Summary
Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.
Abstract
Het handhaven van een gezond proteoom is essentieel voor cel- en organismale homeostase. Verstoring van het evenwicht tussen eiwit translationele controle en afbraak veroorzaakt een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten. De achteruitgang van de proteostasekwaliteitscontrolemechanismen is een kenmerk van veroudering. Biochemische methoden om de novo eiwitsynthese te detecteren zijn nog steeds beperkt, hebben verschillende nadelen en kunnen niet worden uitgevoerd in levende cellen of dieren. Caenorhabditis elegans, transparant en gemakkelijk genetisch gemodificeerd, is een uitstekend model om eiwitsynthese tarieven te controleren met behulp van beeldvormende technieken. Hier introduceren en beschrijven we een methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te meten met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Transgene dieren die fluorescerende eiwitten uitdrukken in specifieke cellen of weefsels worden bestraald door een krachtige lichtbron die resulteert in fluorescentie fotobleaching. Op zijn beurt betekent de beoordeling van fluorescentieherstel nieuwe eiwitsynthese in cellen en/of weefsels van belang. Vandaar dat de combinatie van transgene aaltjes, genetische en/of farmacologische interventies samen met live beeldvorming van eiwitsynthesesnelheden licht kan werpen op mechanismen die leeftijdsafhankelijke proteostaseinstorten.
Introduction
Eiwitsynthese en afbraak is essentieel voor organismale homeostase. Een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten wordt aangespoord door gebrekkige eiwitproductie1,2. Om de wereldwijde eiwitvertalingssnelheden te meten, zijn er biochemische technieken zoals ribosomale profilering, waarbij diepe sequencing van ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten wordt betrokken om expressie te monitoren, evenals nieuwe eiwitsynthese3. Deze methode, naast het feit dat een indirecte uitlezing van de translationele tarieven, zoals toegenomen RNA associatie met ribosomen betekent niet noodzakelijkerwijs meer vertaling, heeft technische nadelen, zoals hoge kosten en een eis van een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal. Anderzijds maken proteomics-gebaseerde methoden directe eiwitkwantificering mogelijk door metabole pulsprofilering, gevolgd door massaspectrometrieanalyse4,5. Dit is echter een semi-kwantitatieve benadering met beperkte temporele resolutie die niet gemakkelijk in vivo kan worden gebruikt. Bovendien kan de etikettering van het eiwit ongelijk worden verdeeld in het dier/weefsel van belang. Belangrijk is dat beide methoden weefselspecifieke of celspecifieke variaties in eiwitvertalingssnelheden in respectievelijk hele dieren of weefsels kunnen verbergen.
Caenorhabditis elegans is een gebruiksvriendelijk modelorganisme dat in grote aantallen kan worden geteeld6. Bovendien zorgen de genetische besneerbaarheid en transparantie voor live beeldvorming in vivo. Dit protocol beschrijft de methodologie om eiwitsynthesesnelheden te detecteren met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). We maken gebruik van de transgene expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij in het hele organisme, hetzij in specifieke weefsels/ cellen. Transgene dieren kunnen GFP uitdrukken met behulp van de promotor van een gen, dat op grote schaal/wereldwijd wordt uitgedrukt, ofwel een weefselspecifieke promotor om specifieke celtypen aan te pakken. Deze techniek kan worden uitgebreid tot een specifieke promotor om eiwitsynthese tarieven van een specifiek eiwit te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zowel transcriptie- als translationele fusies met fluoroforen kunnen worden gebruikt om de novo-eiwitvertaling in verschillende weefsels te evalueren. Eiwitsynthese tarieven kunnen worden beoordeeld voor meerdere eiwitfamilies die gelokaliseerd in verschillende cellulaire compartimenten, met inbegrip van cytoplasma, mitochondriën en kern7. De volgende stammen worden gebruikt om wereldwijde en neuronale eiwitsynthese tarieven te controleren, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Onderhoud, synchronisatie en bereiding van transgene aaltjes voor het monitoren van de novo-eiwitsynthese
- Gebruik een ontledende stereomicroscoop om de ontwikkelingsstadia en groei van wilde typen (wt) en gemuteerde transgene aaltjes te beoordelen.
- Dag 1: Gebruik een wormpick om 10 L4 larven van wt en mutanttransgene dieren met de gewenste tl-verslaggever te selecteren en over te brengen op Nematode Growth Media (NGM) platen gezaaid met Escherichia coli (OP50) (Tabel 1).
- Maak een worm pick door het bevestigen van een platina draad in het taps toelopende uiteinde van een glas Pasteur pipet door het smelten van het glas op de contactplaats op een Bunsen brander. Vervolgens, plat het einde van de platina draad in een spatel vorm met behulp van een gereedschap (bijvoorbeeld, tang of lichte hamer).
- Inenting een enkele kolonie E. coli (OP50) bacteriën in een kolf met 50 mL luria-Bertani (LB) vloeibaar medium en groeien gedurende 10 uur bij 37 °C in een schuddende incubator (200 rpm; Tabel 1). Dan zaad NGM platen met 200 μL van bacteriële cultuur. Incubeer de gezaaide platen bij kamertemperatuur 's nachts om de groei van de bacteriële gazon mogelijk te maken.
- Incubeer en kweek de aaltjes bij de standaardtemperatuur van 20 °C.
- Dag 5: De platen bevatten een gemengde populatie transgene wormen. Selecteer en breng 15 L4 larven van elke stam over op vers gezaaide OP50-NGM platen.
- Dag 6: Voer FRAP-test uit en controleer de eiwitsynthesesnelheid op dag 1 van de volwassenheid.
- Voorbereiden en gebruiken cycloheximide met NGM platen als een positieve controle:
OPMERKING: Bereid een voorraadoplossing van cycloheximide voor door in water te verdunnen tot een concentratie van 10 mg/mL. Houd de voorraadoplossing op 4 °C.- Dood bacteriën door de gezaaide NGM-platen gedurende 15 minuten bloot te stellen met UV-licht (222 μW/cm2 intensiteit).
- Voeg cycloheximide toe bovenop de met bacteriën gezaaide platen tot 500 μg/mL eindconcentratie in het agarvolume.
- Laat platen 30 minuten drogen op kamertemperatuur.
- Breng transgene aaltjes die psod-3GFP uitdrukken op voertuig- en cycloheximide-bevattende platen.
- Dieren uitbroeden voor 2 uur bij de standaardtemperatuur van 20 °C.
2. FRAP-test met behulp van transgene dieren die somatisch weefsel reporters pife-2GFP en psod-3GFP uitdrukken
OPMERKING: Monitor de wereldwijde eiwitsynthese in het hele dierlichaam. Deze transcriptie verslaggevers presenteren verschillende expressieniveaus en worden alomtegenwoordig uitgedrukt in meerdere somatische weefsels, waaronder darm, keelholte en lichaamswandspieren.
- Kies en breng 1-dag-volwassen transgene dieren naar individuele NGM platen gezaaid met een 20 μL OP50 daling in het midden.
- Verwijder het deksel en plaats elke plaat onder een 20x objectieve lens van een epifluorescentiemicroscoop.
- Focus en leg een referentieafbeelding vast voordat je fotobleekt (pre-bleekmiddel).
- Photobleach elk monster gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Stop de fotobleaching wanneer het tl-signaal wordt gedoofd tot 30 – 50% intensiteit ten opzichte van pre-bleken beeld. De lichtintensiteit en de duur van de bleekperiode moeten dienovereenkomstig worden aangepast voor het specifieke fluorofoof, het stadium van het dier en de onderzochte cel- of weefselweefsel. De juiste duur van de bestraling die nodig is om een voldoende mate van fotobleekt te bereiken, voor verschillende specimens moet experimenteel worden bepaald. - Maak een afbeelding na photobleaching (bleekmiddel).
- Houd dieren in individuele NGM-platen en laat ze herstellen.
- Beeld en neem het herstel van elke tl-reporter elke 1 uur gedurende ten minste 6 uur op een fluorescentie stereomicroscoop.
- U ook fluorescerende herstelbeoordeling uitvoeren met behulp van een epifluorescentiemicroscoop (bijvoorbeeld AxioImager Z2).
- Evalueer zorgvuldig de diergezondheidsduur per dier door hun bewegings-, aanraakgevoeligheid, voortplantingsvermogen en overleving in de komende 3 dagen te controleren. Aaltjes die tekenen van schade vertonen na fotobleaching werden uitgesloten van verdere analyse.
3. Montage van de monsters en uit te voeren FRAP-test met behulp van transgene aaltjes uitdrukken pan-neuronally cytoplasma GFP, punc-119GFP
OPMERKING: Monitor pan-neuronale eiwitsynthese door gerichte fotobleaching op het hoofdgebied, waar zenuwring zich bevindt.
- Bereid 2% agarose pads.
- Voeg een 10 μL drop van M9 buffer toe aan het midden van de agarose pad.
- Breng 5 transgene aaltjes die pan-neuronaal cytoplasmamisch GFP uitdrukken over in een druppel M9-buffer.
- Gebruik een wimper om de vloeistof te verspreiden.
OPMERKING: Dieren vertonen binnen 2 minuten minder bewegingen vanwege M9-absorptie in de agar. - Verander de nematodepositie om overlapping te voorkomen met behulp van een "wimper"-pick.
- Plaats het monster onder een 40x objectieve lens van een epifluorescentiemicroscoop.
LET OP: Gebruik geen coverslip. - Focus en leg een referentieafbeelding vast (pre-bleekmiddel).
- Fotobleach het beoogde gebied van belang voor 90 seconden.
OPMERKING: Stop de fotobleaching wanneer het tl-signaal wordt gedoofd tot 30 – 50% intensiteit ten opzichte van pre-bleken beeld. De lichtintensiteit en de duur van de bleekperiode moeten dienovereenkomstig worden aangepast voor het specifieke fluorofoof, het stadium van het dier en de onderzochte cel- of weefselweefsel. De juiste duur van de bestraling die nodig is om een voldoende mate van fotobleekt te bereiken, voor verschillende specimens moet experimenteel worden bepaald. - Maak een afbeelding na photobleaching (bleekmiddel).
- Voeg een 10 μL drop van M9 buffer op gefotobleached aaltjes.
- Laat de dieren 5 minuten herstellen.
- Gebruik de "wimper" pick of een pipet om de aaltjes over te brengen naar individuele NGM platen gezaaid met 20 μL OP50 druppel in het midden.
- Leg elk monster elk 1 uur een beeld vast onder een epifluorescentiesterescoop.
OPMERKING: Tel t=0 voor de hersteltijd na het fotoblelen.
4. Gegevensanalyse van beelden die tijdens de FRAP-test worden vastgelegd
- Analyseer de verkregen afbeeldingen met behulp van software (bijvoorbeeld Fiji).
- Open afbeeldingen met de software.
- Selecteer de opdracht Kanalen splitsen via de vervolgkeuzelijst Afbeelding en Kleur.
OPMERKING: Houd de afbeelding van het groene kanaal. - Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand om het fluorescerende gebied van belang (bijvoorbeeld het hele lichaam, hoofd, darm) handmatig in te stellen.
- Selecteer de opdracht Meten via het vervolgkeuzemenu Analyseren om de gemiddelde pixelintensiteit van het interessegebied voor elk tijdspunt te meten.
OPMERKING: Het percentage fluorescentieherstel wordt berekend met behulp van de referentiebeelden die zijn vastgelegd na het fotoblelen.
5. Statistische analyse van het verslag
- Gebruik ten minste 20 – 25 aaltjes van elke stam en/of aandoening.
OPMERKING: Er moeten drie biologische replicaties worden uitgevoerd. - Uitvoeren van student t-test(vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) voor statistische analyse met P < 0,05 als significant met behulp van statistische analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedure hier gepresenteerd, wilde type en mutant transgene nematoden uitdrukken van de volgende somatische verslaggevers, pife-22GFP, psod-3GFP en punc-119GFP, werden gebruikt om eiwitsynthese tarieven te beoordelen volgens de respectieve protocollen. In het bijzonder werden wilde type- en ife-2 gemuteerde wormen die cytoplasmische GFP in hun somatische weefsels uitdrukken met behulp van de ife-2 promotor eerder vergeleken, onmiddellijk na fotobleaching en 5 uur na herstel. Representatieve afbeeldingen en kwantificering tonen aan dat wilde diersoorten zich volledig herstellen terwijl ife-2-mutanten een verminderde terugwinningscapaciteit hebben(figuur 1A). Dus, wild type wormen initiëren de novo eiwit biosynthese na fotobleaching terwijl wormen ontbreekt mRNA vertaling initiatie factor IFE-2 zijn niet in staat om dit te doen, wat aangeeft dat de snelheid van fluorescentie herstel illustreert de snelheid van eiwitsynthese in vivo7. Bovendien kan cycloheximide, een specifieke remmer van mRNA-vertaling, worden gebruikt als een positieve controle op eiwitvertalingsremming. Inderdaad, cycloheximide-behandelde transgene dieren die cytoplasmatische GFP uitdrukken onder de sod-3 promotor, niet herstellen van hun fluorescentie op fotobleaching (Figuur 1B).
We hebben deze methode ook toegepast om te detecteren hoe mRNA-verwerkingsinstanties (P-instanties) de snelheid van eiwitvertaling beïnvloeden8. Wild type en edc-3 (ok1427) mutantaaltjes die GFP pan-neuronaal uitdrukken werden onderzocht op hun herstelcapaciteit op gerichte fotobleaching op het hoofdgebied. Fluorescentie herstel is veel langzamer in EDC-3 tekort dieren in vergelijking met wilde type (Figuur 1C). Dit geeft aan dat EDC-3-gemedieerde mRNA-omzet nieuwe eiwitsynthese belemmert en uiteindelijk eiwitvertaling initiatieonderdrukt 9.
Figuur 1: In vivo beoordeling van de novo eiwitsynthese in C. elegans. (A) FRAP-analyse in zowel wilde als IFE-2-tekorten die cytoplasmatische GFP uitdrukken onder de promotor van ife-2. Transgene dieren worden onderworpen aan het fotobleken van het hele dier. Het GFP-signaal wordt gereduceerd tot 30-50% van de initiële intensiteit. Fluorescentie wordt opgenomen vóór photobleaching (pre-bleekmiddel), na het einde van de fotobleaching periode (10 min; bleekmiddel) en 5 uur na het herstel. (B) De behandeling met cycloheximide remt het herstel van de fluorescentie van transgene dieren die cytoplasmamisch GFP uitdrukken onder de promotor van sod-3. Transgene dieren worden onderworpen aan hele dierlijke fotobleaching. Het GFP-signaal wordt gereduceerd tot 30-50% van de initiële intensiteit. Fluorescentie wordt opgenomen voordat fotobleaching (pre-bleekmiddel), na het einde van de fotobleaching periode (10 min; bleekmiddel) en 5 uur na het herstel (A, B: AxioImager Z2 microscoop; objectieve lens: 20x, numeriek diafragma 0.8; high-power lichtbron, HBO 100; 100 Watt kwikbooglamp; excitatie/ emissiefiltersets, Zeiss Set 38 Endow GFP shift free). Schaalbalken, 500μm. (C) EDC-3 tekorten nematoden vertonen verminderde de novo eiwitsynthese tarieven in neuronale cellen. Fluorescentiesignaal van zowel wilde type als edc-3(ok1427) dieren die pan-neuronaal cytoplasma gfp uitdrukken, wordt gemeten voordat fotobleaching (pre-bleekmiddel) en na de fotobleaching periode (90sec; bleekmiddel). Transgene dieren worden onderworpen aan fotobleaching op het hoofdgebied (zenuwring). Het GFP-signaal wordt gereduceerd tot 30-50% van de initiële intensiteit (AxioImager Z2; objectieve lens: 40x, numeriek diafragma 0,75; 30% lichtgevende kracht van de fluorescerende verlichtingsbron (FI-verlichtingssysteem X-Cite 120 XL FL PC, 120W metaalhalonidelamp) en volledig geopende iris). De gemiddelde pixelintensiteit van fluorescentieherstel wordt gemeten met tijdsintervallen van een uur. In elk van de drie onafhankelijke experimenten werden 20 dieren per stam gekwantificeerd. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde S.E.M., ***P < 0,05, ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagens | Recept | |
| 2% Agarose pads | 1. Weeg 0,5 g o fagarose in een cilindrische glazen bekerglas | |
| 2. Voeg 25 mL M9-buffer toe | ||
| 3. Verwarm in een magnetron tot dicht bij het koken. Haal eruit, roer met een pipetpunt en kook weer. Herhaal dit totdat de agarose is opgelost. | ||
| 4. Plaats een lege microscoopplaat op de bank. | ||
| 5. Zet een druppel (~ 50 μL) van verse 2% agarose oplossing in het midden van de dia. | ||
| 6. Neem een tweede microscoop dia en plaats deze op de top van de agarose drop. Druk voorzichtig naar beneden om de druppel plat te maken. | ||
| 7. Laat de agarose 30 seconden uitharden en verwijder voorzichtig de bovenste microscoop. | ||
| 8. Ga onmiddellijk verder met het monsterbereiding, omdat de agarosepads binnen ongeveer 5 minuten beginnen te drogen. | ||
| Tip: Laat de bovenste microscoop dia als een deksel om de vochtigheid langer te behouden (~ 1 uur). Zo kunnen verschillende agarose pads snel worden voorbereid en gebruikt tijdens de experimenten. | ||
| LB vloeibaar medium | 1. Los 10 g Bactotryptone, 5 g Bacto gistextract, 5 g NaCl in 1 L gedestilleerd water en autoclave op. | |
| M9-buffer | 1. Los 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4en 5 g NaCl op in 1 L gedestilleerd water en autoclave. | |
| 2. Laat afkoelen en voeg 1 mL van 1 M MgSO4 (steriel). | ||
| 3. Bewaar de M9-buffer bij 4 °C. | ||
| Nematode groeimedium (NGM) agar platen | 1. Meng 3 g NaCl, 2,5 g bactopepton, 0,2 g streptomycine, 17 g agar en voeg 900 mL gedestilleerd water toe. Autoclaaf. | |
| 2. Laat afkoelen tot 55-60 °C. | ||
| 3. Voeg 1 mL cholesterolvoorraadoplossing, 1 mL van 1 M CaCl2,1 mL van 1 M MgSO4,1 mL nystatin voorraadoplossing, 25 mL steriele fosfaatbuffer van 1 M, pH 6.0 en gedistilleerd steriel water tot 1 L toe. | ||
| 4. Pipette 10 mL medium per petrischaaltje en laat stollen. | ||
| 5. Bewaar de platen op 4 °C tot ze worden gebruikt. | ||
Tabel 1: Aanbevolen recepten voor gebruikte reagentia. Alle reagentia recepten die worden gebruikt in het gepresenteerde protocol worden hier beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwitsynthese modulatie is essentieel voor organismale homeostase. Tijdens de vergrijzing wordt zowel de wereldwijde als de specifieke eiwitsynthese verstoord. Recente studies tonen aan dat eiwitvertaalbalans senesescentie en veroudering direct controleert, is niet alleen een bijproduct van het verouderingsproces. In het bijzonder, kerncomponenten van de vertaalmachines zoals eukaryotische initiatiefactor 4E (eIF4E), die mRNA-aftopping tijdens de inleiding van de vertaling vergemakkelijkt, en dus de snelheid van cap-afhankelijke eiwitvertaling, oxiderende stress veroorzaakt en het verouderingsproces versnelt1. Bovendien, neuron-specifieke EDC-3, die interageert met mRNA processing bodies, P lichamen en verhoogt de snelheid van mRNA decapping, versnelt ook het verouderingsproces8. Specifiek, EDC-3 onderdrukking zorgt voor IFE-2 vastlegging in P lichamen, uiteindelijk het verminderen van eiwit vertaling niveaus, het uitstellen van neuronale veroudering9.
FRAP is een techniek die in eerste instantie is ontwikkeld om eiwitdynamica, lokalisatie, interacties en activiteit te onderzoeken met niet-invasieve fluorescerende tagging met behulp van live imaging in vivo, waardoor het een krachtig hulpmiddel is om eiwitsynthese in real-time te bestuderen8,10. Er zijn echter bepaalde kritieke stappen die aandacht en probleemoplossing vereisen. Wij bieden alternatieve oplossingen voor deze mogelijke obstakels of beperkingen die tijdens de experimentele procedure worden ondervonden.
Een probleem betreft worm beweging als de worm kan ontsnappen aan de lichtbron tijdens het fotobleaching. Dit probleem kan gedeeltelijk worden opgelost door het gebruik van transgene dieren die het rol-6(su1006) allel uitdrukken, waardoor dieren zich sinusoïdale wijze bewegen. Op deze manier kan het fotobleken van dieren continu worden uitgevoerd. Bovendien kan de onderzoeker de beweging volgen van de worm die zich buiten het zichtvlak veel langzamer beweegt. Toch kunnen agarpads ook worden gebruikt als alternatief voor het volledig immobiliseren van dieren.
De optimale duur van het fotobleaching is een extra kritische factor die tijdens de experimenten moet worden bepaald en stabiel moet worden gehouden. Onvoldoende fotobleaching als gevolg van ongerichte fotobleaching of korte duur kan worden aangetroffen. Dit kan worden overtroffen door het verhogen (a) de vergrotingsdoelstelling en numerieke diafragma, b) de lichtintensiteit en/of (c) fotobleaching duur.
Als er geen significant fluorescentieherstel wordt gedetecteerd, zijn er potentiële parameters die kunnen worden gewijzigd. Als fotobleaching buitensporig is, verklein de kopieerduur naarmate er schade is ontstaan. Schade aan de worm kan worden beoordeeld door het observeren van levenseigenschappen zoals aanraakgevoeligheid, voortbeweging, eierleg, faryngeale pompen en reproductieve capaciteit. Als de kinetiek van eiwitvertalingsherstel traag is, laat u een langere herstelperiode toe. Eiwitsynthese herstel varieert tussen verschillende eiwitfamilies en is afhankelijk van de reporter fusies lengte7.
Promotoractiviteit kan de kinetiek van eiwitsynthese beïnvloeden. Als de promotor inactief is tijdens het herstel, wijzigt u de gebruikte promotor. De activiteiten van de promotor kunnen worden gewijzigd bij stressomstandigheden, zoals fotoschade. Gebruik stabiele activiteitsontwikkelaars om globaal te controleren (bijvoorbeeld let-858, ife-2, sod-3)of weefselspecifiek (bijvoorbeeld lichaamswandspieren; myo-3, unc-54; keelholte: myo-2; pan-neuronale: unc-119, rab-3; mechanosensorische neuronen: mec-4; darm: vha-6, ges-1) eiwitvertalingssnelheden.
Als onvoldoende eiwitvertaling remming door cycloheximide optreedt, zou het verhogen van de pre-incubatietijd van de aaltjes dit probleem overwinnen. Een voorbehoud waarmee rekening moet worden gehouden is het gebruik van transgene wormen die eiwitten overspuiten. Het gebruik van CRISPR/Cas9-gegenereerde transgene aaltjes die de fluorescerende gelabelde eiwitten uitdrukken die op fysiologische niveaus van belang zijn, geven een nauwkeuriger beeld van eiwitkinetiek en omzet.
Totale eiwitniveaus gedetecteerd zijn het resultaat van hun eiwitafbraak en synthese tarieven. Eiwitafbraak komt steevast voor op basale niveaus in alle eukaryotische cellen. Dus, eiwit fluorescentie herstel tarieven, die worden gemeten in dit protocol, zijn niet absoluut, maar ten opzichte van de voorwaarden worden vergeleken. In wezen wordt het fluorescentieherstel in aanwezigheid van eiwitdegradatie gemeten. Daarom wordt aangenomen dat alle voorwaarden gelijke eiwitdegradatiepercentages hebben na het fotobleaching. Om absolute eiwitvertalingspercentages te meten, moeten eiwitafbraak-deficiënte mutantwormstammen worden gebruikt. Specifiek, mutaties in genen zoals rpn-10 van het proteasoom of lgg-2 voor autofagie kan worden gebruikt als een controle11. Als alternatief, RNAi knockdown van proteasomale en autophagische eiwitten kunnen worden uitgevoerd. Bovendien kunnen autophagische substraten zoals SQST-1::GFP worden gebruikt om de bijdrage van autofagische afbraak te detecteren onder de experimentele omstandigheden die zijn geselecteerd12.
In beide experimentele instellingen is deze FRAP-techniek niet-radioactief, niet-invasief, wat de novo-eiwitsynthese in vivo in verschillende weefsels in C. elegans detecteert. Het maakt live beeldvorming mogelijk voor en tijdens het fotoblelen in een in vivo setting en de daaropvolgende monitoring van de dieren gedurende hun hele leven. Verstoring van de vertaling initiatie vertraagt veroudering, vandaar het meten van de wereldwijde eiwitsynthese tarieven door FRAP kan worden gebruikt als een directe uitlezing van het verouderingsproces. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd en op grotere schaal worden gebruikt om genen en/of chemicaliën in verband met het verouderingsproces of leeftijdsgerelateerde ziekte te screenen. Als alternatief kunnen de totale of specifieke eiwitdegradatiesnelheden worden gemeten door onder verschillende genetische achtergronden te fotobleachen met behulp van hetzelfde protocol in combinatie met cycloheximide. Aangezien eiwitvertaling wordt geremd door cycloheximide, zal de snelheid van eiwitafbraak worden gedetecteerd. Dit protocol zal helpen bij een beter begrip van eiwitafbraaktrajecten in genetische modellen van eiwitaggregatieziekten13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video's. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma's van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N.
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
