Beskrevet her er en protokoll for å studere hvordan sigarettrøyk ekstrakt påvirker bakteriell kolonisering i lunge epitelceller.
Sigarettrøyking er den viktigste etiologiske årsaken til lungeembosem og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Sigarettrøyking fremmer også følsomhet for bakterielle infeksjoner i luftveiene. Effekten av sigarettrøyking på bakterielle infeksjoner i humane lungeepitelceller er imidlertid ennå ikke grundig undersøkt. Beskrevet her er en detaljert protokoll for fremstilling av sigarettrøykeekstrakter (CSE), behandling av humane lungeepitelceller med CSE, og bakteriell infeksjon og infeksjonsbestemmelse. CSE ble utarbeidet med en konvensjonell metode. Lungeepitelceller ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer CSE-behandlede celler var da infisert med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakterielle belastninger av cellene ble bestemt av tre forskjellige metoder. Resultatene viste at CSE økte Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokollen gir derfor en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.
Sigarettrøyking påvirker den offentlige helsen til millioner av mennesker over hele verden. Mange skadelige sykdommer, inkludert lungekreft og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), er rapportert å være relatert til sigarettrøyking1,2. Sigarettrøyking øker mottakeligheten for akutte mikrobielle infeksjoner iluftveiene 3,4,5. Videre viser monteringsbevis at sigarettrøyking forbedrer patogenesen av mange kroniske lidelser6,7,8. Sigarettrøyking kan for eksempel øke virus- eller bakterieinfeksjoner som forårsaker KOLS-eksacerbasjon9. Blant de bakterielle patogener som etiologisk bidrar til akutt forverring av KOLS, forårsaker et opportunistisk gram-negativt bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, infeksjoner som korrelerer med dårlige prognoser og høyeredødelighet 10,11. KOLS-forverring forverrer sykdommen ved å akselerere patologisk progresjon. Det finnes ingen effektive behandlinger mot KOLS-eksacerbasjon bortsett fra antisymptomatisk styring12. KOLS-forverring fremmer pasientdødelighet, reduserer livskvaliteten og øker den økonomiske byrden på samfunnet13.
Luftveiene er et åpent system, kontinuerlig utsatt for ulike mikrobielle patogener tilstede eksternt. Opportunistiske bakterielle patogener oppdages vanligvis i de øvre luftveiene, men noen ganger observeres i de nedre luftveiene14,15. I dyremodeller P. aeruginosa kan detekters i alveolr sacs så snart som 1 time etter infeksjon16. Som en viktig forsvarsmekanisme eliminerer immunceller som makrofager eller nøytrofiler bakteriene i luftveiene. Lungeepitelceller, som den første fysiologiske barrieren, utfører en unik rolle i vertsforsvaret mot mikrobielle infeksjoner. Lungeepitelceller kan regulere mikrobiell invasjon, kolonisering eller replikering uavhengig av immunceller17. Noen molekyler som finnes i epitelceller, inkludert PPARg, utøver antibakterielle funksjoner, og regulerer dermed bakteriell kolonisering og replikering i lungeepitelceller18. Sigarettrøyking kan endre molekylene og svekke normal forsvarsfunksjon i lungeepitelceller19,20. Nyere studier rapporterte direkte eksponering av sigarettrøyk til lungeepitelceller ved hjelp av robotrøykeapparat21,22. Eksponering for røyk kan utføres på andre måter, men inkludert bruk av CSE. Fremstilling av CSE er en reproduserbar tilnærming med potensielle applikasjoner i andre celletyper, inkludert vaskulære endotelceller som indirekte utsettes for sigarettrøyk.
Denne rapporten beskriver en protokoll for å generere sigarettrøyk ekstrakt for å endre bakteriell belastning i lunge epitelceller. CSE øker bakteriebelastningen av P. aeruginosa, og det kan bidra til tilbakefall av bakterielle infeksjoner vanligvis sett i KOLS-forverring. En konvensjonell metode brukes til fremstilling av CSE. Lungeepitelceller, på deres eksponentielle vekststadium, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolayer-kultiverte lungeepitelceller bli direkte utsatt for sigarettrøyk i et luftvæskegrensesnitt. CSE-behandlede celler blir deretter utfordret med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakteriene spres med en bestemt ristingshastighet for å sikre at morfologien til deres flagella forblir intakt for å beholde sin fulle invasive kapasitet. Gentamycin er ansatt for å drepe bakteriene som er igjen i kulturmediet, og reduserer dermed den potensielle forurensningen under den påfølgende fastsettelsen av bakteriebelastningen. Protokollen bruker også GFP-merket Pseudomonas, som har blitt brukt som et kraftig verktøy i å studere Pseudomonas infeksjon i ulike modeller. En representativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden av infeksjon eller bakteriell belastning etter CSE-behandling bestemmes på tre måter: drop plate-metoden med kolonitelling, kvantitativ PCR ved hjelp av Pseudomonas 16S rRNA-spesifikke primere, eller strømningscytometri i celler infisert med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokollen er en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.
Bakteriell invasjon i lungeepitelceller er et avgjørende skritt i patogenesen av bakterielle infeksjoner. Prosessen med bakteriell invasjon i cellene kan brytes ned i følgende tre trinn: Først kontakter bakteriene og holder seg til overflaten av epitelcellen ved hjelp av deres flagella. For det andre gjennomgår bakteriene enten internalisering eller trenger inn i cellulær membran. Til slutt replikerer og koloniserer bakteriene cellene hvis de klarer å unnslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Institutes of Health R01 tilskudd HL125435 og HL142997 (til CZ).
50mL syringe | BD Biosciences | ||
airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
Cell Counter | Bio-Rad | ||
CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
OD reader | USA Scientific | ||
PCR primers | ITD | ||
Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |