本文详细描述了如何建立大鼠无肝期（肝脏缺血）动物模型，以促进肝移植后缺血-再灌注损伤的基础研究。
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本文内容
摘要
摘要
大鼠原位肝移植（OLT）是一种经过验证的动物模型，广泛用于术前、术中和术后研究，包括肝外器官的缺血-再灌注损伤（IRI）研究。该模型需要大量实验操作和设备支持。无肝期的持续时间与移植后发生IRI的时间密切相关。在本实验中，我们通过血流动力学变化诱导大鼠肝外器官损伤，并确定其最大耐受时间。不同器官出现最严重损伤的时间各不相同。该方法易于重复，也可用于研究肝移植后肝外器官的缺血-再灌注损伤。
引言
缺血-再灌注损伤（IRI）是肝移植术后常见的并发症。肝IRI是一种病理过程，涉及缺血介导的细胞损伤以及肝脏再灌注后的异常恶化。根据临床环境的不同，肝IRI及其引发的局部固有免疫反应可分为热IRI和冷IRI1。热IRI由实质细胞损伤诱发，通常继发于肝移植、休克和创伤2。冷IRI则是由内皮细胞及外周循环障碍引起的肝移植并发症3。临床报道显示，肝IRI与10%的早期器官衰竭相关，并可能增加急性与慢性排斥反应的发生率4,5。此外，肝IRI还可能诱发多器官功能障碍综合征或全身炎症反应综合征，具有较高的死亡率6。合并肝外器官受累的患者往往住院时间更长、医疗费用更高，且预后更差7。并发症的发生与发展密切相关于肝移植过程中无肝期的持续时间8。
大鼠原位肝移植（OLT）最早由美国教授Lee于1973年报道。该实验手术模拟了临床肝移植的步骤，采用缝合法对血管和胆总管（CBD）进行吻合。该方法操作难度大、耗时长，成功率较低9。1979年，Kamada等....
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方案
广西医科大学动物伦理委员会批准了本实验（编号：20190920）。所有实验动物均由广西医科大学实验动物中心提供。实验选用 SPF 级雄性 Sprague Dawley 大鼠（体重 200–250 g，10–12 周龄），饲养环境温度为 25 ± 2°C，相对湿度为 50 ± 10%。术前 24 小时停止喂食，但可自由饮水。
注意：一名操作者即可完成所有操作，无需显微外科基础或手术显微镜。
1. 操作
- 称重后，使用动物麻醉机以异氟烷（5%）对大鼠进行麻醉。
- 1–2 分钟后，用镊子轻轻夹住大鼠的脚趾。若大鼠在夹捏后无反应，则表明已进入麻醉状态。使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥，并使用动物加热灯维持大鼠体温在 37–38 °C。
- 腹部消毒（使用聚维酮碘溶液）后，将大鼠固定于动物解剖台上，用镊子和剪刀在剑突下方做一条长约 3 cm 的正中切口。
- 打开腹腔，使用牵开器暴露肝脏，并游离肝胃韧带。用棉签轻柔地将肝脏中叶翻起并向上翻转，以暴露肝门。辨认胆总管（CBD）、门静脉（PV）和肝动脉（HA）。
- 用棉签将小肠推向左下腹腔，以湿纱布覆盖，并将肝内下腔静脉移向右肾静脉。
- 使用显微镊和已标记 3-0 丝线的眼科镊，分别在右肾静脉上方分离出门静脉、肝动脉和下腔静脉，并各置一带有滑结的丝线。
- 切开左、....
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结果
大鼠对肝脏缺血的耐受性
在此动物模型中，手术期间血管结扎的位置如图1所示。将大鼠随机分为5组，分别进行15分钟（I15组）、30分钟（I30组）、45分钟（I45组）、60分钟（I60组）的缺血处理，并设假手术组（sham组），每组10只大鼠。术后观察各组大鼠14天的存活率。I15组、I30组和假手术组的大鼠全部存活；I45组中有8只存活至14天，I60组仅2只存活。这些结果表明，大鼠对无肝期的耐受时间最长为45分钟（表1）。
血管结扎对大鼠循环系统的影响
实验过程中，Biosystems 记录了大鼠在无肝期前后的心率和血压（经右侧颈内动脉插管）。我们发现，大鼠的心率和平均动脉压（MAP）在血管结扎后发生了显著变化（图 2）。
对肝外器官的影响
结扎后.......
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讨论
大鼠肝移植（OLT）是研究肝脏移植中的器官保存、缺血-再灌注损伤（IRI）、移植排斥反应、免疫耐受、移植病理学与药理学、同种移植以及异种移植的理想模型。目前，该模型已广泛应用于肝移植的实验研究中。
在初步研究中，我们首先采用腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，发现其导致术后死亡率较高，且对血流动力学变化的耐受性较短。因此，在后续实验中我们改用吸入麻醉，因其起效迅速且清除快速 体外 特征。改用吸入式麻醉显著延长了大鼠的耐受时间并提高了术后存活率。操作人员应注意观察大鼠的呼吸频率和心率，以防止麻醉过量。可使用生物信号监测系统监测心率和血压。我们还观察了手术缝线粗细对血管结扎效果的影响。虽然小于3-0的缝线能够有效结扎血管，但其松解困难，可能导致血管破裂；相反，大于3-0的缝线可能导致血管闭塞不完全，从而无法引起血流动力学变化。这些材料相关的问题将在后续实验中加以改进。本实验方案存在一些局限性：由于热灯存在过热风险，不建议用于维持体温；建议采用循环水毯等替代加热方式，以利于动物福利。
OLT 术后远端器官损伤的原因有很多。.......
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披露
本论文的作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢广西医科大学第二附属医院李文涛博士和吴继华博士提供的宝贵建议。作者感谢团队成员提出的有益评论和讨论。作者还感谢JoVE的匿名审稿人和编辑所给予的意见。特别感谢袁博士的父母一直以来的支持与鼓励。本研究得到宁波市自然科学基金（2014A610248）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛溶液 | 上海麦克林生化科技有限公司 | P804536 | |
| 空气干燥烘箱 | 上海冰林电子科技有限公司 | BPG | |
| 丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒 | 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司 | E-BC-K235-S | |
| 氨水 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10002118 | |
| 淀粉酶检测试剂盒 | 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司 | E-BC-K005-M | |
| 无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 100092183 | |
| 动物麻醉机 | 深圳市瑞沃德生命科技有限公司 | R640 | |
| 天冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒 | 雷度米特生命科学与分析技术有限公司 | S03040 | |
| 全自动生化分析仪 | 西门子股份公司 FWB:SIE, NYSE:SI 有限公司 | 2400 | |
| 生物信号采集系统（如需要） | 成都泰盟科技有限公司 | BL-420F | |
| 离心机 | 百洋医疗仪器有限公司 | BY-600A | |
| 盖玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 10212432C | |
| 肌酐检测试剂盒 | 雷度米特生命科学与分析技术有限公司 | S03076 | |
| 脱水机 | 匈牙利 3DHISTECH 公司 | Donatello Series 2 | |
| 包埋机 | 湖北孝感阔海医疗科技有限公司 | KH-BL1 | |
| 冷冻机 | 武汉俊杰电子有限公司 | JB-L5 | |
| 苏木精-伊红染色液 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | G1005 | |
| 高效石蜡 | 上海华永石蜡有限公司 | Q/YSQN40-91 | |
| 盐酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011018 | |
| 人工晶体（IOL）镊 | 广州广美医疗器械有限公司 | JTZRN | |
| 异氟烷 | 深圳市瑞沃德生命科技有限公司 | — | |
| 显微剪刀（如需要） | 上海手术器械厂 | WA1010 | |
| 持针器 | 上海手术器械厂 | J32010 | |
| 中性树胶 | 上海华申医用仪器设备有限公司 | — | |
| 普通光学显微镜 | 尼康仪器（上海）有限公司 | Nikon Eclipse CI | |
| 眼科镊（直型） | 上海手术器械厂 | J3CO30 | 直型 |
| 眼科镊（弯型） | 上海手术器械厂 | JD1060 | 弯型 |
| 眼科剪 | 上海手术器械厂 | J1E0 | |
| 病理切片机 | 上海徕卡仪器有限公司 | RM2016 | |
| 移液器 | 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司 | 7010101008 | |
| 拉钩 | 北京今诺泰科技发展有限公司 | JNT-KXQ | |
| 扫描仪 | 匈牙利 3DHISTECH 公司 | Pannoramic 250 | |
| 载玻片 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | G6004 | |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 1330-20-7 |
参考文献
- Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q.
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重印与许可
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