一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

摘要

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位 杂交

摘要

钙诱导钙释放信号（CICR）在许多生物过程中发挥着关键作用。从细胞增殖与凋亡、发育与衰老，到神经元突触可塑性及再生，这些细胞活动均与兰尼碱受体（Ryanodine receptors, RyRs）相关。尽管钙信号在生物学中具有重要意义，但其在早期发育中的具体作用机制仍不明确。作为一种妊娠周期较短的生物，其胚胎在 黑腹果蝇 是研究发育过程中CICR相关蛋白及其调控因子分布与定位的理想对象。然而，由于其胚胎富含脂质且卵壳富含几丁质，导致胚胎难以牢固附着于玻璃表面，限制了其应用。本文中，我们介绍了一种实用的实验方案，可显著增强胚胎在玻璃表面的附着能力 果蝇 将胚胎置于载玻片上，并详细说明成功进行组织化学、免疫组织化学的实验方法 原位 杂交。铬矾明胶载玻片包被法和胚胎预包埋法显著提高了研究中的产量 果蝇 胚胎蛋白质和RNA表达。为展示该方法，我们研究了DmFKBP12/Calstabin，其为果蝇早期胚胎发育过程中兰尼碱受体（RyR）的一个已知调控因子 黑腹果蝇我们鉴定了 DmFKBP12 在合胞体囊胚阶段早期即开始，并报告其动态表达模式 DmFKBP12 在发育过程中：最初在合胞体原肠胚中均匀分布，随后在细胞化原肠胚阶段初步定位于皮层的基底层，继而在原肠胚早期三胚层阶段分布于原始神经结构和消化结构中。这种分布模式可能解释了兰尼碱受体（RyR）在起源于这些胚层的重要器官系统中的关键作用，包括舌下神经节、咽上神经节、腹神经索以及肌肉骨骼系统。

引言

钙诱导的钙释放信号（CICR）在许多生物过程中发挥关键作用，例如骨骼肌/平滑肌和心脏血管功能、细胞增殖与凋亡、发育、衰老、神经元突触可塑性以及再生^1,2,3,4,5,6。兰尼碱受体（RyRs）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3Rs）是钙信号通路中的主要参与者，其活性受蛋白激酶A（PKA）、Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）、FK506结合蛋白（FKBPs）、钙网蛋白（CSQ）、三联蛋白（triadin）和连接蛋白（junctin）等调节因子调控^1,2,3,4,5,6。这些蛋白在人体中的异常表达或突变可导致心律....

方案

1. 葡萄汁琼脂平板的制备

1. 将5 g琼脂和5 g蔗糖加入150 mL蒸馏水中，用微波炉加热至琼脂和蔗糖完全溶解。将50 mL 100%葡萄汁与该溶液混合。
2. 加入1 mL 100%丙酸，使丙酸终浓度为0.5%。将25 mL制备好的溶液倒入每个培养皿中。待琼脂凝固后，于4 °C保存培养基。

2. 包被载玻片

1. 用去污剂预处理载玻片。用自来水清洗载玻片3次，再用蒸馏水清洗1次。然后将载玻片置于45 °C烘箱中干燥2小时。
2. 将载玻片浸入约450 mL重铬酸钾硫酸溶液（含20 g重铬酸钾、40 mL蒸馏水和400 mL浓硫酸）中，浸泡24小时。用自来水清洗载玻片3次，再用蒸馏水清洗1次。
   1. 将载玻片置于45 °C烘箱中干燥2小时。然后浸入95%乙醇中至少2小时。
3. 将0.5 g硫酸铬钾和5 g明胶加入1 L蒸馏水中。使用前在60 °C水浴中溶解。铬明矾明胶溶液可在4 °C长期保存。
4. 在载玻片上滴加10 µL铬明矾明胶溶液，并将溶液均匀、完整地覆盖整个载玻片面。将载玻片胶面朝上放置于42 °C烘箱中，持续48小时。制备好的载玻片可于4 °C保存以备后续使用。
   ​注意：此为关键步骤，必须实现完全包被。对于果蝇及其....

结果

图示描述了用于克服高脂质和高几丁质卵壳粘附难题的实验方案 果蝇 胚胎（表1) 涂布于玻片表面，以供观察和实验。采用所示的铬矾明胶玻片涂布法进行处理。 图1，我们增强了附着性 果蝇 将胚胎置于载玻片表面，而胚胎预包埋方法如图所示 图2 可实现对蛋白质和RNA DmFKBP12/Calstabin在早期发育全部四个阶段中动态分布的高效检测即，合胞体囊胚，细胞囊胚，原肠胚早期和晚期的 果蝇 胚胎 图3 显示了抗体检测到的FKBP12/Calstabin在合胞体胚盘和细胞胚盘阶段的蛋白质分布。根据这些组织化学结果可以看出，FKBP12在合胞体胚盘阶段的表达极性较弱（图A至H），随后开始定位于滋养外胚层上皮下方的基底膜内，形成从前端到后端表达量递减的梯度分布（图I至S）。最终，DmFKBP12/Calstabin蛋白局限于原始胚胎组织的特定结构成分中，其细胞外分布较.......

讨论

RyRs 和 IP3Rs 介导的钙信号传导是脊椎动物和无脊椎动物多种生理与病理过程中的基本通路^1,2,3,4。在人类中，RyR2 基因的点突变（如与儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速相关的 R4496C 突变）会导致心肌细胞肌浆网中的钙泄漏，从而引发心脏功能障碍。这些突变表现为在体力活动期间出现心律失常，并具有较高的猝死风险，该表型可在携带此突变的基因工程小鼠模型中重现。在运动条件下，携带该钙泄漏突变的小鼠会出现心脏性猝死，而野生型对照小鼠则未表现出此现象^18,20,21,22。在心脏中过表达 RyRs 调节蛋白 FKBP12 与小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
-20°C 冰箱	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	用于试剂储存
-80°C 超低温冰箱	Thermo	Forma 90 系列	用于试剂储存
琼脂	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	葡萄汁琼脂平板的制备
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab 片段	Roche	11093274910	用于检测地高辛标记的化合物
生化培养箱	上海蓝帕仪器	LRH-250	原位杂交
波因氏溶液	国药集团北京化学试剂	69945460	果蝇胚胎包埋
离心机	Eppendorf	540BH07808	原位杂交
离心管	Denville	C-2170	果蝇胚胎收集
铬明矾	国药集团北京化学试剂	10001018	载玻片涂布
恒温水浴锅	金坛恒丰仪器	KW-1000DC	苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色
Dako REAL EnVision 检测系统	Dako	K5007	在免疫组织化学反应或原位杂交反应中，与一抗结合，并通过染色对目标进行标记
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	原位杂交
DIG RNA 标记试剂盒	Roche	11093274910	利用 SP6 和 T7 RNA 聚合酶通过体外转录，用地高辛-UTP 对 RNA 进行标记
Drosophila melanogaster	Bloomington 果蝇资源中心	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	Drosophila melanogaster突变品系
电热鼓风干燥箱	天津泰斯特仪器	101-0AB	用于载玻片涂布和石蜡包埋
伊红	Sigma-Aldrich	230251	苏木精-伊红染色
乙醇	国药集团北京化学试剂	100092680	石蜡包埋、苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色
明胶	国药集团北京化学试剂	10010328	载玻片涂布
氯金酸	Sigma-Aldrich	379948	高碘酸-银甲胺染色
苏木精	Sigma-Aldrich	H3136	苏木精-伊红染色
High Pure PCR 产物纯化试剂盒	Roche	11732668001	用于 PCR 产物的纯化
智能恒温恒湿箱	宁波江南仪器	HWS	用于果蝇饲养
LE 琼脂糖	HyAgarose	14190108029	预包埋
甲醇	国药集团北京化学试剂	10014108	果蝇胚胎收集
显微镜	ZEISS	Observer.A1	苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色
显微镜载玻片	MeVid 实验耗材制造	P105-2001	载玻片涂布
中性树胶	国药集团北京化学试剂	10004160	苏木精-伊红染色
正庚烷	国药集团北京化学试剂	40026768	果蝇胚胎收集
石蜡切片机	华海科学仪器	HH-2508III	原位杂交
石蜡	国药集团北京化学试剂	69019461	石蜡包埋
pH/mV 计	Sartorius	PB-10	用于测定溶液的 pH 值
硝酸银	国药集团北京化学试剂	10018461	高碘酸-银甲胺染色
超纯水仪	Thermo	AFXI-0501-P	原位杂交
二甲苯	国药集团北京化学试剂	10023418	石蜡包埋