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我们描述了使用FLLIT的详细协议，FLLIT是一种全自动机器学习方法，用于在自由移动的果蝇黑色素气器和其他昆虫中跟踪腿爪运动。这些协议可用于定量测量野生苍蝇、突变苍蝇和神经退化的苍蝇模型的细微行走步态运动。
果蝇模型对于神经功能的研究和理解神经退化的分子和细胞机制是无价的。虽然用于操纵和研究神经元子集的飞行技术已经变得越来越复杂，但由此产生的行为表型的丰富性并没有在类似的细节中被捕获。要能够研究细微的飞腿运动，以便突变体之间的比较，需要自动测量和量化高速和快速腿部运动的能力。因此，我们开发了一种机器学习算法，用于在自由行走的苍蝇、基于功能学习的肢体分割和跟踪 （FLLIT） 中实现自动腿爪跟踪。与大多数深度学习方法不同，FLLIT 完全自动化，无需用户注释即可生成自己的训练集，使用学习算法中内置的形态参数。本文介绍了使用FLLIT进行步态分析的深入协议。它详细介绍了摄像机设置、竞技场建设、视频录制、腿部分割和腿部爪跟踪的过程。它还概述了FLLIT生成的数据，其中包括每个视频帧的原始跟踪身体和腿部位置、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频。为了证明FLLIT的使用，我们在脊柱生成药物aa 3的飞行模型中量化了相关的病变步态参数。
在过去的几十年里，神经退行性疾病和运动障碍在我们的老龄化人群中越来越普遍。尽管我们对许多神经退行性疾病的理解在分子和细胞水平上有所进步，但受影响的神经元回路基础疾病的基本特征仍然知之甚少。最近开发的行为跟踪工具1,1，2，3，4现在允许我们研究运动异常的动物疾病模型，以识别分子，细胞和电路调节基础疾病。2,3,4
许多神经退行性疾病的分子通路在果蝇果蝇果蝇黑色素加斯特中得到保存，果蝇病模型有助于阐明神经退化5、66的基本机制。5我们最近显示，帕金森病（PD）和脊柱细胞酸藻3（SCA3）的飞行模型表现出独特的、保守的步态特征，类似于人类疾病1，表明苍蝇模型可以用来理解特定运动障碍中运动功能障碍的回路机制。在飞行模型中，在单个基因和单个细胞级别77、8、9、108,9,10中，用于靶向操作和可视化神经元的丰富且不断发展的工具库，使苍蝇成为探索体内疾病通路、神经元回路和行为表型表现之间关系的理想模型之一。为了实现精确的、自动化的昆虫步态分析，我们最近开发了一种机器学习方法，即基于FEature L的LImb分段和T机架（FLLIT）1。1
FLLIT 由一个完全自动化的多阶段算法组成，该算法首先对腿部像素进行段段段，随后用于定位和跟踪相应的腿爪。FLLIT 采用用于分段的增强算法，与最近工作2、,3中使用的深度学习算法相比。在这两个框架中，特征提取通过学习卷积内核自动完成，与卷积神经网络有一些相似之处。FLLIT 的第一步涉及使用形态学操作（边缘和骨架化）以高置信度自动生成正（腿部上的像素）和负数（飞行体上的背景或像素）训练样本。因此，FLLIT 是完全自动化的，不需要用户带带名的培训样本。使用上述训练示例，然后在增强算法的框架内训练分类器。一组弱分类器被迭代地学习，每个分类器包括一组用于特征提取的卷积内核和一个决策树。最后学习的分类器随后用于腿部分割，能够比形态学操作更好地识别困难区域/硬样本，从而生成整体更准确的分割，用于跟踪1。从分段的支腿中，我们找到提示并使用匈牙利算法跟踪它们:通过跨帧匹配提示，从而最小化每个提示移动的距离之和。FLLIT 可以通过记住最后一个看到的位置（以苍蝇中心坐标）来处理阻塞情况，以便在腿尖不再被遮挡时恢复。
我们之前表明，FLLIT可以自动和准确地跟踪腿部运动，并分析步态在一个无标记，自由移动的苍蝇或蜘蛛从高速视频1;因此，FLLIT应广泛适用于节肢动物腿跟踪。通过利用形态参数提取机器学习训练套件，FLLIT 自动训练自己对昆虫腿进行分割和跟踪，而无需费力的手动注释，这是大多数深度学习方法所必需的。因此，FLLIT 是完全自动化的。在腿部分割和跟踪后，FLLIT 可自动在每个视频帧中生成原始跟踪的身体和腿部位置、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频，用于步态分析和步态运动的可视化。该协议提供了使用 FLLIT 的分步指南。
1. 系统设置
2. 准备飞行记录
3. 生成 FLLIT 分析视频
注: 此步骤特定于所使用的摄像机。在这种情况下，使用商用摄像机（参见材料表）。
4. 安装FLLIT程序
注: 最新的说明可在以下处找到:https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
5. 运行 FLLIT 进行自动腿部跟踪
在腿部分割、跟踪和数据处理之后，FLLIT 自动生成身体和每个支腿爪位置的原始数据、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频（表 1）。
在这里，我们使用脊柱小肾上腺素aa 3 （SCA3） 的飞行模型来演示这些分析。泛神经驱动Elav-GAL4用于驱动全长野生型人类SCA3与27谷氨酰胺在多Q道（UAS-SCA3-flQ27），或全长突变人类SCA3与84谷氨酰胺在多Q带（UAS-SCA3-flQ84）11。11SCA3是典型的一个税步态与身体旋转，不稳定的脚放置和短，蹒跚的步骤12，13（表2）。12,为了描述突变SCA3苍蝇的步态特征，并研究它们是否表现出与人类患者相似的步态，我们分析了FLLIT产生的相关步态参数，即:身体转弯次数、脚印规律性、腿部区域重叠和尺寸以及腿部步长（表2）。
我们发现，SCA3-Q84苍蝇表现出更多的转弯（图4A，A'），不稳定的脚放置，如低足迹规律性（扩大标准差的AEP14）（图4B），增加的腿域重叠（图4C-D），C-D扩大腿域的长度和面积（图4E，F），和减少步幅长度（图4G）。
FLLIT 还生成一个视频，显示以竞技场为中心和以身体为中心的视图、身体轨迹和方向以及每条腿的垂直和横向位移的跟踪苍蝇和腿（图 5）。跟踪的视频允许并排比较不同苍蝇腿部运动。Elav-GAL4>SCA3-flQ27 （视频 1） 和Elav-GAL4>4 >SCA3-flQ84 （视频 2） 苍蝇的代表性视频表明，与Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27苍蝇 （图 5A）Figure 5B相比， 交叉不同大小的腿部域，表示一个蹒跚、有计划步态的步态。
图 1.设置录音台和竞技场。从 （A） 正面和 （B） 侧视图的录音。（C） 用于制作飞行记录以进行 FLLIT 跟踪的竞技场示例。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2:使用双头摄像头在飞行步态录制期间查看活动窗口，允许同时录制两个苍蝇。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3:在分段和跟踪后显示按钮面板和标记腿的主动 FLLIT 窗口。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:代表FLLIT生成的数据，用于表达野生型（SCA3-flQ27）与突变体（SCA3-flQ84）SCA3（A）体轨迹中旋转次数的A苍蝇的相关步态参数。（B） 中腿脚印规律性正常化到身体长度。（C-C'）遍历每条腿的腿域。（D） 腿之间的域重叠。（E） 中腿域长度与身体长度规范化。（F） 中腿域区域规范化为车身长度2。（G） 中腿步长与体长一般化。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5:具有代表性的 FLLIT 生成的视频的快照。（A） Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27和 （B） Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 苍蝇.请点击这里查看此图的较大版本。
视频1:代表视频表达泛神经野生型人类全长SCA3（Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27）。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。
视频2:代表视频表示泛神经突变人类全长SCA3（Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84）。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。
补充图 1:VcXSrv 的配置。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 2:Xquartz 的配置。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 3:标有计算视场所需尺寸的图像。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 类别 | 参数 | 描述 | 文件/打印（如果适用） |
| 原始数据 | 车身位置 | 每个帧中身体质质的位置坐标 | CoM.csv 的前两列 |
| 身体轨迹 | 车身轴的旋转角度（以度表示）（相对于 y 轴） | CoM.csv 的第三列 | |
| 以竞技场为中心的腿爪 位置 |
基于竞技场坐标，每个帧中每个支腿爪的位置坐标 | 轨迹.csv | |
| 以身体为中心的腿爪 位置 |
每个帧中每个支腿爪的位置坐标 基于竞技场坐标 |
norm_trajectory.csv | |
| 身体运动 | 车身长度（毫米） | 每帧估计的样本动物的长度（头部至后部前最位置 机翼上的位置） |
身体长度.csv |
| 瞬时身体速度 （毫米/s） |
样本动物体内的瞬时速度（质心） | 身体速度.csv;身体速度.pdf | |
| 身体的转折点 轨迹 |
要定位转折点，使用 Dougl asPeucker 将轨迹简化为分段线性曲线 算法，其后，车削事件被确定为涉及两个相邻之间的角度 > 50 deg 构成简化轨迹的线性段 |
身体轨迹.pdf | |
| 单个步幅参数 | 步长持续时间（毫秒） | 步长事件的持续时间 | 步幅参数.csv |
| 步长周期（毫秒） | 从一个步长事件到下一个步长事件的持续时间 | ||
| 步幅位移（毫米） | 步幅事件期间腿爪的位移 | ||
| 覆盖的步幅路径（毫米） | 步幅活动期间腿爪覆盖的总路径 | ||
| 前极端位置 （毫米） |
步幅事件结束时腿爪的着陆位置（相对于身体） | ||
| 后极位置 （毫米） | 步幅事件开始时腿爪的起飞位置（相对于身体） | ||
| 步幅振幅（毫米） | 沿步幅事件的运动方向的位移 | ||
| 姿态线性度（毫米） | 定义为步幅路径与平滑的曲线的偏差（以 20 毫秒的间隔）平滑到相应的前 和后极端位置的步幅 |
||
| 步幅拉伸（毫米） | 在步幅事件中间，腿爪位置与车身中心的距离 | ||
| 腿运动 | 腿速（毫米/s） | 每条腿的瞬时速度 | 腿速度.csv;盖特.pdf |
| 盖特指数 | 这测量了（六条腿）样本动物在运动过程中表现出的步态协调的类型。步态 索引 1 对应于三脚架步态，#1对应于四足步态，而 0 表示非规范步态。 在我们的实施中，步态指数是通过 120 ms 窗口上的移动平均线获得的 |
盖特指数.csv;盖特指数.pdf | |
| 移动百分比 | 腿部运动时间的百分比 | 腿参数.csv | |
| 平均步长周期（毫秒） | 从一个步长事件到下一个步长事件的平均持续时间 | 腿参数.csv | |
| 占地面积规律性（毫米） | 测量为后发和 | 腿参数.csv | |
| 腿部前极端位置 | |||
| 腿轨迹域区域 （毫米2） |
在以身体为中心的参照系中包含整个腿轨迹的最小凸体船体区域 | 腿参数.csv;LegDomain.pdf | |
| 的长度和宽度 腿轨迹域（毫米） |
通过爪位置的最大投影距离获得到主（域长度）和次要 （域宽度）主轴 |
腿参数.csv | |
| 腿域交点/重叠 （毫米2） |
每个可能之间的交点/重叠 | 勒格内斯重叠.csv | |
| 姿态宽度（毫米） | 左腿和中腿的 AEP 和 PEP 之间的距离平均值 | 斯坦茨·斯韦 |
表1:FLLIT生成的盖特参数。
| 盖特功能 | ||||
| 脊柱小脑的盖特特征 3 （SCA3） | 转向 | 不稳定的脚部和腿交叉 | 蹒跚的步骤 | 短步 |
| 测量参数 | 正文转弯事件数 | 足迹规律性 | 腿域的大小，域重叠程度 | 步长 |
| FLLIT 文件 | 身体轨迹.pdf | 腿参数.csv | 勒格内斯重叠.csv | 步幅参数.csv |
表 2:表显示人类患者具有相应 FLLIT 参数和输出文件的标志 SCA3 步态特征。
作者没有什么可透露的。
我们描述了使用FLLIT的详细协议，FLLIT是一种全自动机器学习方法，用于在自由移动的果蝇黑色素气器和其他昆虫中跟踪腿爪运动。这些协议可用于定量测量野生苍蝇、突变苍蝇和神经退化的苍蝇模型的细微行走步态运动。
作者感谢穆米塔·查特吉和爱丽丝·刘的技术支持，以及布卢明顿果蝇股票中心（美国印第安纳州）提供本作品中使用的果蝇菌株。这项工作得到了新加坡分子和细胞生物学研究所的支持;新加坡生物信息学研究所;科学技术和研究局联合理事会组织（授予SA和LC编号15302FG149）;由新加坡卫生部国家医学研究委员会（授予编号NMRC/TCR/013-NNI/2014至SA）、阿尔伯塔大学（对LC的启动赠款）和加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）发现补助金（授予编号RGPIN-2019-04575给LC）管理的临床研究旗舰计划（帕金森病）。
| 亚克力板 | Dama | 1.6 毫米厚，透明板 | 新加坡，新加坡 |
| 透明玻璃滑轨 | 生物媒体 | BMH 880101 | 新加坡 |
| 高速摄像机 | Photron | Fastcam MC2.1 | 日本东京。1 毫秒或更快的快门速度非常适合减少拍摄图像的运动模糊 |
| 红外线 LED | 任何 - 来自五金店的通用 | 940nm 红外光板 | |
| 新加坡 Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | 美国德克萨斯州欧文 |
