本文展示了一种用于活体小鼠眼表成像的多光子显微成像平台。利用荧光转基因小鼠，可实现对眼表内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。来源于胶原结构的非线性二次谐波生成信号，可实现对基质结构的无标记成像。
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方法文章
一种用于小鼠角膜和结膜活体成像的定制多光子显微镜平台
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
传统的组织学分析和细胞培养系统无法完全模拟体内生理和病理动态。多光子显微成像技术（MPM）已成为活体细胞水平生物医学研究中最常用的成像方式之一，其优势包括高分辨率、深层组织穿透能力以及极低的光毒性。我们设计了一套配备定制小鼠眼夹具和立体定位平台的多光子显微成像系统，用于活体眼表成像。利用双荧光蛋白报告小鼠，可实现对眼表区域内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。除多光子荧光信号外，同步采集二次谐波生成（SHG）信号还可用于表征胶原性基质结构。该平台可用于在整个眼表（包括角膜和结膜）进行精确定位的活体成像。
引言
角膜和结膜等眼表结构可保护其他更深层的眼部组织免受外界干扰。角膜是眼睛透明的前部结构，既具有将光线导入眼内的屈光透镜功能，又起到保护屏障的作用。角膜上皮是角膜的最外层，由表层细胞、翼状细胞和基底细胞等不同层次构成。角膜基质由高度有序排列的胶原板层组成，其中嵌有角膜细胞。角膜内皮是一层单层扁平六边形细胞，通过其泵功能维持角膜基质相对脱水的状态，从而对保持角膜透明性具有重要作用1。角膜缘构成角膜与结膜之间的边界，也是角膜上皮干细胞的储存库2。高度血管化的结膜通过分泌黏液和泪液，有助于润滑眼球3。
角膜表面结构的细胞动态通常通过组织学分析或体外细胞培养来研究，但这些方法可能无法充分模拟体内细胞动态。因此，一种非侵入性的活体成像方法可以弥补这一不足。由于具备高分辨率、光损伤小以及成像深度较深等优势，多光子显微成像技术（MPM）已成为生物研究多个领域的强大工具4,5,6,7,8。在角膜成像中，MPM可通过细胞内NAD(P)....
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方案
所有动物实验均按照中国台湾大学和长庚纪念医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的程序进行。
1. 多光子显微镜设置
- 构建基于直立显微镜并配备水浸物镜（20倍，数值孔径1.00）的成像系统（图1A）。
- 采用钛宝石激光器（波长可调）作为激发光源。EGFP的激光输出波长设为880 nm，tdTomato的激光输出波长设为940 nm（图1A）。
- 使用两个二向色镜（495 nm 和 580 nm）分别用于分离SHG/EGFP信号以及EGFP/tdTomato信号（图1A）。通过带通滤光片434/17 nm、510/84 nm和585/40 nm对SHG信号、EGFP和tdTomato进行光谱分离（图1A）。
- 为优化图像质量并避免光漂白和组织损伤，成像角膜时激光功率设为约35 mW，成像角膜缘时设为50 mW。激光功率应在进入光学系统前进行测量，样品处的实际激光功率约为8–9 mW。完整的显微系统设计如图1A所示。
注意：激光功率上限设定为70 mW，以避免光漂白和组织损伤。
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结果
利用该活体成像平台，可在细胞水平上观察小鼠的眼表结构。为了清晰显示眼表的单个细胞，我们采用了双荧光转基因小鼠模型，其细胞核表达EGFP，细胞膜表达tdTomato。富含胶原蛋白的角膜基质则通过二次谐波（SHG）信号进行高亮显示。
在角膜上皮中，可见表层细胞、翼状细胞和基底层细胞（图2）。在双荧光转基因小鼠中，我们能够对角膜和角膜缘上皮中从基底层到表层的单个细胞进行定位映射（图2）。观察到呈六边形的表层细胞（图2中白色箭头所示）。在角膜上皮中，从基底层向外侧各层，细胞核大小和核间距均逐渐增大（图2）。tdTomato荧光的胞质信号显示，在翼状细胞中，富含膜蛋白的细胞内囊泡系统（包括高尔基体和内质网）呈弥散分布（图2）。
在胶原性基质内.......
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讨论
该定制的多光子显微成像平台（MPM）结合控制软件，已用于小鼠上皮器官的活体成像，包括皮肤10、毛囊10以及眼表组织9,10（图1A）。自本项目启动以来，我们一直使用该定制系统，因其在更换光学组件以适应不同实验方面具有高度灵活性。该成像方法同样适用于商用多光子显微成像设备。本方案详细描述了利用多光子显微成像平台对小鼠眼表组织进行活体成像的具体方法。通过使用立体定位小鼠固定装置（图1B），我们能够对整个眼表区域的不同部位进行可视化观察。其精确的定位能力使得对特定区域内的细胞动态变化进行时间序列监测成为可能。
尽管已有若干关于小鼠角膜多光子显微成像（MPM）的活体研究报道19,
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢中国台湾科技部（106-2627-M-002-034，107-2314-B-182A-089，108-2628-B-002-023，108-2628-B-002-023）、中国台湾大学医院（NTUH108-T17）和中国台湾长庚纪念医院（CMRPG3G1621，CMRPG3G1622，CMRPG3G1623）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AVIZO Lite 软件 | Thermo Fisher Scientific | 版本：2019.3.0 | |
| 带通滤光片 | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 | |
| 二向色镜 | Semrock | FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36 | |
| 振镜 | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO 控制软件 | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| 盐酸奥布卡因 | Sigma | O0270000 | |
| 光电倍增管 | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| 聚乙烯管 | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| 立体定位小鼠固定装置 | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| 钛：蓝宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| 直立显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 维地西克凝胶 | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| 赛拉嗪 | Virbac | VR-2831 |
参考文献
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
- Hodges, R. R., Dartt, D. A.
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重印与许可
