在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

蛋白质足迹与质谱（MS）结合近年来被用于研究蛋白质相互作用和构象变化。羟基基蛋白足迹（HRPF）方法通过修改蛋白质氨基酸侧链来探索蛋白质溶剂的可访问性。HRPF方法，蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）1，¹已用于探索体外^{蛋白结构2，}细胞内（IC-FPOP）3，最近体内³（IV-FPOP）4。⁴FPOP利用248nm波长的兴奋激光，通过过氧化氢的光解来快速产生羟基基，形成羟基^1。反过来，这些基基可以在一微秒的时间尺度上标记20个氨基酸中的19个，比蛋白质可以展开的速度要快。虽然，每个氨基酸与羟基基的活性延伸1000倍，可以通过计算保护因子^（PF）5来使侧链氧化正常化。

由于FPOP可以氧化地修饰蛋白质，无论其大小或原序如何，它证明有利于细胞内和体内蛋白质研究。IV-FPOP探测C.elegans中的蛋白质结构，类似于体外和细胞内研究^4。Elegan是线虫家族的一部分，被广泛用作研究人类疾病的模型。蠕虫通过被动扩散和主动扩散来获取过氧化氢的能力，可以研究不同身体系统中的蛋白质结构。此外，C. elegans适合 IV-FPOP，因为它们在 FPOP⁶所需的 248 nm 激光波长时具有透明度。该方法与质谱相结合，允许使用传统的自下而上蛋白质组学方法识别多种修饰的蛋白质。

在此协议中，我们描述了如何执行IV-FPOP来分析C.elegans中的蛋白质结构。实验协议要求为从科纳曼等⁷号系统改编的IV-FPOP的微流体流系统的组装和设置。IV-FPOP后，样品均质化为蛋白质提取。蛋白质样品是蛋白酶解的，肽通过液体色谱（LC）串联MS进行分析，然后进行定量分析。

1. C. elegans维护和文化

1. 按照标准实验室程序^8，将蠕虫菌群生长并同步到其第四个幼虫（L4）阶段。
2. IV-FPOP实验当天，用M9缓冲液（0.02 M KH₂PO 4、0.08 M Na₂HPO_4、0.08M NaCl、1 mM MgSO 4）从细菌草坪（OP50大肠杆菌）清洗_L4蠕虫。₄
3. 每个 IV-FPOP 样本获取 ±10，000 蠕虫的 500 μL 等位。

2. 微流体流系统组件

1. 切割一块 2 厘米的氟乙烯丙烯 （FEP） 管（1/16 英寸外径 （o.d.） x 0.020 英寸内径 （i.d.））启动流系统组件。
2. 使用干净的解剖针，扩大FEP管的i.d.，以便一端只形成一个小陨石坑，长度为±50毫米。陨石坑应该足够大，可以容纳两块360μmo.d.的熔融石英。
   注:不要加宽相反的一端，因为此端将仅用于安装出口毛细管。
3. 使用陶瓷切割机，切割两块 15 厘米的 250 μm i.d. 熔融石英。这两块将成为流系统的注入线。
4. 使用自粘胶带，将两个 250 μm i.d. 毛细血管粘在一起，确保它们彼此平行，其末端 100% 冲洗。
   注:为确保熔融的二氧化硅端在切割后不会粉碎，并且彼此直和 100% 冲洗，建议使用放大镜或立体显微镜检查它们。
5. 将两个带胶带的毛细血管插入 FEP 管的手工坑中。将毛细血管推到手工陨石坑的边缘。
   注意:为了保持流系统的功效，不要推过手工制作的陨石坑（图1a）。
6. 将一小块环氧树脂放在干净的表面上，并与解剖针混合。
7. 快速，使用相同的针头，在注入毛细血管的末端放置一小滴树脂，与 FEP 管连接，让树脂干燥，将出口侧向上悬挂几分钟（图 1a）。
8. 当树脂干燥时，将 FEP 管和两个毛细管结合在一起，切出新的 250 μm i.d. 毛细管。新的毛细管将成为流动系统的出水毛细管。可以使用以下方程计算所需的毛细管长度:
   
   如果 l 的长度以厘米为单位，t是所需的反应时间（以分钟为单位），f以 mL/min 为单位的流速，并且 i.d. 毛细管的内径（以厘米为单位）。
   注:切割出出口毛细管后，检查末端，确保它们是直的，而不是粉碎的。
9. 树脂干燥后，通过 FEP 管出口端插入新的毛细管。出口毛细管的内端和两个注入毛细血管应在 FEP 管内相互冲洗，这会产生混合-T（图 1b）。
10. 按照步骤 2.6 和 2.7 中所述，将出口毛细管和 FEP 管与新鲜的环氧树脂结合。
11. 让树脂在一夜之间干燥，将流系统结合在一起。第二天设置微流体流系统（图1c）。

3. 用于体内FPOP的微流体流系统

1. 在一个 5 mL 注射器内插入四个磁性搅拌器。此注射器成为注射器样本。磁性搅拌器可防止蠕虫在IV-FPOP期间在注射器内沉降（图2A）。
2. 用 M9 填充两个 5 mL 注射器。确保每个注射器内没有气泡，因为它们会影响流速和混合效率。
3. 将 Luer 适配器连接到每个 5 mL 注射器，确保它们手指紧，并固定到位。
4. 将每个注射器连接到一个 3-2 阀。注射器应连接到阀门的中间端口（图2B）。
5. 将每个 5 mL 注射器固定到双注射器泵，并调整机械止动圈，以防止从推杆块向注射器施加过压。在设置止动环时，请记住添加磁性搅拌器。
6. 使用超级球形螺母、FEP 套筒和超级球杆套管将自制微流体流系统的每个注入毛细管端连接到每个 3-2 阀的顶部端口（图 2B）。
7. 到3-2阀（底部端口）的剩余打开端口，使用超级瓶螺母、FEP套筒和超级跳蚤套（图2B）连接10厘米450μm的毛细管。这些毛细血管成为提取的样品毛细血管。
8. 启动泵流量并检查微流体流系统的所有连接，有无目视泄漏。使用实验流速至少流动三个注射器体积。最终流速取决于激光照射窗口、激光频率和零排位分数体积。
   注:对于此协议，从激光照射窗口 2.55 mm、250 μm i.d.熔融石英、零排除分数和 50 Hz 频率计算了最终流速 375.52 μL/min。
   1. 流道由 3-2 阀手柄上的箭头标记。通过将阀手柄从排出位置移到回退位置，可以手动重新填充每个注射器。
      注:3-2 阀处的泄漏可以通过重新拧入超级阀螺母或更换任何阀连接（超级跳蚤螺母、FEP 套筒或超级滚圈套）来修复。混合-T 处的泄漏需要重新组装微流体流系统（步骤 2.1 到 2.11）。
9. 将微流体流系统移到实验台，并使用 360 μm o.d. 不锈钢联合将出口毛细管固定到辐射阶段（图 2Figure 2C，D）。
10. 使用长距离打火机，在激光照射窗口燃烧熔融石英的涂层。使用无绒组织和甲醇清洁燃烧的涂层。
    注:在燃烧周期和甲醇清洗周期之间交替，以避免毛细管过热，因为多余的热量会融化和/或打破毛细管。
11. 将磁性搅拌器块置于包含磁性搅拌器的 5 mL 注射器上方。调整磁搅拌器块的速度和位置，使 5 mL 注射器内的磁性搅拌器缓慢而持续地旋转。

4. 体内 FPOP

1. 打开 KrF 兴奋激光器，让胸腺预热。
   注意:激光以248nm波长发出可见和不可见的辐射，可能损害眼睛。在打开激光并打开光束出口窗口之前，应佩戴适当的护眼。
2. 通过将光学传感器放在光束出口窗口，测量至少 100 个脉冲的频率为 50 Hz 的激光能量。
   注:对于此协议，使用激光能量为 150 ± 2.32 mJ 的 2.55 mm 辐照窗口。
3. 获取大约 10，000 个蠕虫（500 μL），然后手动将样品提取到样品注射器中。
4. 将样品注射器填充 2.5 mL M9 缓冲液，最终采样体积为 3 mL。确保样品注射器中未引入气泡。
5. 将第二个注射器填充 3 mL 的 200 mM H₂O_2，再次确保注射器中未引入气泡。
6. 在出口毛细管的末端， 放置一个15 mL锥形管包裹在铝箔中，含有6 mL的40 mM N'-二甲基硫柳体（DMTU），40 mM N-tert-丁基-β-苯基硝基（PBN），和1%二甲基硫氧化物，分别淬火过量的H₂O_2，羟基，并抑制二氧化二氧化碳还原酶活性。
7. 从软件窗口启动兴奋激光器，等待第一个脉冲，然后从双注射器启动样品流。
   注:样品应在3种样品条件下以生物复制品进行技术三联:H₂O_2（样品）激光照射，无_H2O₂激光照射，无_H2O_2（控制）激光照射，每组生物组共9个样品。
8. 在 15 mL 管中收集整个样品，同时主动监控样品流量，防止任何视觉泄漏，因为样品注射器的一些背压有时会积聚。
9. IV-FPOP 后，颗粒蠕虫在 805 x g上离心 2 分钟。去除淬火溶液，加入 250 μL 裂解缓冲液（8 M 尿素，0.5% SDS，50 mM HEPES，50 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM 苯甲二硫化氟化物 [PMSF]）。将样品转移到干净的微离心管中，闪速冻结，并储存在-80°C，直到样品消化。

5. 蛋白质提取、纯化和蛋白质解

1. 解冻冰冻样品在冰上，通过声波均匀10s，然后60s冰孵育。可能需要多轮声波，通过在显微镜幻灯片上放置 2 μL 样品等值，可以在立体显微镜下观察到均质。当看到小到没有蠕虫时，样品均质化是完整的。
2. 在 4°C 下以 400 x g的离心化蠕虫 5 分钟，并将上清液收集到干净的微离心管中。
3. 使用双仁蛋白酸测定（BCA测定）使用制造商的说明确定样品蛋白浓度。
   注:样品浓度可以使用任何生化蛋白浓度测定选择来确定。请记住试剂与裂化缓冲液的兼容性（8 M 尿素、0.5% SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF）。此外，可能需要稀释缓冲液。
4. 从每个样品中获取100微克蛋白质，并放置在干净的微离心管中。
5. 将二硫硫醇 （DTT） 添加到 10 mM 的最终浓度中，以减少所有样品中的二硫化物键。涡旋，向下旋转，在50°C下孵化样品45分钟。
6. 将样品冷却至室温 10 分钟。
7. 将碘酰胺 （IAA） 添加到 50 mM 的最终浓度中，以降低残留物的酸化。在室温下，在室温下，涡旋、减速和孵育样品20分钟，防止光线照射。
8. 在烷基化后，立即加入4卷100%预冷却丙酮，并在-20°C孵育过夜，从而沉淀蛋白质样品。
9. 第二天，颗粒蛋白在16，000 x g的离心沉淀下沉淀10分钟。 用90%丙酮清洗样品颗粒，去除上清液，让颗粒干燥2~3分钟。
10. 在 25 mM Tris-HCl （1 μg/μL） 中重新悬浮蛋白质颗粒。在最终蛋白酶与蛋白质比为1:50（w/w）时加入胰蛋白酶，并在37°C下消化样品过夜。
11. 第二天，通过加入5%的酸，来抑制胰蛋白酶消化反应。
    注:LC-MS/MS 分析（步骤 6.1-6.5）每个样品至少需要 0.5 μg 的肽。使用定量色度肽测定（参见材料表）确定样品肽浓度，如制造商的协议所述。

6. 高性能液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）

1. 使用以下 LC 移动相:0.1% FA （A） 中的水，0.1% FA （B） 中的 ACN 中的水。
2. 将0.5 μg肽加载到含有C18（5 μm，100°）的陷阱柱上，用99%溶剂A和1%B清洗样品15分钟，15 μL/min流速。
3. 使用内部包装柱（0.075 毫米 i.d. = 20 mm）与 C18 反向相材料（5 μm，125°）分离肽。
4. 使用以下分析分离方法:梯度以 300 nL/min 泵送 120 分钟:0~1 分钟，3% B;2~90分钟，10~45%B;100~105分钟，100%B;106~120 分钟，3% B.
5. 使用高分辨率质谱仪在正电拉模式下对肽进行数据采集， 纳米电喷雾电电化 （nESI）。
   注:对于此协议，使用了超高性能 LC （UPLC） 仪器耦合到高分辨率质谱仪。利用数据依赖获取。MS1 的 m/z 扫描范围为 3750~1500，分辨率为 60，000，动态排除为 60。不包括电荷状态为 +1 和 >6 的离子。使用 5.5e5 的自动增益控制 （AGC） 目标，最大喷射时间为 50 ms，强度阈值为 5.5e4。为 MS2 选择的离子使用 32% 的规范化碰撞能量受到高能碰撞分离 （HCD） 碎片。在光谱仪中检测到具有 15，000 分辨率和 5.0e4 AGC 目标的片段离子。

7. 数据分析

1. 使用自下而上的蛋白质组学分析软件搜索针对C. elegans数据库的串联 MS 文件。
2. 将蛋白质分析搜索参数设置为如下:一个胰蛋白酶缺失裂解，375~1500 m/z肽质量范围，片段质量公差0.02，前体质量公差为10 ppm。卡酰胺甲基化被设置为静态修饰，众所周知羟基基侧链修饰^99，1010为动态。肽识别在 95% 置信度（中等）和残留 99% 置信度（高）处确定。错误发现率 （FDR） 设置为 1%。
3. 将数据导出到电子数据库，并使用以下¹¹的方程汇总每个肽或残留物的氧化程度:
   
   注:其中EIC区域修改是肽或具有氧化改性残留物的提取的电子色谱面积（EIC），而EIC区域是同一肽或残留物的总面积，有无氧化修饰。

在用于IV-FPOP的微流体流系统中，H2O2和蠕虫被分离，直到激光照射之前。这种分离消除了H2O2由内2源催化酶和其他细胞机制12的分解。使用 250 μm i.d. 毛细血管显示两个生物复制的总样品回收率在 63-89% 之间，而 150 μm i.d. 毛细血管仅显示 21-31% 的回收率（图 3A）。与较小的毛细管（150 μm）相比，使用较大的毛细管（250 μm）可改善IV-FPOP和单蠕虫流动（图3B）期间的蠕虫流动（图3B）。150 μm i.d. 毛细管不允许单蠕虫流动（图3C），在激光辐照窗口看到多个蠕虫一起流动，从而减少了每个蠕虫的激光暴露量。

IV-FPOP是一种共价标签技术，用于探测C.elegans中的溶剂可访问性。图 4A显示了 FPOP 改性和非改性肽的代表性提取的ion色谱图 （EIC）。羟基基标签改变了氧化改性肽的化学成分，从而使FPOP改性肽更加极性。在反向相色谱中，IV-FPOP改性肽的保留时间比未修饰的肽早。分离肽的MS/MS碎片允许识别氧化改性残留物（图4B）。

IV-FPOP已被证明在C.elegans内的两个生物复制体上，在氧化性上共修改了545种蛋白质（图5A，B）。IV-FPOP作为蛋白质足迹方法的优点依赖于该技术在蠕虫体内各种身体系统中修改蛋白质的能力（图5C）。这种方法将允许探索蛋白质结构和蛋白质相互作用，而不管蠕虫体内的身体组织或器官如何。此外，串联 MS 分析确认 IV-FPOP 探头在体内可访问溶剂。分析了热休克蛋白90（Hsp90）与肌苷护身蛋白UNC-45复合的氧化模式（图6）。Hsp90的MS/MS分析表明四种氧化改性残留物（图6C，D），FPOP改性（ln（PF））5的标准化范围表明Hsp90的残留物M698在与UNC-45结合时，其溶剂可利用量低于残留物R697、E699和E700（图6C）。5这些氧化差异通过文献溶剂可访问表面积（SASA）计算（PDB 4I2Z13）进行验证。残留物 M698 的 SASA 值为 0.03，与 SASA 值较高的残留物 R697、E699 和 E700 相比，该值被视为埋藏残留物（图 6C）。14

图 1.体内FPOP微流体流系统原理图。（A） IV-FPOP 流系统的两条注入线（橙色）显示在 FEP 管（黄色）内，环氧树脂的正确结合位置由浅蓝色圆圈表示。（B） 由三个 250 μm i.d. 毛细血管形成的完全组装混合-T。出口毛细管与 FEP 管的正确树脂结合位置由浅蓝色圆圈表示。（C） 完整的组装流系统，用于C. elegans的体内共价标记。在 FPOP 之前，蠕虫与 H2O2分离，直到标记之前;激光照射窗口以浅蓝色显示，激光束由紫色闪电表示。数字不能缩放。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2.IV-FPOP 期间的微流体系统。（A） 5 mL注射器内C. elegans的代表图片。不搅拌，蠕虫会沉淀在注射器的底部（左图）。在 IV-FPOP 实验期间，磁性搅拌器和搅拌器块使蠕虫保持悬架（右）。（B） 代表图片的5 mL注射器，注入毛细管，并撤回与3-2阀相连的毛细管。3-2 阀手柄显示在退出位置。（C） IV-FPOP 期间的微流体流系统，磁搅拌块位于蠕虫的 5 mL 注射器上方。（D） 出口毛细管固定在辐射阶段。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 3.使用两个 i.d. 毛细血管比较C. elegans流动和恢复。（A） 在 IV-FPOP 后，两种生物复制剂 （BR） 的蠕虫恢复百分比为 250 （灰色） 和 150 （黑色） μm i.d. 毛细血管。误差条根据技术三脚架的标准差计算。C. 通过激光辐照窗口通过250 μm （B） 和 150 μm （C） （ d. 毛细血管） 流动的elgan. 蠕虫在较小的毛细管中更紧密地压缩。毛细管的150μm表示蠕虫结块。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4.IV-FPOP 之后具有代表性的 LC-MS/MS 结果。（A） FPOP改性肽（红色）和未修饰（蓝色）的 EIC。选定的肽属于actin-1蛋白。（B） MS/MS 光谱的双电荷未改性作用-1肽 317-327。（C） MS/MS 光谱的双倍电荷 FPOP 改性作用素 -1 肽 317-327， 在此示例中 P323 被氧化改性修改 （y5+电子， 红色）.请点击此处查看此图形的较大版本。

图 5.IV-FPOP氧化修饰C.elegan人体内的蛋白质。（A） 在两个生物复制体 （BR） 存在 200 mM 过氧化氢 （BR） 时，氧化改性蛋白质的 Venn 图为蓝色，BR2 为黄色。（B） 在辐照样品中识别的氧化改性蛋白质的 Venn 图、过氧化氢控制和仅在 BR2 中的蠕虫控制，跨越技术三联。（C） 不同C. elegans身体系统中氧化改性蛋白质的饼图。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 6.将 IV-FPOP 修改与溶剂可访问性联系起来。（A） 肌辛护行蛋白 UNC-45 （灰色） （PDB ID 4I2Z13） 突出显示 LC/MS/MS 分析识别的两种改性肽， 669_680 和 698_706 （绿色， 左内位）。UNC-45 与 Hsp90 肽片段（蓝色）绑定。此片段中的氧化修饰残留物以棒（红色）显示，UNC-45 呈现为表面（右插页）。（B） UNC-45 肽 669×680（顶部）和 698×706（底部）的串联 MS 光谱显示 B 离子和 y 离子的 CO2损失，FPOP 修改。（C） Hsp90氧化改性残留物、R697、M698、E699 和 E700 的计算 ln（PF）。Hsp90 的计算 SASA 值表示在每个残渣上方。（D） R697、M698、E699 和 E700 的串联 MS 光谱显示 +16 FPOP 修改。这个数字是从埃斯皮诺等人4中修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

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