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方法文章

一种用于小鼠角膜和结膜活体成像的定制多光子显微镜平台

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DOI：

10.3791/60944

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2020年5月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种用于活体小鼠眼表成像的多光子显微成像平台。利用荧光转基因小鼠，可实现对眼表内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。来源于胶原结构的非线性二次谐波生成信号，可实现对基质结构的无标记成像。

摘要

传统的组织学分析和细胞培养系统无法完全模拟体内生理和病理动态。多光子显微成像技术（MPM）已成为活体细胞水平生物医学研究中最常用的成像方式之一，其优势包括高分辨率、深层组织穿透能力以及极低的光毒性。我们设计了一套配备定制小鼠眼夹具和立体定位平台的多光子显微成像系统，用于活体眼表成像。利用双荧光蛋白报告小鼠，可实现对眼表区域内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。除多光子荧光信号外，同步采集二次谐波生成（SHG）信号还可用于表征胶原性基质结构。该平台可用于在整个眼表（包括角膜和结膜）进行精确定位的活体成像。

引言

角膜和结膜等眼表结构可保护其他更深层的眼部组织免受外界干扰。角膜是眼睛透明的前部结构，既具有将光线导入眼内的屈光透镜功能，又起到保护屏障的作用。角膜上皮是角膜的最外层，由表层细胞、翼状细胞和基底细胞等不同层次构成。角膜基质由高度有序排列的胶原板层组成，其中嵌有角膜细胞。角膜内皮是一层单层扁平六边形细胞，通过其泵功能维持角膜基质相对脱水的状态，从而对保持角膜透明性具有重要作用1。角膜缘构成角膜与结膜之间的边界，也是角膜上皮干细胞的储存库2。高度血管化的结膜通过分泌黏液和泪液，有助于润滑眼球3。

角膜表面结构的细胞动态通常通过组织学分析或体外细胞培养来研究，但这些方法可能无法充分模拟体内细胞动态。因此，一种非侵入性的活体成像方法可以弥补这一不足。由于具备高分辨率、光损伤小以及成像深度较深等优势，多光子显微成像技术（MPM）已成为生物研究多个领域的强大工具4,5,6,7,8。在角膜成像中，MPM可通过细胞内NAD(P)H产生的固有自发荧光获取细胞信息。在飞秒激光扫描下，由非中心对称的I型胶原纤维产生的二次谐波生成（SHG）信号，可在无需额外染色的情况下呈现胶原性基质结构9。此前，我们及其他研究团队已将MPM应用于动物和人角膜的成像研究9,10,11,12,13,14,15。

表达特定细胞群体中荧光蛋白的转基因小鼠品系已广泛应用于细胞生物学的多项研究，包括发育、组织稳态、组织再生以及癌变过程。我们利用表达荧光蛋白的转基因小鼠品系，通过多光子显微镜（MPM）对角膜9,10、毛囊10和表皮10进行活体成像。该双荧光小鼠品系的细胞膜标记为tdTomato，细胞核标记为EGFP，由两种小鼠品系杂交获得：R26R-GR（B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847）16 和 mT-mG（Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676）17。R26R-GR转基因小鼠品系在Gt (ROSA)26Sor位点插入了包含H2B-EGFP融合基因和mCherry-GPI锚定信号融合基因的双荧光蛋白报告系统。mT-mG转基因品系是一种细胞膜靶向的tdTomato和EGFP荧光Cre报告小鼠。在Cre重组发生前，tdTomato荧光标记的细胞膜蛋白广泛存在于多种细胞中。该转基因小鼠品系使我们能够在无需Cre激活的情况下，同时观察到细胞核的EGFP信号和细胞膜的tdTomato信号。将两只雌性（R26R-GR+/+）与一只雄性（mT-mG+/+）转基因小鼠共同交配，以获得足够数量的实验用小鼠。其后代中具有R26R-GR+/-;mT-mG+/-基因型的小鼠，即双荧光小鼠品系，被用于本研究。与先前报道的单荧光报告小鼠品系相比9,10，该双荧光报告小鼠品系可使成像时间减少50%。

在本研究中，我们利用成像平台及双荧光转基因小鼠，逐步详细描述了活体眼表成像的技术方案。

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方案

所有动物实验均按照中国台湾大学和长庚纪念医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的程序进行。

1. 多光子显微镜设置

  1. 构建基于直立显微镜并配备水浸物镜（20倍，数值孔径1.00）的成像系统（图1A）。
  2. 采用钛宝石激光器（波长可调）作为激发光源。EGFP的激光输出波长设为880 nm，tdTomato的激光输出波长设为940 nm（图1A）。
  3. 使用两个二向色镜（495 nm 和 580 nm）分别用于分离SHG/EGFP信号以及EGFP/tdTomato信号（图1A）。通过带通滤光片434/17 nm、510/84 nm和585/40 nm对SHG信号、EGFP和tdTomato进行光谱分离（图1A）。
  4. 为优化图像质量并避免光漂白和组织损伤，成像角膜时激光功率设为约35 mW，成像角膜缘时设为50 mW。激光功率应在进入光学系统前进行测量，样品处的实际激光功率约为8–9 mW。完整的显微系统设计如图1A所示。
    注意：激光功率上限设定为70 mW，以避免光漂白和组织损伤。

2. 活体成像的动物准备

  1. 使用 8–12 周龄的小鼠进行实验。按 50–80 mg/kg 剂量经肌肉注射盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮以实施全身麻醉。通过轻捏脚趾检查小鼠是否无退缩反射。充分麻醉对于维持稳定的呼吸频率监测至关重要。
    注意：建议使用 8 周龄及以上的小鼠，因其眼球已发育成熟。
  2. 将麻醉后的小鼠置于加热载物台上，并将体温监测探针插入肛门。
    警告：探针必须完全插入肛腔内，避免暴露于空气中，以防加热器过热导致小鼠中暑。

3. 眼部固定用于眼表活体成像

  1. 进行眼表活体成像时，使用定制的立体定位小鼠固定装置，该装置由两部分组成：头部固定器用于稳定头部，眼睑固定器用于牵拉眼睑并暴露整个眼表（图1B-D）。
  2. 将耳杆插入外耳道，并维持头部固定器的三点固定（图1B,D）。
  3. 在眼表局部滴加0.4%盐酸奥布卡因生理盐水溶液，作用3分钟以麻醉眼表。
  4. 确保通过适当的手动眼睑牵拉使眼球充分突出。否则可能导致眼球缺血和出血。
  5. 将眼睑固定器的聚乙烯管环小心地沿眼睑边缘放置，以暴露眼表。使用由5号杜蒙镊子制成的眼睑固定器（其尖端包裹聚乙烯管环）来稳定眼球（图1C,D）。
  6. 通过眼睑固定器远端镊子上的旋钮拧紧镊子，以保持眼球稳定（图1D）。
  7. 每小时在角膜表面涂抹折射率为1.338的眼用凝胶作为浸润介质，以维持眼表湿润。此外，每小时定期涂抹眼用凝胶可避免成像过程中角膜浑浊。
  8. 将固定器锁定在步进电机驱动的载物台上，旋转眼球，以便对从角膜中央到周边区域的整个角膜表面进行成像（图1C,D）。
    注意：眼用凝胶过多或不足均可能影响成像质量。因此，每小时补充眼用凝胶以定期保持眼表湿润，对成像至关重要。

4. Z轴连续图像采集

注意：在每组切片中设置第一张和最后一张切片，以减少因掉落运动产生的伪影。

  1. 拍摄图像前，使用汞灯光源对目标区域进行成像。
  2. 单击显微镜软件的图标以启动软件。
  3. 选择合适的光电倍增管（PMT）增益和数字增益，以观察眼表的细胞结构。
  4. 设置起始切片和终止切片，以获取图像堆栈。
  5. 输入图像分辨率和z步进的数值，例如512 x 512和1 μm作为z步进。
  6. 单击开始按钮以采集z轴连续图像。
  7. 在同一区域连续采集两次实时图像：第一次使用880 nm激发光采集SHG/EGFP信号，第二次使用940 nm激发光采集EGFP/tdTomato信号。
    注意：两个图像堆栈的组合可提供三通道图像。图像分辨率为512 x 512像素，扫描格式尺寸为157 μm × 157 μm。

5. 图像处理与三维重建

  1. 将z轴序列图像载入Fiji软件18。
  2. 在Fiji中选择插件Median 3D filter以降低背景噪声。
  3. 在Fiji中选择模块Unsharp Mask filter以增强图像锐度。
  4. 点击亮度/对比度中的“Auto”按钮，自动优化图像质量。
  5. 将图像保存为图像序列，以便导出z轴序列图像。
  6. 将z轴序列图像导入商业软件（例如Avizo lite），利用体渲染进行三维重建。
  7. 在所有MPM图像中，分别以伪绿色、红色和青色显示EGFP、tdTomato和SHG信号。
  8. 通过快照功能获取三维结构图像。

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结果

利用该活体成像平台，可在细胞水平上观察小鼠的眼表结构。为了清晰显示眼表的单个细胞，我们采用了双荧光转基因小鼠模型，其细胞核表达EGFP，细胞膜表达tdTomato。富含胶原蛋白的角膜基质则通过二次谐波（SHG）信号进行高亮显示。

在角膜上皮中，可见表层细胞、翼状细胞和基底层细胞（图2）。在双荧光转基因小鼠中，我们能够对角膜和角膜缘上皮中从基底层到表层的单个细胞进行定位映射（图2）。观察到呈六边形的表层细胞（图2中白色箭头所示）。在角膜上皮中，从基底层向外侧各层，细胞核大小和核间距均逐渐增大（图2）。tdTomato荧光的胞质信号显示，在翼状细胞中，富含膜蛋白的细胞内囊泡系统（包括高尔基体和内质网）呈弥散分布（图2）。

在胶原性基质内...

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讨论

该定制的多光子显微成像平台（MPM）结合控制软件，已用于小鼠上皮器官的活体成像，包括皮肤10、毛囊10以及眼表组织9,10（图1A）。自本项目启动以来，我们一直使用该定制系统，因其在更换光学组件以适应不同实验方面具有高度灵活性。该成像方法同样适用于商用多光子显微成像设备。本方案详细描述了利用多光子显微成像平台对小鼠眼表组织进行活体成像的具体方法。通过使用立体定位小鼠固定装置（图1B），我们能够对整个眼表区域的不同部位进行可视化观察。其精确的定位能力使得对特定区域内的细胞动态变化进行时间序列监测成为可能。

尽管已有若干关于小鼠角膜多光子显微成像（MPM）的活体研究报道19,

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢中国台湾科技部（106-2627-M-002-034，107-2314-B-182A-089，108-2628-B-002-023，108-2628-B-002-023）、中国台湾大学医院（NTUH108-T17）和中国台湾长庚纪念医院（CMRPG3G1621，CMRPG3G1622，CMRPG3G1623）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AVIZO Lite 软件Thermo Fisher Scientific版本：2019.3.0
带通滤光片SemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
二向色镜SemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
振镜ThorlabsGVS002
Jade BIO 控制软件SouthPort CorporationJade BIO
盐酸奥布卡因SigmaO0270000
光电倍增管HamamatsuH7422A-40
聚乙烯管BECTON DICKINSON427401
立体定位小鼠固定装置Step Technology Co.,Ltd000111
钛：蓝宝石激光器Spectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
直立显微镜OlympusBX51WI
维地西克凝胶Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
赛拉嗪VirbacVR-2831

参考文献

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