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活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

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DOI：

10.3791/61234

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2020年6月11日

 ,  , 
1Department of Experimental Medical Science, Lund University, 2Lund University Diabetes Centre

本文内容

摘要

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。

摘要

成像β细胞是理解胰岛移植的关键步骤。尽管已有多种用于记录β细胞生物学特性的成像平台被开发并应用 体内，它们在实现单细胞分辨率和连续纵向记录方面存在局限性。由于角膜具有透明性，小鼠眼眼前房（ACE）非常适合用于研究人和小鼠胰岛细胞的生物学特性。本文描述了如何利用该方法对单个人胰岛移植物的移植及再血管化过程进行连续纵向记录。将人胰岛移植物通过NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠作为受体。这有助于研究受体细胞与供体细胞的扩增情况，以及受体细胞在促进移植物包裹和血管化过程中的作用。此外，本文还详细阐述了图像分析及定量评估胰岛体积、分割的血管结构以及形成胰岛包膜的受体来源细胞的逐步操作流程。

引言

糖尿病是一组以血糖水平升高为特征的代谢性疾病，其病因是由于胰腺胰岛β细胞缺失或功能障碍导致胰岛素分泌不足，常伴有胰岛素抵抗。1型（T1D）和2型糖尿病（T2D）均为复杂疾病，β细胞进行性功能障碍是疾病发生发展的关键因素。T1D由针对β细胞的自身免疫攻击引发，而T2D则被认为主要由代谢因素驱动，尽管越来越多的证据表明其伴随有低度全身性炎症1。供体人胰岛移植，特别是对T1D患者，有望实现生理性的血糖控制。然而，由于供体组织来源有限以及胰岛移植后植入效率低下，胰岛移植尚未成为主流治疗手段。在移植后的早期阶段（24–48小时），大量有功能的胰岛移植物因宿主环境缺氧、炎症反应及免疫原性而迅速丢失2,3。为了评估改善胰岛存活率的干预措施的有效性，必须对这类移植过程进行持续监测。

体内成像并追踪移植后人胰岛命运的技术对于糖尿病研究而言仍是一项挑战4,5。迄今为止，包括正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）或超声（US）在内的非侵入性成像技术在实验条件下显示出对移植胰岛进行定量和功能评估的潜力5。然而，由于胰岛体积较小，上述成像方式的定量测量受限于分辨率不足。将眼前房（ACE）作为用于观察的移植部位，是一种极具前景的非侵入性成像解决方案，可实现更有效的空间分辨率，并支持长期频繁监测6。该方法已成功应用于小鼠胰岛生物学研究（详见 Yang 等人综述7）、自身免疫反应8以及人胰岛移植研究9,10。

在此，ACE移植方法与双光子成像技术相结合，通过对单个胰岛移植物进行连续且重复的记录，以研究人类胰岛移植后长达10个月内的植入动态过程。多光子成像具有更深的成像深度以及更低的整体光漂白和光损伤，克服了共聚焦显微镜的成像局限性11。荧光成像的定量分析包含多个步骤，包括胰岛样本制备、胰岛移植、图像采集、图像滤波以去除胰岛噪声或背景信号、图像分割、定量分析及数据处理。其中最具挑战性的步骤通常是将图像划分为多个部分或区域，例如将信号与背景噪声分离，或根据颜色或形状的相似性对体素区域进行聚类，从而识别并标记代表胰岛血管系统的三维体素。一旦完成分割，诸如目标体积等统计参数通常可直接提取。本文提供了一种用于成像数据定量分析与提取的方法，包括图像分割与数据可视化。特别关注人胰岛中自发荧光的去除，以及胰岛血管系统与形成受体细胞包膜的细胞之间的区分。

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方案

瑞典隆德地区伦理委员会根据《涉及人类的研究伦理审查法案》批准了本研究。动物实验严格遵循瑞典动物实验伦理规定，并经马尔默和隆德伦理委员会批准。移植实验使用6至8周龄的免疫缺陷型NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-（NOD.ROSA-tomato.Rag2-/-）小鼠作为受体，用于人胰岛移植10。

1. 移植用胰岛的制备

  1. 按照先前所述方法，在CMRL 1066培养基中培养人胰岛，培养基中添加10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、50 μg/mL庆大霉素、0.25 μg/mL两性霉素B、20 μg/mL环丙沙星、10 mM烟酰胺（NIC）和10%热灭活人血清，于37 °C、5% CO2及湿润空气中培养，直至进行移植12。
    注意：胰岛应无外分泌组织残留，且在培养过程中不应相互接触。外分泌组织呈半透明状。
  2. 移植当天，使用连接拉制玻璃毛细管的吸管装置，将含有胰岛的培养基转移至新的培养皿中。
    注意：也可使用200 µL移液器。对培养皿背面进行染色有助于在体视显微镜下更清晰地区分胰岛。
  3. 在体视显微镜下，每次移植挑选约20–40个胰岛，并转移至1.5 mL离心管中。用培养箱中的培养基将管内液体加满。
  4. 用石蜡膜密封离心管，并置于冰上保存，直至进行移植。根据移植次数准备相应数量的样品。
  5. 或者，可在手术室内配备CO2培养箱，将胰岛持续维持在培养状态，并在每次移植前立即挑选。

2. 移植设备和手术台的准备

注意：所有外科手术器械均应进行高压灭菌，手术台和器械需用70%酒精消毒。

  1. 通过鼻罩将立体定位头架连接至麻醉装置，并打开加热垫。
  2. 将无菌密封的汉密尔顿注射器连接至聚乙烯管和钝端眼套管。
    注意：建议在组装前用磷酸盐缓冲液（PBS）充满所有部件。检查是否存在困住的气泡，如有则应清除。
  3. 将汉密尔顿注射器牢固地固定在台面（图1a）或可移动底座（图1e）上，并将管路固定至体视显微镜，使套管自然下垂（即待用位置）。
    注意：建议使用外科胶带，因其易于拆卸和重新固定。
  4. 准备一支1 mL注射器，连接30 G针头，并吸入0.1 mg/kg的丁丙诺啡溶液。
  5. 准备一支含有无菌PBS的注射器，或 alternatively 使用移液器。
  6. 另准备一个干净的复苏笼，并配备加热灯。

3. 手术受体小鼠的麻醉与体位固定

注意：所有动物均在隆德大学动物实验设施的无病原体环境中繁育和饲养。

  1. 在充满40% O₂的麻醉舱中对小鼠进行麻醉260% N2/3% 异氟烷，然后将麻醉后的小鼠转移至温热加热垫上的头部固定装置平台图1a检查是否存在足底反射消失。
    注意：异氟烷麻醉是术后快速恢复的首选麻醉方法。使用异氟烷时，显微镜室必须具备良好的通风条件。
  2. 将小鼠的吻部放入连接至40% O₂的麻醉面罩中260% N2/0.9%–1.5% 异氟烷麻醉机。用拇指和食指轻轻抬起小鼠头部，并使用两侧的金属部件固定。确保耳杆直接固定在耳下方。在小鼠背部皮下注射 0.1 mg/kg 的丁丙诺啡溶液。
    注意：布托啡诺用作一种 镇痛药
  3. 将头部倾斜，使待手术的眼睛朝上并靠近研究人员。
  4. 使用钝头镊子轻轻牵开待移植眼的眼睛眼睑，将眼球推出，并用一对镊子松散固定。确保镊子尖端覆盖有连接在头架平台上的聚乙烯管（图1a，插入）。
  5. 始终通过向眼部滴加一滴无菌 PBS 以保持双眼湿润。
  6. 将人胰岛从密封的1.5 mL离心管（第1节）转移至含有无菌PBS的培养皿中，并确保胰岛彼此靠近，以尽量减少随细胞培养基转移的液体量（图1c).
  7. 用连接至汉密尔顿注射器的聚乙烯管连接的眼科套管，吸取约20–30个胰岛。
    注意：收集胰岛时，尽量吸取最少的液体。
  8. 将管路倒置悬挂并连接至体视显微镜图1d用胶带小心固定导管，使胰岛沉降至导管末端靠近套管针处。

4. 移植操作步骤

注意：此方法此前已描述用于小鼠胰岛的移植6，此处介绍的是稍作修改的实验步骤。

  1. 捏住小鼠后肢的足垫，确认小鼠已处于麻醉状态。
  2. 收紧固定眼睛的镊子，确保不阻碍血流，然后向眼表滴加一滴无菌 PBS。
  3. 使用25 G针头作为手术刀，斜面向上，小心地将针尖约一半刺入角膜，做单一侧向切口。切口方向应略向上倾斜；移植后切口更易自行闭合（图1f）。
  4. 用预装胰岛的套管针轻轻抬起角膜，缓慢将胰岛注入眼内。避免将套管针插入前房，以防损伤虹膜，而应小心地抵住角膜切口处推注胰岛（图1g）。随后缓慢从前房撤出套管针。
    注意：注射体积应控制在3–8 µL。若体积过大，会导致眼内压过高，可能引起胰岛从前房反流。
  5. 若因眼内压力升高导致胰岛注入困难，可通过扩大侧向切口位置来增加开口，并重新注入胰岛。
    注意：偶尔可利用引入的气泡作为占位空间。
  6. 向眼部涂抹眼用凝胶，松开固定眼睛的镊子，将小鼠保持在异氟烷麻醉下静置8–10分钟，使胰岛稳定。
  7. 取下夹住眼睑的镊子，将眼睑复位至正常位置。
  8. 将小鼠从头部固定装置中取出，转移至复苏笼中。
  9. 当小鼠清醒并能自主活动时，将其转移回原饲养笼，继续在动物房饲养直至成像（建议至少饲养5天）。

5. 通过双光子显微镜成像移植的人类胰岛

注意：建议在移植后4–5天，使用荧光体视显微镜拍摄眼部的整体图像（图2a–c），以便在进行双光子成像前定位目标胰岛。移植后早期应避免过度固定眼球。双光子成像应在移植后6–7天进行。

  1. 启动图像采集软件（参见材料表）。在“激光”菜单中激活Mai Tai激光器（功率设为“开启”），在“光路”菜单中将波长设置为900 nm，并使用滑块将透射激光功率从5%–10%的最低值开始调节。
    注意：扫描过程中可根据需要调整激光功率。
  2. 设置绿色、橙色和红色通道。使用二向色镜（LBF 760）和以下发射滤光片信息，将发射光同时收集到三个非扫描探测器（NDD）上：红色/Angiosense 680，690–730 nm；绿色/自发荧光，500–550 nm；橙色/Tomato，565–610 nm（图2d）。
  3. 将头部固定装置安装到电动显微镜载物台上，并将面罩连接至麻醉机的管路以及通气系统的管路。打开加热垫。
  4. 对受体小鼠进行麻醉，将其转移至头部固定平台，固定眼睛以便成像，并按照前述方法（步骤3.1–3.5）给予布托啡诺溶液。
  5. 根据需要调节异氟烷蒸气浓度。呼吸频率约为55–65次/分钟（bpm）表示麻醉深度适宜。若麻醉过深，呼吸频率将<50 bpm，伴有深大呼吸或喘息；若麻醉过浅，呼吸频率将>70 bpm，伴有浅表呼吸。麻醉期间应每15分钟目视检查一次小鼠状态。
    注意：麻醉反应因小鼠个体、品系差异以及麻醉持续时间的不同而有所变化13。
  6. 在眼球表面涂抹足量眼用凝胶作为角膜与镜头之间的浸没液，使其缓慢积聚（图2f，插图）。避免产生气泡。
    注意：建议使用柔性金属软管灯进行侧向照明，以帮助调节焦距并定位胰岛移植物。
  7. 为观察血管，使用一次性胰岛素30 G注射器经尾静脉注射100 µL成像剂（如Angiosense 680）。
  8. 在“采集模式”中，将帧尺寸调整为512 x 512，并设置扫描速度。
    注意：较慢的扫描速度（即增加驻留时间）可提高信噪比。
  9. 在“通道”菜单中，调节每个PMT的主增益（单位：伏特），以放大信号直至在实时扫描模式下屏幕上可见图像。该值越高，探测器对信号和噪声的敏感性也越高。
    注意：建议将增益值保持在500–800 V之间。
  10. 在“Z堆栈”菜单中，通过手动调节焦距至胰岛移植物顶部来定义Z堆栈的起始位置，并点击“设为第一层”保存位置。然后移动至胰岛移植物中可聚焦的最底层平面，点击“设为最后一层”保存该位置。Z步进大小设为2 µm。
  11. 点击“开始实验”选项卡以采集最终图像堆栈，并保存为8位CZI格式（即Carl Zeiss格式）文件。

6. 通过共聚焦显微镜对移植的人胰岛进行成像

注意：通过监测移植胰岛的总体积、形态和可塑性，可对其进行评估 体内 通过检测激光背向散射光，在单独的扫描（即独立的轨迹）中获取散射信号10.

  1. 取出主分光镜（即 LBF 滤光片），在“光路”对话框中为共聚焦成像设置独立的通道。选择波长为 633 nm 的氩离子激光器，并在与激光波长相同的波长下进行检测。使用 2–3 µm 的步长采集背向散射光信号的 Z 轴层扫图像。
  2. 重新调整 Z 轴层扫设置，确保记录整个胰岛（参见步骤 5.10）。
  3. 采集图像序列并保存为 8 位 CZI 文件。

7. 图像分析

注意：此步骤使用了商业软件（参见材料表）。

  1. 去除胰岛自发荧光图3b)
    1. 在“图像处理” 选项卡，选择 “通道运算”并输入“ch1-ch2”。这将创建一个新的通道4（ch 4）；将其重命名为“血管系统”.
      注意：绿色/自发荧光通道将从红色/Angiosense通道中减去。
    2. 重复上一步操作并输入“ch3-ch2”以创建一个新通道（ch 5）；重命名为“番茄 (全部)”.
      注意：绿色/自发荧光通道已从橙色/番茄红通道中扣除。
  2. 通过手动绘制定义胰岛掩膜（图3c)
    1. 创建一个新表面（蓝色符号），并在向导中选择“手动编辑”。将指针保持在“选择”模式，在3D视图中取消勾选“体积”（在……之下 场景以可视化切片。
    2. 为更清晰地区分胰岛边界，需激活所有通道，包括通道1至通道3。
      注意：橙色/番茄红通道可用于通过番茄红胶囊信号界定胰岛边界。或者，可增强通道强度，利用多通道胰岛自发荧光及检测器背景信号作为参考。
    3. 在“绘图” 选项卡，选择“轮廓”并点击“吸取”开始在切片位置1处沿胰岛边界绘制轮廓。
    4. 移动到新的切片位置并重复绘制轮廓。在胰岛顶部的最后一个切片完成绘制后，点击“创建表面” 标签。通常每隔10个绘制轮廓线即可th 切片
  3. 分割胰岛血管系统” 和 “番茄胰岛素瘤” 使用胰岛掩模进行荧光检测（图3d).
    1. 选择先前定义的“胰岛掩模”对象，转到编辑选项卡（铅笔 符号），然后单击“遮蔽所有” 选项卡，将打开一个新窗口。
    2. 选择先前命名的通道“血管系统”（通道4）在通道选择下拉菜单中，并激活选项“应用遮罩前复制通道”, “恒定的内外环境”，并将表面外部的体素设置为“0.000”，这将创建一个新通道；将其重命名为“胰岛血管系统”（第6章）
    3. 重复步骤 7.3.1 和 7.3.2，并选择先前创建的通道“番茄 (全部)”（通道5）在通道选择下拉菜单中创建新通道；重命名为“番茄胰岛素瘤”（第7章）
  4. 胰岛血管系统的表面渲染（图3e)
    1. 在“场景”菜单中，在向导中选择“自动创建”.
    2. 将源通道设置为先前创建的“胰岛血管系统”（第6章），并选择背景减除。如有需要，可调整自动阈值估算。与相应的荧光通道进行比较（例如，通过淡入/淡出新创建的表面标签页）。继续执行向导中的后续步骤。
    3. 可选地，使用滤镜。例如，选择“体积”，然后调整窗口中的滤光片（黄色），以去除选定的表面对象。完成向导操作，并将新的表面对象命名为“胰岛血管系统”.
  5. 分割“胰岛番茄血管系统”荧光信号（图3f)
    1. 在先前创建的“胰岛血管系统 表面物体，转到编辑选项卡并点击“全部遮蔽” 选项卡，将打开一个新窗口。
    2. 选择先前命名的通道“番茄胰岛素瘤”（通道7）在通道选择下拉菜单中，并将表面外的体素设置为“10.000”，用于创建新通道；将其重命名为“胰岛番茄血管系统”（第8章）
  6. 分割“番茄果实”荧光信号（图3g)
    1. 选择“通道算术”在“图像处理” 选项卡并输入 “ch7-ch8”，创建新通道；重命名为“番茄果实（第9章）
      注意：“胰岛番茄血管系统“荧光信号从总信号中扣除”番茄胰岛荧光信号
  7. 表面渲染的“胰岛番茄血管系统” 和 “番茄果荚” (图 3h)
    1. 按照步骤 7.4 操作，在向导中选择源通道“胰岛番茄血管系统”（第8章）或“番茄果荚”（第9章）以相应地创建新的表面对象。
  8. 总胰岛表面的表面渲染（图3i)
    1. 打开胰岛背向散射文件并创建一个新的表面。
    2. 在向导中，选择“自动创建”并定义“感兴趣区域”.
      注意： "感兴趣区域" 用于分离多个胰岛的信号，并定义待分析胰岛的深度（例如，顶部75 µm）。
    3. 在“绝对强度如有需要，可调整阈值。可点击开启或关闭表面对象，以与相应通道的强度进行交叉核对。关闭向导。
  9. 定量分析（图3j)
    1. 在“场景”菜单并转到“统计学表格。
    2. 要获取所选表面对象的详细体积数据，请选择“详细” 选项卡，然后选择 “特定值” 和 “体积” 从下拉菜单中选择。要获取所选表面对象的总体积值，请转至“详细” 选项卡并选择“平均值”.

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结果

将未标记的人胰岛移植到8周龄雌性NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-（NOD.ROSA-tomato.Rag2−/−）受体小鼠的前房（ACE）中。为防止人体组织排斥，选择免疫缺陷型Rag2基因敲除小鼠作为受体。在这些转基因小鼠中，所有细胞和组织均表达一种膜靶向的番茄荧光蛋白（mT），从而可清晰区分受体与供体组织。通过高分辨率双光子显微镜对胰岛移植物进行重复成像，可识别参与移植物植入过程的mT+受体细胞及其动态迁移模式。

总体而言，将人胰岛移植到受体小鼠眼前房（ACE）的手术设置在胰岛形态和大小方面与同系小鼠胰岛移植相似（图1a）。（图1b、c）。（图1d、

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讨论

本文介绍了一种通过观察受体和供体组织的参与情况来研究人胰岛细胞移植过程的方法。将人胰岛通过微创手术植入免疫缺陷小鼠的眼前房后，小鼠在手术后数分钟内即可迅速恢复。该操作仅在一侧眼睛进行。通常，在移植后5至7天，角膜已充分愈合，可进行活体成像观察。

在本实验方案中，人胰岛移植物的质量至关重要。人胰岛的质量及其移植效果可能因供体的年龄、体重指数（BMI）、分离过程以及胰岛在到达前后培养的时间而有所差异。所使用的人胰岛来自经批准用于临床移植和研究目的的器官捐献者胰腺，并已获得捐献者知情同意。这些胰岛通过胰腺消化和胰岛纯化的流程制备，具体方法见其他文献12。与分离的小鼠胰岛类似，在酶消化过程中，这些胰岛会经历多种细胞损伤，包括缺血、机械应力、基底膜蛋白的丢失以及胰岛内皮细胞（ECs）的部分破坏14,15。尽管培养条件不断改善，并能回收大量高质量的人胰岛，但移植前的等待时间仍然是一个关键因素。在培养的最初几天内，人胰岛会显著丢失胰...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由瑞典研究理事会、战略研究领域Exodiab（项目编号：2009-1039）、瑞典战略研究基金会（项目编号：IRC15-0067，资助对象：LUDC-IRC）、隆德皇家自然科学院、瑞典糖尿病协会及瑞典儿童糖尿病协会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉机，例如 Anaesthesia Unit U-400Agnthos8323001用于手术和成像过程中的异氟烷麻醉
- 1.4 L 诱导室Agnthos8329002通过管路连接至 U-400
- 气体通路切换阀Agnthos8433005通过管路连接至 U-400
AngioSense 680 EXPercin ElmerNEV10054EX注射用成像剂，用于人胰岛移植物中血管的成像
吸管管组件SigmaA5177-5EA与拉制毛细移液管配合使用，用于手动挑选胰岛
布托啡诺（Temgesic）0.3 mg/mlSchering-Plough Europé64022液体，用于镇痛
毛细移液管VWR321242C与吸管管组件配合使用
德克萨斯红标记葡聚糖（TR），70 kDaInvitrogenD1830注射用成像剂
眼用套管，钝端，25 GBVI Visitec/BDBD585107根据Tapered Hydrode lineator [Blumenthal]定制，尺寸：0.5 × 22 mm（25G × 7/8 in）（45?），尖端 taper 至 30 G（0.3 mm）
眼用凝胶NovartisViscotears，含 Carbomer 2 mg/g
Hamilton 注射器 0.5 ml，型号 1750 TPLTHamilton81242活塞式气密注射器，用于胰岛注射
头部固定装置
- 头部固定适配器NarishigeSG-4N-S安装于金属板上
- 气体面罩NarishigeGM-4-S
- UST-2 固体万向节NarishigeUST-2安装于金属板上
- 定制金属板，用于头部固定装置组装
- Dumont #5，直头Agnthos0207-5TI-PS 或 0208-5-PS连接至 UST-2（定制）
加热垫，定制固定于立体定位平台
人胰岛培养基
- CMRL 1066ICN Biomedicals人胰岛细胞培养基
- HEPESGIBCO BRL
- L-谷氨酰胺GIBCO BRL
- 庆大霉素GIBCO BRL
- 两性霉素B（Fungizone）GIBCO BRL
- 环丙沙星Bayer healthcare AG
- 烟酰胺Sigma
图像分析软件BitplaneImaris 9
图像采集软件ZeissZEN 2010
红外灯VWR1010364937用于保持苏醒笼中动物体温
异氟烷（Isoflo）Abott Scandinavia/Apotek液体，用于麻醉
针头 25 G（0.5 × 16 mm），橙色BD10442204用作手术刀
培养皿，90 mmVWR391-0440
双光子/共聚焦显微镜
- LSM7 MP 直立显微镜Zeiss
- 钛宝石激光器 TsunamiSpectra-Physics, Mai Tai
- 长工作距离水浸物镜 20×/NA1.0Zeiss
- ET710/40m（Angiosense 680）Chroma288003
- ET645/65m-2p（TR）ChromaNC528423
- ET525/50（GFP）Chroma
- ET610/75（tomato）Chroma
- 主分光镜 T680lpxxrChromaT680lpxxr二向色镜，透射 690 nm 及以上波长，反射 440 至 650 nm，尺寸 25.5 × 36 × 1 mm
聚乙烯管（内径 0.38 mm，外径 1.09 mm）Smiths Medical Danmark800/100/120用于连接 Hamilton 注射器与眼用套管
体视显微镜Nikon型号 SMZ645，用于胰岛挑选
荧光体视显微镜用于胰岛移植物成像
- AZ100 MultizoomNikon宽视野、长工作距离
- AZ Plan Apo 1xNikon
- AZ Plan Apo 4xNikon
- AZ-FL 透射荧光装置，配 C-LHGFI 汞灯Nikon
- HG 手动新型 IntensilightNikon
- 透射荧光滤光块 TEXAS REDNikon包含 EX540-580、DM595 和 BA600-660
- 透射荧光滤光块 G-2ANikon（EX510-560、DM575 和 BA590）
- 透射荧光滤光块 B-2ANikon（EX450-490、DM505 和 BA520）
- DS-Fi1 彩色数字相机（500 万像素）Nikon
1 ml 注射器，OmnitixBraun9161406V用于布托啡诺注射，配合 27 G 针头使用
手术胶带3M

参考文献

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