC 在分化后 1−2 周内相互融合并形成肌管。

5. MYOD1 转化的 UDCs 中的外显子跳跃

注意：本文描述了三种用于评估患者来源细胞中外显子跳跃的实验方案：1）抗肌萎缩蛋白mRNA的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）；2）通过蛋白质印迹法对恢复的抗肌萎缩蛋白信号进行半定量分析；3）通过免疫细胞化学法对抗肌萎缩蛋白荧光信号的恢复进行半定量分析。所有这些方法均可以剂量依赖的方式检测外显子跳跃。

1. 通过RT-PCR评估外显子跳跃效率
   1. 在DMD患者来源的、经MYOD1转化并于分化第7天获得的UDC细胞中转染反义寡核苷酸（ASO）：将ASO、转染试剂（材料表）和分化培养基混合，使ASO终浓度为1−10 µM。于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养。
   2. 与ASO共孵育72小时后，更换为不含ASO的新鲜分化培养基。
   3. ASO转染后3−7天，弃去分化培养基，用PBS洗涤1次。加入细胞裂解液，裂解UDC细胞，并使用RNA提取试剂盒提取总RNA。
   4. 使用分光光度计测定RNA浓度。
   5. 根据表5，在PCR管中加入一步法RT-PCR反应所需的各种试剂。
   6. 将含有混合液的PCR管放入热循环仪中，按照表6设置程序运行。
   7. 进行微芯片电泳，并以下列摩尔浓度计算外显子跳跃效率：
      外显子跳跃效率（%）= 跳跃条带 /（跳跃条带 + 未跳跃条带）× 100
      注：PCR产物短期储存可置于4 °C冰箱，长期储存则置于-20 °C。
2. 通过Western blot检测外显子跳跃后的抗肌萎缩蛋白表达
   1. 按照步骤5.1.1和5.1.2对MYOD1-UDC细胞进行ASO转染并培养。
   2. 每3天更换一次培养基。
   3. 分化2周后，使用含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液提取培养细胞的总蛋白。
   4. 在冰上对裂解物进行超声处理，然后在4 °C下以14,000 × g离心15分钟。
   5. 收集上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
   6. 取15 µg总蛋白加入0.5 mL离心管中，用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液稀释至总体积10 µL。每泳道上样15 µg总蛋白。
   7. 按表7所示加入上样缓冲液、还原剂和去离子水。在70 °C下变性细胞裂解物10分钟。
   8. 配制含8.95 g/L三羟甲基氨基甲烷（tricine）、6.06 g/L Tris碱、1.0 g/L十二烷基硫酸钠（SDS）的Tris-乙酸电泳缓冲液。
   9. 将样品（20 µL）上样至Tris-乙酸3−8%凝胶，在150 V电压下电泳75分钟。
   10. 配制不含甲醇的转膜缓冲液。
   11. 将PVDF膜在甲醇中浸泡20秒，随后浸入转膜缓冲液中备用（至少10分钟）。使用小型凝胶时裁剪PVDF膜为6 × 8 cm，使用中型凝胶时裁剪为8 × 12 cm。
   12. 将转膜滤纸裁剪至与PVDF膜相同大小，并浸入转膜缓冲液中备用。
   13. 电泳结束后，将凝胶裁剪至与PVDF膜相同大小，并将其浸入蒸馏水中。
   14. 将转膜滤纸、PVDF膜和凝胶放置于半干转印装置中（图1），在4 mA/cm²条件下转印30分钟。
   15. 用蒸馏水冲洗膜2次。
   16. 配制抗抗肌萎缩蛋白抗体（1:500）和抗α-微管蛋白抗体（1:1,200）作为一抗。
   17. 配制HRP标记的抗小鼠二抗（1:100）作为二抗。
   18. 使用全自动Western处理设备（材料表），在室温下将膜与一抗孵育，洗膜后与二抗孵育。
       注：抗α-微管蛋白抗体通常用作上样对照。当同时进行抗体反应时，混合的一抗溶液（含1:500抗抗肌萎缩蛋白抗体和1:1,200抗α-微管蛋白抗体）效果良好。
   19. 用蒸馏水冲洗膜。
   20. 使用化学发光检测试剂和基于CCD相机的成像系统检测蛋白信号。
   21. 使用适当的软件分析数据。
3. 通过免疫细胞化学检测外显子跳跃后的抗肌萎缩蛋白表达
   1. 按照步骤4.1−4.3，在胶原包被的96孔板中将UDC细胞直接重编程为肌管细胞。
   2. 按照步骤5.1.2和5.1.3对ASO进行转染并培养MYOD1-UDC细胞。
   3. 分化2周后，用PBS洗涤细胞，并在4 °C下用4%多聚甲醛固定10分钟。
   4. 在室温下用0.1%非离子型去污剂对MYOD1-UDC细胞通透10分钟，随后在37 °C下用10%山羊血清封闭15分钟。
   5. 在4 °C下与一抗孵育过夜。
   6. 用PBS洗涤细胞，然后在室温下与二抗孵育30分钟。
      注：此处使用小鼠抗抗肌萎缩蛋白抗体（1:30）作为一抗，抗小鼠IgG作为二抗，Hoechst（1:10,000）用于细胞核染色。
   7. 使用荧光显微镜对96孔板成像，并在相同条件下使用分析软件自动对每个孔的荧光信号进行半定量分析。

结果

我们可以方便且无创地收集尿源性细胞（UDCs）。在开始原代细胞培养后的一周内，UDCs形成了集落，我们观察到其具有显著的增殖能力。UDCs的培养过程简单，在操作正确的情况下，细菌或真菌污染很少发生。

图2 显示了原代培养一周后UDC集落的代表性相差显微图像（图2A），以及分化一周后的MYOD1-UDC图像（图2B）。图3 显示了通过RT-PCR成功检测来自杜氏肌营养不良症（DMD）患者的UDC中发生的外显子跳跃现象。图3A 展示了对一名6岁男性DMD患者（其DMD基因存在第45-54号外显子缺失）来源的经DZNep处理的MYOD1-UDC，在使用反义寡核苷酸处理后进行的抗肌萎缩蛋白RT-PCR分析结果。通过跳过第44号外显子，开放阅读框得以恢复。在分化后的第14天，我们证实了外显子跳跃的诱导呈剂量依赖性（图3B）。上方条带代表天然产物，下方条带代表跳过第44号外显子后恢复开放阅读框的产物。

图4显示了通过蛋白质印迹法以剂量依赖性方式在杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的尿源性细胞（UDCs）中成功检测到外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达。我们还通过免疫细胞化学方法检测到抗肌萎缩蛋白表达的恢复（图5）。在96孔板中转染反义寡核苷酸（ASO）1周后，我们使用荧光显微镜测量了抗肌萎缩蛋白的荧光强度（图5A）。与对照ASO处理的MYOD1-UDCs相比，ASO处理的MYOD1-UDCs中观察到明显更强的荧光信号（图5B）。

这些结果表明，我们的新检测方法能够在 mRNA 和蛋白质水平上有效评估来自杜氏肌营养不良症（DMD）患者的 MYOD1-UDC 中的外显子跳跃情况。

图1：半干法Western印迹转膜装置的示意图。 在负极端放置两张浸透转膜缓冲液的滤纸，其上再叠放两张同样浸透缓冲液的滤纸。将已浸透缓冲液的凝胶轻柔地铺在PVDF膜上。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：UDCs的代表性图像。（A）原代培养一周后UDCs的相差图像。比例尺 = 200 µm。插图：白色矩形区域的放大图像。（B）分化一周后MYOD1-UDCs的相差图像。比例尺 = 50 µm。本图经Takizawa等⁷修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：通过 RT-PCR 成功评估杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的尿源性细胞（UDCs）中的外显子跳跃。（A）对来自外显子 45-54 缺失的杜氏肌营养不良症（DMD）患者的经 3-脱氮新波啉 A 盐酸盐（DZNep）处理的 MYOD1-UDCs，在反义寡核苷酸处理后进行的抗肌萎缩蛋白 RT-PCR 分析。DZNep 处理的 MYOD1-UDCs 同时以 1–10 µM 浓度的对照反义寡核苷酸处理作为对照。上方条带为未发生跳跃的产物（外显子 45-54 缺失），仍处于阅读框外；下方条带为外显子 44 跳跃后的产物（外显子 44-54 缺失且外显子 44 跳跃），可恢复开放阅读框。（B）使用微芯片电泳系统，以外显子 44 跳跃转录本摩尔浓度 /（天然转录本 + 外显子 44 跳跃转录本摩尔浓度［箭头所示］）× 100% 计算跳跃效率。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）后接 Bonferroni 事后检验比较各组跳跃效率（每组 n = 3，****P < 0.0001）。数据以均值 ± 标准误表示。本图经 Takizawa 等人⁷ 修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：通过 Western blot 成功评估杜氏肌营养不良症（DMD）患者尿源性细胞（UDCs）中的外显子跳跃。（A）对一名携带外显子 45-54 缺失的 DMD 患者来源的经 DZNep 处理的 MYOD1-UDCs，在发生外显子 44 跳跃后，使用抗dystrophin 抗体（靶向C末端）检测dystrophin的代表性Western blot结果。（B）通过单因素方差分析（one-way ANOVA）及随后的Bonferroni事后检验，比较经反义寡核苷酸治疗前后患者来源细胞中条带相对强度（以α-tubulin表达水平归一化）（每组n = 3，**P < 0.01，***P < 0.001，HI = 健康个体）。该图改编自 Takizawa 等人⁷。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：经反义寡核苷酸处理后，在DZNep处理的、来源于外显子45-54缺失的杜氏肌营养不良症（DMD）患者的MYOD1-UDC细胞中，肌营养不良蛋白免疫细胞化学的热图分析。（A）通过外显子44的跳跃，外显子45-54的缺失恢复了开放阅读框。（B）在96孔板上转染反义寡核苷酸1周后，使用荧光显微镜对信号强度进行定量。组间比较采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni事后检验（每组n = 3-4，****P < 0.0001）。该图改编自Takizawa等人的研究⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

试剂	体积	终浓度
2x PCR 预混液	12.5 μL	1x
正向引物	5 pmol	0.2 μM
反向引物	5 pmol	0.2 μM
模板	80 ng
灭菌蒸馏水	加至 25 μL
每反应总体积	25 μL

表1：通过RT-PCR扩增MYOD1的反应混合物组成。

98 °C	10 s
55 °C	10 s	} 35 个循环
72 °C	10 s

表2：MYOD1 扩增反应中热循环仪的反应条件。

试剂	体积
10x K 缓冲液	2 μL
逆转录病毒载体 (500 ng/μL)	2 μL
限制性内切酶 1 (2−15 U)	1 μL
限制性内切酶 2 (2−15 U)	1 μL
灭菌蒸馏水	14 μL
总体积	20 μL

表3：用于消化逆转录病毒载体的单管反应混合液。

试剂	体积
纯化的 MYOD1 片段	100 ng
消化后的逆转录病毒载体	100 ng
5x 酶预混液	4 μL
灭菌蒸馏水	加至 20 μL
总体积	20 μL

表4：用于In-Fusion克隆反应的混合物。

溶液	每反应体积 (μL)	终浓度
无RNase水	可变	-
一步法RT-PCR缓冲液	4	1x
dNTP混合液（含每种dNTP 10 mM）	0.8	每种dNTP 400 mM
上游引物（10 mM）	1.2	0.6 mM
下游引物（10 mM）	1.2	0.6 mM
一步法RT-PCR酶混合液	0.8	-
RNase抑制剂（可选）	可变	每反应5−10单位
模板RNA	50−400 ng
总体积	20

表5：一步法RT-PCR单次反应所需化合物。

1 个循环	反转录	30 分钟	50 °C
1 个循环	初始 PCR 激活步骤	15 分钟	95 °C
1 个循环	变性	1 分钟	94 °C
	退火	1 分钟	60 °C
	延伸	1 分钟	72 °C
1 个循环	最终延伸	7 分钟	72 °C
保持		∞	4 °C

表6：一步法RT-PCR的PCR仪热循环条件。

试剂	体积
蛋白 (15 μg)	10 μL
上样缓冲液 (4x)	5 μL
还原剂 (10x)	2 μL
去离子水	3 μL
总体积	20 μL

表7：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品的制备。

讨论

本文详细描述了利用杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的经 MYOD1 转化的尿源性细胞（UDCs）进行外显子跳跃的实验方案。通过该检测系统，我们高效地筛选出最优的反义序列。我们认为，经 MYOD1 转化的UDCs可用于研究该疾病的病理生理机制。

在mRNA水平上利用患者来源的细胞评估外显子跳跃，对于新药筛选以及在开展临床试验前评估患者入组资格至关重要。外显子跳跃效率的计算只能在mRNA水平上进行。

在蛋白水平上评估外显子跳跃也非常重要，因为抗肌萎缩蛋白的恢复可作为预测外显子跳跃治疗获益的替代生物标志物。迄今为止，反义寡核苷酸序列的筛选通常使用原代肌细胞系或永生化成肌细胞系（包括人横纹肌肉瘤（RD）细胞）进行，但由于这些肌细胞系或RD细胞系本身内源性表达该蛋白，因此无法用于检测抗肌萎缩蛋白水平的恢复情况。我们能够以剂量依赖的方式，在杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的MYOD1-UDC细胞中清晰检测到抗肌萎缩蛋白的恢复。在我们的新检测方法中，我们认为通过Western blotting评估恢复的蛋白在定量能力方面更具优势。另一方面，使用96孔板进行免疫细胞化学分析则非常适合同时筛选大量候选化合物。

本文介绍了一种利用MYOD1转分化的尿源性细胞（UDCs）高效构建杜氏肌营养不良症（DMD）肌肉模型的详细实验方案，并结合RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学方法，在mRNA和蛋白质水平上评估外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白的恢复情况。尿源性细胞可无创且便捷地获取。因此，我们推测这一全新的体外检测方法可广泛应用于各类肌肉系统疾病的基礎研究与转化医学研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% P/S 溶液（稳定型）	Thermo Fisher	15070-063	细胞培养
两性霉素B	Sigma Aldrich	A2942
抗肌营养不良蛋白抗体	Abcam	ab15277	蛋白质印迹（WB）
抗肌营养不良蛋白抗体	Leica	NCL-DYS1	免疫细胞化学（ICC）
抗小鼠IgG，Dylight 488标记	Vector Laboratories	DK-2488	ICC
抗-α-微管蛋白抗体	Sigma	T6199	蛋白质印迹和免疫细胞化学
BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	荧光显微镜
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	液氮中细胞保存
ChemiDoc MP 成像系统	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR 预混液	Clontech	639298	逆转录病毒制备
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693116001	WB蛋白提取
E.coli DH5 α 感受态细胞	TAKARA	9057
ECL Prime 蛋白质印迹检测试剂	GE healthcare	RPN2232	WB
EGF	Peprotech	AF-100-15	细胞培养
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	ASO转染
加厚型印迹滤纸	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Atto	AE-1460	WB
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma-Aldrich	F0291	细胞培养
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	细胞培养
GP2-293 包装细胞	Clontech	631458	逆转录病毒制备
Ham's F-12 营养混合液	Thermo Fisher Scientific	11765-054	细胞培养
高糖DMEM含GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	细胞培养
不含丙酮酸钠的高糖DMEM	GE Healthcare	SH30022.01	细胞培养
HiSpeed 质粒纯化试剂盒	QIAGEN	12643	逆转录病毒制备
Histofine Simple Stain MAX PO	NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
人PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	细胞培养
iBind Flex 溶液	Thermo Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex 蛋白质印迹设备	Thermo Fisher Scientific	SLF2000	WB（自动化印迹处理设备）
Immobilon-P 转印膜（PVDF）	MERCK	IPVH304F0	WB
In-Fusion HD 克隆试剂盒	Clontech	639648	逆转录病毒制备
ITS 液体培养基添加剂	Sigma-Aldrich	I3146	细胞培养
MILTEX HV 0.45 μm 滤膜	MERCK	SLHV033RS	逆转录病毒制备
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	微芯片电泳
MYOD1（GFP标记）	ORIGENE	RG209108	逆转录病毒制备
NanoDrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W	分光光度计
非必需氨基酸	Thermo Fisher	11140-050	细胞培养
NucleoSpin 凝胶与PCR纯化试剂盒	Clontech	740986.20	PCR纯化
NuPAGE 3-8% Tris-乙酸蛋白凝胶	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE 抗氧化剂	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS 上样缓冲液	Invitrogen	NP0007	WB
NuPAGE 样品还原剂	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-乙酸SDS电泳缓冲液	Invitrogen	LA0041	WB
一步法TB Green PrimeScript RT-PCR 试剂盒	TAKARA	RR066A	逆转录病毒载体滴度检测
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250	细胞培养
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23227	WB
Polybrene 感染/转染试剂	Sigma-Aldrich	TR-1003	逆转录病毒感染
pRetroX-TetOne-Puro 载体	Clontech	634307	逆转录病毒载体
嘌呤霉素	Clontech	631305	细胞培养
QIAGEN OneStep RT-PCR 试剂盒	Qiagen	210212	PCR
REGM Bullet 试剂盒	Lonza	CC-3190	UDC生长培养基材料
REGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	UDC基础培养基材料
逆转录病毒滴度检测试剂盒	TAKARA	6166	逆转录病毒载体滴度检测
Retro-X 浓缩试剂	Clontech	631455	逆转录病毒制备
RIPA 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	89901	WB
RNeasy 试剂盒	Qiagen	74104	PCR用RNA提取
无四环素胎牛血清	Clontech	631106	细胞培养
Triton-X	MP Biomedicals	9002-93-1	ICC
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	Gibco	25300054	细胞培养
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	WB
Xfect 转染试剂	Clontech	631317	质粒转染至包装细胞