高通量筛选化学化合物以阐明其对细菌持留作用的影响

摘要

在本方法学论文中，我们提出了一种高通量筛选策略，用于鉴定对细菌持留现象具有显著影响的化学化合物，例如渗透保护剂。

摘要

细菌持留菌是指一小部分具有耐受高浓度抗生素能力的表型变异亚群。由于与反复发作的慢性感染相关，持留菌构成了重要的健康问题。尽管已知应激相关机制的随机性和确定性动态在持留现象中起着关键作用，但导致细胞进入或退出持留状态的表型转换机制尚未完全阐明。虽然由环境信号（如碳源、氮源和氧源的耗竭）触发的持留因子已被广泛研究，但渗透调节物质（osmolytes）对持留现象的影响仍有待明确。我们利用微阵列（即含有多种化学物质的96孔板），设计了一种高通量方法，用于阐明多种渗透调节物质对大肠杆菌（Escherichia coli）持留特性的影响。该方法具有可拓展性，可轻松适用于其他筛选阵列，例如药物筛选板和基因敲除文库。

引言

细菌培养物中存在一小部分耐受异常高浓度抗生素的持留细胞亚群。持留细胞与其对抗生素敏感的同类在遗传上完全相同，其存活归因于暂时性的生长抑制¹。持留细胞最早由 Gladys Hobby 发现²，但该术语首次由 Joseph Bigger 在鉴定青霉素处理的 Staphylococcus pyogenes 培养物中的此类细胞时提出³。Balaban 等人发表的一项开创性研究⁴发现了两种持留细胞类型：I 型变体主要在经历静止期后形成，而 II 型变体则在对数生长期持续产生。持留细胞可通过克隆形成存活实验进行检测，即在抗生素处理过程中的不同时间点取培养样品，洗涤后接种于常规培养基上，以计数能够在无抗生素条件下形成菌落的存活细胞。通过双相杀灭曲线^4,5  可评估细胞培养物中持留细胞的存在，其中初始的指数衰减阶段代表对抗生素敏感细胞的死亡。然而，随着时间推移，杀灭速率逐渐下降，最终进入平台期，该阶段代表存活下来的持留细胞。 

持留细胞已与多种疾病相关，如结核病⁶、囊性纤维化

方案

1. 准备培养基、氧氟沙星溶液和 E. coli 菌种储备液

1. 常规Luria-Bertani（LB）培养基：在去离子水（DI）中加入10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠（NaCl）和5 g/L酵母提取物。通过高压灭菌对培养基进行灭菌。
2. LB琼脂平板：在去离子水（DI）中加入10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物和15 g/L琼脂，并通过高压灭菌对培养基进行灭菌。在适当温度（约55 °C）下，将约30 mL琼脂培养基倒入方形培养皿（10 x 10 cm）中。干燥平板后于4 °C保存。
3. 改良LB培养基：在去离子水（DI）中加入10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物。通过高压灭菌对培养基进行灭菌。 
4. 含渗透调节剂的改良LB培养基：将2倍浓度的改良LB培养基与2倍浓度的渗透调节剂溶液等体积混合。制备2倍浓度改良LB培养基时，在去离子水（DI）中加入20 g/L胰蛋白胨和10 g/L酵母提取物，并通过高压灭菌进行灭菌。制备2倍浓度渗透调节剂溶液时，将目标渗透调节剂（2倍用量）溶解于去离子水（DI）中，然后通过滤膜灭菌。  
   注意：目标渗透调节剂及其浓度可由表型微阵列筛选实验（见方案4）确定。然而，所测试的渗透调节剂及其相应的2倍浓度可根据研究性质进行调整。例如，若要研究1 mM氯化钠的影响，则2倍渗透调节剂溶液应为2 mM氯化钠溶液。

结果

图1描述了我们的实验方案。稀释/生长循环实验（见方案2）借鉴了Keren等人⁵的研究，以消除来自过夜培养物的持留细胞。图2A是用于测定细胞培养物在氧氟沙星（OFX）处理前后菌落形成单位（CFU）水平的琼脂平板的代表性图像。在这些实验中，细胞在含有渗透调节剂的改良LB培养基中培养，使用半面积96孔板，具体如步骤4.2所述。将培养板在摇床中孵育24小时后，采用通用的平底96孔板进行持留细胞检测（见步骤4.3）。本实验中所测试的渗透调节剂及其浓度是基于我们之前的研究¹⁹选定的，在该研究中我们使用PM-9板执行了步骤4.1和4.3，PM-9板包含多种不同浓度的渗透调节剂（氯化钠、氯化钾、硫酸钠、乙二醇、甲酸钠、尿素、乳酸钠、磷酸钠、苯甲酸钠、硫酸铵、亚硝酸钠和硝酸钠）。图2A中的第一列显示了对照组的CFU计数。第二列表示细胞在100 mM硝酸钠中培养的条件；此前研究发现该条.......

讨论

本文所述的高通量持留菌检测方法旨在阐明各种化学物质对大肠杆菌（E. coli）持留现象的影响。除了商用PM板外，微阵列也可按照步骤4.2所述手动构建。此外，本方案具有灵活性，可用于筛选其他96孔板格式的微阵列，例如药物筛选板和细胞文库。实验条件（包括生长阶段、接种率和培养基）可根据所测试文库进行调整。例如，若需筛选细胞文库（如Keio E. coli基因敲除文库²³），可首先使用多通道移液器将文库中的菌株转移至含有新鲜培养基的96孔板中。待细胞达到所需生长阶段（如对数期或稳定期）后，再按照步骤4.3所述方法将细胞转移至持留菌检测板，以定量测定各敲除菌株的持留水平。类似地，该策略也可用于筛选E. coli Promoter文库²⁴（一种以96孔板格式存放的荧光报告菌株文库），以鉴定被抗生素激活的启动子。这些启动子可通过在抗生素处理期间检测持留菌检测板中菌株的荧光信号而被快速识别。

在我们的实验中，我们使用了改良的 LB 培养基（不含 N.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 毫升试管	Fisher Scientific	14-959-1B
大肠杆菌菌株 MG1655	普林斯顿大学		来自 Brynildsen 实验室
平底 96 孔板	USA Scientific	5665-5161
透气性封膜	VWR	102097-058	经伽马辐照灭菌，无细胞毒素
半面积平底 96 孔板	VWR	82050-062
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-2	分子遗传学级
氧氟沙星盐	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
表型微阵列（PM-9 和 PM-10）	Biolog	N/A	PM-9 和 PM-10 板分别含有多种渗透保护剂和缓冲液
圆底 96 孔板	USA Scientific	5665-0161
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500	符合 ACS 分析纯标准
硝酸钠	Fisher Scientific	AC424345000	ACS 试剂级
亚硝酸钠	Fisher Scientific	AAA186680B	纯度 98%
方形培养皿	Fisher Scientific	FB0875711A
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421-500	分子遗传学级
Varioskan lux 多功能微孔板读数仪	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	用于测量 600 nm 处的光密度
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-100	分子遗传学级