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环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

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DOI：

10.3791/61825

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2020年11月5日

 ,  ,  , 
1Columbia Environmental Research Center, U.S. Geological Survey

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

环境DNA检测在开始野外数据采集之前，必须经过严格的设计、测试、优化和验证。本文提供了一套实验方案，指导用户完成针对目标物种DNA的特异性探针法qPCR检测与定量分析的每一步设计流程。

摘要

目前，正在开发新的非侵入性方法以检测和监测物种的存在，从而辅助渔业和野生动物保护管理工作。利用环境DNA（eDNA）样本检测大型生物体是其中迅速普及并已被纳入国家管理计划的一类方法。本文重点介绍用于探针法定量PCR（qPCR）应用的物种特异性靶向检测方法的开发。相比仅使用引物的方法，探针法qPCR具有更高的特异性。此外，能够定量样本中DNA含量这一能力，有助于我们理解eDNA的生态学特征以及解读野外eDNA检测模式。在开发和测试此类检测方法时，必须审慎考虑，以确保从环境样本中检测目标物种时具备足够的灵敏度和特异性。本实验方案将详细说明设计和测试探针法检测方法所需的步骤，包括序列数据库的构建、检测方法的设计、筛选与优化、性能测试以及野外验证。遵循这些步骤有助于建立一种高效、灵敏且特异的检测方法，并可令人信服地加以应用。我们以针对美国克林奇河（Clinch River）分布的一种淡水蚌类——穆克特蚌（Actinonaias ligamentina）种群所设计的检测方法为例，展示该流程的具体实施过程。

引言

研究人员和管理者对环境DNA检测技术在物种检测中的应用日益关注。在过去三十年中，定量PCR或实时PCR（qPCR/rtPCR）已被广泛应用于多个领域，用于核酸序列的特异性检测与定量1,2。在相对较新的环境DNA研究领域，使用标准曲线对每单位体积或质量的环境DNA样本中目标DNA拷贝数进行定量，现已成为常规操作。环境DNA检测通常以线粒体DNA序列为靶标，因为线粒体基因组在每个细胞中存在数千个拷贝，但针对核DNA或RNA序列的检测也是可行的。必须认识到，已发表的环境DNA检测方法在性能上并不总是等同的。由于检测方法在设计、筛选、优化和验证过程中的差异，其仅检测目标物种DNA的能力（即特异性）以及对低浓度目标DNA的检出能力（即灵敏度）可能存在显著差异。以往对检测性能的定量评估指标报告普遍不足，但近年来，旨在提高检测方法开发透明度的标准正在逐步建立3,4,5,6,7,8。

优化并报告检测方法的性能有助于设计研究并解读环境DNA（eDNA）调查结果。如果检测方法与非目标物种的DNA发生交叉反应，可能导致假阳性结果；而灵敏度较差的检测方法即使在样本中存在目标物种DNA时也可能无法检出（假阴性）。了解检测方法的灵敏度和选择性，有助于确定检测稀有物种所需的采样力度。由于eDNA存在多种天然变异来源，研究必须尽可能控制可调控的变异来源，包括对eDNA检测方法进行全面优化和表征3。

直接影响检测特异性或灵敏度的条件会改变检测的性能。这种情况可能在不同的实验室条件下发生（例如，不同的试剂、操作人员、仪器等）。因此，在新的条件下应用检测方法时，应重新评估本方案。即使文献中已有充分表征的检测方法，在被新实验室采用或使用不同试剂（例如，预混液）时，也应进行测试和优化5,9。当检测应用于不同地理区域时，其特异性可能发生变化，因为此时检测对象来自新的生物群落，其中可能包含该检测方法未曾验证过的非靶标物种，同时靶标物种本身也可能存在遗传变异。因此，在新地点使用检测方法时，应重新进行评估。野外条件与实验室条件不同，因为在野外样本中更可能含有PCR抑制物。PCR抑制物会直接影响扩增反应，从而影响检测性能。因此，在开发环境DNA（eDNA）检测方法时，必须设置内参阳性对照。

最后，野外环境条件可能通过DNA降解、迁移和滞留等过程影响目标物种的DNA分子及其捕获。此外，不同的DNA采集和提取方案在效率以及DNA保留能力方面也存在差异。然而需要指出的是，这些过程影响的是eDNA的可检出性，而非分子检测方法本身的性能。因此，野外样本中目标物种DNA的可检出性，取决于qPCR检测技术的性能以及野外环境条件、采样、保存和提取方案的综合作用。当使用经过充分验证且性能优良的检测方法时，使用者可充分信赖该方法的检测能力，从而将研究重点转向影响eDNA检出的外部因素（即环境变量、捕获或提取方案的差异）。

本文重点通过严谨的设计与优化，探讨检测技术的性能表现。我们以一种基于探针的检测方法为例进行说明，该方法用于从美国克林奇河（Clinch River）采集的水样中检测一种淡水贻贝——穆克特贻贝（Actinonaias ligamentina）。近期，Thalinger 等人（2020）提出了靶向环境DNA（eDNA）检测方法的验证指南。按照本方案进行检测方法的设计，可使该检测达到 Thalinger 等人所定义的第4级验证水平，并进一步向第5级验证迈进一步6。至此，该检测方法的技术性能将得到优化，具备在实验室和野外应用中常规使用的条件。随后，通过在实验室、中型生态系统（mesocosm）及野外实验中的进一步应用，可进一步探究eDNA的检出情况及其可检测性的影响因素，从而完成第5级验证的最终步骤6。

方案

1. 建立目标物种与非目标物种线粒体DNA序列的序列数据库

  1. 明确所要解决的问题、目标及研究系统。确定用于环境DNA（eDNA）检测的目标物种。明确该检测方法将应用的地理区域。列出关注的物种清单，包括目标物种、在同一分类单元（通常为目或科级别）内共存的同域物种（sympatric species），以及亲缘关系相近但分布区域不同的异域物种（allopatric species），即可能不与目标物种处于同一地理区域的物种（图1）。
    注：本研究中针对的是 A. ligamentina 物种在Clinch河流域的种群。
  2. 从第1步所列物种中，检索并下载多个基因区域的序列。可使用NCBI（美国国家生物技术信息中心）、BOLD（生命条形码数据库）、EMBL（欧洲分子生物学实验室）和DDBJ（日本DNA数据库）等序列数据库。NCBI、EMBL和DDBJ共享序列信息。
    1. 利用NCBI核苷酸数据库，搜索目标生物（例如 Actinonaias ligamentina）及其目标基因区域（例如细胞色素c氧化酶I亚基（COI）或NADH脱氢酶1（ND1））；示例检索词：Actinonaias ligamentina AND ND1
    2. 随后，选择所有符合要求的序列，点击发送至（Send to），选择完整记录（Complete record）、文件（File），下载格式选择GenBank或FASTA，然后点击生成文件（Create File）。这些序列现已保存至计算机。
    3. 对第1步中列出的所有物种重复上述步骤。将每个基因区域的序列分别保存在独立文件中，以便后续独立分析。
      1. 下载第1步中确定的目标物种的所有相关序列（或尽可能多且具代表性的序列），如有可能，应包括其地理变异类型。
      2. 对第1步中确定的同属或同科的非目标相关物种和同域物种重复检索并下载序列（例如，若目标物种为黄鳍穴蚌（A. ligamentina），则应下载目标区域中所有其他属于蚌科（Unionidae）的淡水 mussel 物种的序列）。
      3. 对第1.1步中列出的亲缘关系相近但地理分布分离的异域物种重复检索并下载序列。
        注：并非所有物种（目标或非目标物种）都能在公共数据库中找到。可通过在本实验室扩增并测序经分类学确认的标本，以扩充本地参考数据库。若研究物种具有较高的种内遗传多样性，或研究区域地理范围较广且可能存在地理变异类型，则应收集覆盖其整个分布范围的序列。

2. 实验设计

  1. 使用可在多种基因序列编辑和生物信息学程序中找到的比对软件，分别对每个基因区域的序列进行比对。对各个不同的基因区域均执行此比对操作。
    1. 例如，使用 Geneious Prime 软件（https://www.geneious.com），将下载的序列文件导入程序中。
    2. 为每个基因区域创建独立的文件夹。
    3. 在包含某一基因区域序列的文件夹内，选中所有序列。
    4. 使用多重比对工具对所选序列进行核苷酸序列比对。比对方式可能有多种选项，采用Geneious或MUSCLE比对方法并使用默认参数通常效果良好。
  2. 通过可视化比对后的序列数据，选择适合引物探针设计的候选区域。一个理想的区域应具备以下特征：目标物种在该区域具有丰富的序列数据，不同物种间序列差异较大，且种内变异较小。这将提高所设计引物和探针区分目标物种与非目标物种的可能性，同时确保种内变异体仍能被有效扩增。
  3. 引物与探针的实验设计。
    1. 使用 qPCR 实验设计软件并遵循其操作说明。本研究中使用 IDT 的 PrimerQuest 工具（https://www.idtdna.com/）设计了 5 组 qPCR 实验。
    2. 将步骤 2.2 中选定的序列粘贴至“序列输入”框中。若比对结果中包含空格，请从序列中删除这些空格。
    3. 在选择您的设计选项中，选择qPCR 2 引物 + 探针。
    4. 下载推荐的实验方案。
    5. 复制第一组实验中正向引物的序列，并在步骤 2.1.4 创建的比对结果中搜索该引物序列。若使用 Geneious Prime，可使用注释与预测工具将引物区域添加至比对图中。对所有引物和探针组合均执行此操作（图 2）。
    6. 检查比对图中这些区域在目标物种内部以及共存物种内部的变异情况。
      1. 若存在种内遗传变异，应优先选择引物和探针不落在这些变异区域内的实验方案。
      2. 为防止非目标物种扩增，需查找与非目标物种之间的错配情况。优先选择与非目标物种错配数最多的实验方案进行后续验证。Currier 等（2018）建议选择至少两个区域（两个引物，或一个引物与探针）与所有非目标物种均存在至少两个错配的组合。但需注意，探针上的错配对特异性的贡献较小10。
        注：每个引物 3’端最后 3 个碱基内的差异比 5’端的差异更能提高特异性10。
    7. 在实验设计中需考虑以下关键参数。
      1. 确定引物和探针的熔解温度（Tm）与退火温度（Ta）。理想情况下，引物的熔解温度应在 60–64 °C 之间，且两引物之间的 Tm 相差不超过 2 °C；探针的 Tm 应比引物高 6–8 °C。qPCR 反应的退火温度应设置为比熔解温度低 5 °C，通常在 55–60 °C 左右11。
      2. 检查 GC 含量。 选择 GC 含量在 35–65% 之间的区域，避免含有 4 个或更多连续 G 碱基的区域。引物 3’端最后 5 个碱基中包含 1 至 2 个 G 或 C（即 GC 夹）可能有助于增强引物结合的稳定性，从而提高特异性12。
      3. 搜索发夹结构和二聚体结构。使用寡核苷酸分析程序（如 OligoAnalyzer -IDT13；OligoCalculator14）检测引物和探针是否可能形成预测的发夹结构或二聚体。这些结构可能导致非特异性扩增并降低扩增效率，应避免选择预测会形成此类结构的实验方案。
      4. 确定引物长度。引物长度应控制在 18–25 个碱基之间，探针长度应在 20–25 个碱基之间。过长的引物或探针可能导致扩增效率降低。
      5. 确定扩增子长度。扩增子长度应在约 100 至 250 个碱基对之间。该范围通常足够短以保证较高的 PCR 扩增效率，又足够长以便通过 Sanger 测序进行验证4,15。
      6. 设计 探针。确保探针 5’端不含 G 碱基，因其可能抑制绿色和黄色荧光染料的信号11。我们设计了双淬灭探针，使用 IDT 的 3IABkFQ 和 ZEN 淬灭基团，以及 FAM 或 HEX 荧光基团。
        注：关于 MGB 探针：TaqMan MGB（小沟结合）探针常用于环境 DNA（eDNA）研究。但由于这类探针非常短，即使存在 2 至 3 个碱基对的错配，也可能与非目标序列结合10。
      7. 确定探针的 Tm。探针的熔解温度应比引物高 6–8°C。温度过低会降低探针的结合成功率。
      8. 确定探针的长度和位置。探针长度应在 20 至 25 bp 之间，理想情况下应位于同一条链上靠近引物结合位点的位置，但不应与其重叠。

3. 检测筛选与优化

  1. 计算机模拟检测开发与验证。在订购引物-探针组合前，通过计算机模拟引物扩增来评估其特异性（潜在的非靶标扩增）。.
    1. 通过 NCBI 的 Primer-Blast 测试引物16 或类似程序，可在 NCBI nt/nr 数据库中识别可能在该检测中扩增的潜在非靶标。若使用 Primer-Blast，请将引物粘贴至 使用我自己的引物 引物参数框下的引物对特异性检查参数选项中，选择 nr 输入目标生物的分类阶元（例如“Unionida”或“Unionoida”）至数据库并选择相应类型 生物体 盒子
    2. 继续在比对的序列数据上通过目视评估引物/探针组合。
      1. 为了同时在计算机中评估引物和探针，构建一个文本序列，其组成为：正向引物、12个N、探针、12个N，以及反向引物的反向互补序列。如果探针序列距离其中一个引物在12个碱基对以内，则使用相应数量的N代表引物与探针之间的碱基对数目。
      2. 使用 NCBI 的核苷酸 Blast 搜索（Blastn）在 nr 数据库中进行比对17使用分类学标签查找错配数较少的非目标物种；这些物种应在实验优化期间于实验室中进行测试。
        注意：生物信息学分析有助于排除非特异性检测，但潜在的特异性检测仍需通过实验（体外）验证，因为并非所有物种的序列都存在于遗传数据库中，且即使软件预测为可能性较低，引物和探针仍可能与非靶标结合。
  2. 选择三到五个引物/探针组合在实验室中进行测试。
  3. 订购引物、探针和合成DNA标准品，以及用于扩增子测序的额外M13加尾引物。
    1. 从合成寡核苷酸的公司订购合成寡核苷酸引物和探针。探针需标记荧光染料和淬灭基团。对于需要多重检测的实验，应选择不同的荧光染料。 检查您的qPCR仪器，查看其可检测的荧光染料列表。
    2. 设计并订购带有M13尾的引物，用于通过Sanger测序验证qPCR检测结果：将M13正向（-20）序列GTA AAA CGA CGG CCA GT添加至正向引物的5’端，将M13反向（-27）序列CAG GAA ACA GCT ATG AC添加至反向引物的5’端。
    3. 合成DNA标准品含有已知浓度（拷贝数/µL）的目标序列（包括引物结合区）。根据该标准品已知浓度绘制的标准曲线，对未知样本进行定量。从引物和探针生产公司获取合成标准品，并遵循生产商提供的重悬和保存建议。使用含tRNA载体的TE缓冲液，采用低吸附塑料器皿稀释标准品，以减少水解及与器皿表面的结合。
      注意：如果标准曲线表现不佳（PCR 扩增效率低，参见步骤 3.4.2），可尝试将标准品重新悬浮于水或 Tris-HCl 中。
    4. 将引物和探针溶于无核酸酶水、Tris-HCl 或 TE 缓冲液中，配制成适合实验使用的适当浓度。通常在主反应体系中将工作母液稀释 20 倍，以达到优化的最终反应浓度。不使用时，将溶解的寡核苷酸储存于恒定的 -20 °C 条件下。
  4. 体外（实验室中）检测方法的优化与测试。淘汰效率低下、与共存物种发生交叉反应或灵敏度差的检测方法18在检测方法开发以及实际样本检测过程中，均应包含内参阳性对照（IPC）的使用。
    1. 首先，确定该检测方法的最佳反应温度以及引物/探针浓度。在完成对PCR扩增效率（步骤3.4.2）、交叉反应性（步骤3.4.3）和灵敏度（步骤3.4.4）的优化后，继续进行多重内源性对照（IPC）检测（步骤3.4.5）。
      1. 使用PCR温度梯度测试引物和探针的最佳退火温度（Ta），温度梯度中心设置在预测引物平均Tm值以下5°C。
      2. 检测引物和探针的最佳浓度。通常测试 200 nM、400 nM 和 800 nM 的引物浓度，以及 75 nM、125 nM 和 200 nM 的探针浓度。
    2. 创建标准曲线并确定扩增效率和线性范围。使用含有目标序列的合成DNA标准品，进行至少六个10倍梯度稀释，在约100 拷贝/反应至105 拷贝/反应（图3A).
      1. 使用qPCR软件将每个标准品的Cq值（定量循环阈值）绘制在y轴上，将初始标准品浓度（拷贝数/反应）的10为底对数绘制在x轴上。qPCR软件应自动进行线性回归分析。图3B).
      2. 根据回归曲线的斜率计算效率，E = -1 + 10(-1/斜率)例如，如果斜率为 -3.4，则 E = -1 + 10(0.29) = 0.97 或 97%。同时检查 r2 标准品重复孔的数值，用于指示其在曲线上的拟合程度。qPCR 软件也应自动计算该值（图3B）。效率值应达到100%（±10%）且 r2 ≥0.98 的值9,15,19,20,21,22.
      3. 目视检查标准曲线是否存在偏差，即回归曲线是否存在一致方向的偏离，或通过扩增效率和相关系数（r）评估标准曲线性能是否不佳。2 值（图3C 和 3D).
    3. 特异性：通过评估与非靶标物种的交叉反应性，以降低假阳性结果的可能性。当环境DNA检测结果可能导致高昂的管理决策时，应通过扩增子测序验证阳性结果。
      1. 非靶标检测：使用经分类学确认的近缘物种及地理分布重叠物种的基因组DNA提取物进行检测，优先测试与靶标物种亲缘关系较近且共存的物种。靶标与非靶标样本应采用相似的总DNA浓度，所选浓度应使靶标物种样本的扩增信号位于标准曲线线性范围的中段。仅在靶标物种中应观察到扩增信号。
      2. 若观察到非靶标扩增，则应对产物进行纯化并测序以确认其身份。在非靶标物种的组织样本中检测到靶标物种的污染并不罕见，因此此阶段的所有扩增产物均需通过测序验证。利用带有M13尾部的引物对特异性检测中获得的纯化扩增子重新进行扩增，并使用M13引物进行测序。
        1. 在PCR后实验室中，将用于测序的qPCR产物转移至新的离心管中。使用纯化试剂盒（如MinElute PCR Purification Kit）去除残留的引物和反应组分。
        2. 将洗脱液做1:100稀释，取每种稀释液1 µL，在50 µL PCR反应体系中，使用M13加尾引物和高保真聚合酶（如Phusion High-Fidelity DNA Polymerase），进行30个循环的扩增。
        3. 取10 µL每种反应产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测是否出现预期大小的单一条带。若未观察到条带，可增加循环次数或上样量。若出现多条条带，需对预期大小的条带进行凝胶纯化。
        4. 使用上述纯化试剂盒去除残留引物和反应组分，并测定洗脱液的DNA浓度。
        5. 根据测序机构的说明，使用 M13 引物设置测序反应。
          注意：切勿在qPCR实验室中打开扩增后的样品。应在专用于处理PCR后样品的实验室中准备测序样品。
    4. 灵敏度：灵敏度影响假阴性结果的概率，即在目标物种DNA存在时未能检测到。应评估每项检测的检测下限（LOD）和定量下限（LOQ）。最后，加入内参阳性对照（IPC）以评估样本对PCR的抑制作用。将该IPC检测与所设计的检测进行多重化联合测试，以确保两项检测之间互不干扰。
      1. 检测限（LOD）：对合成DNA标准品进行六次4倍系列稀释，每个标准品稀释浓度设置8-24个重复图4）。计算具有95%检出率的最低初始浓度。可使用LOD/LOQ计算器R脚本生成LOD和LOQ曲线图5.
        注意：低于检测下限（LOD）的数据不应被截断。由于PCR具有高度特异性，真阳性结果不存在检测下限。LOD是指预期可能出现假阴性结果的最高浓度。
      2. 定量限（LOQ）：从同一稀释系列中，计算可定量的最低初始DNA标准浓度，其变异系数（CV）需低于35%。
        注意：检测限（LOD）和定量限（LOQ）应以每反应拷贝数（copies/reaction）表示。当使用经过验证的检测方法时，若野外样品的扩增信号低于LOQ，则结果应报告为检出率百分比（% detections），而非环境DNA浓度，因为此时无法可靠地测定其确切浓度。5.
    5. 使用内参阳性对照（IPC）检测 PCR 抑制作用。抑制 可能导致敏感性降低和假阴性结果。 测试IPC检测法与目标检测法联合使用的多重检测能力。
      1. 一种内参对照（IPC）检测可通过使用与目标检测不同报告荧光染料的探针，与目标检测进行多重检测。该IPC检测包含一段来自与目标分类群无关物种的短合成DNA序列，以约10的低浓度加入qPCR预混液中2 每反应拷贝数，以及检测它的引物和探针。此较低浓度是必要的，以避免与目标序列竞争聚合酶和核苷酸23.
      2. 将样本中IPC模板的Cq值与无模板对照（NTC）中IPC模板的Cq值进行比较。在此无模板对照中，唯一的DNA输入为IPC模板。该反应中的IPC模板应按预期扩增。若样本中IPC模板的扩增循环数与NTC中IPC模板相差2个或以上循环，则表明该eDNA样本存在抑制。对于显示存在抑制的样本，可进行1:10稀释后重新检测。若样本仍存在抑制，则应将其排除在分析之外。
  5. 原位检测方法的开发与验证
    1. 在实验室中：若可在实验室获取该生物体及其同域分布的物种，则从饲养这些物种的围栏中采集水样， 处理样本，并利用这些环境DNA样本进行检测。使用M13加尾引物扩增目标片段后，按上述方法对产物进行测序，以验证目标片段的扩增。
    2. 在实地工作中：
      1. 确定目标生物已知存在和已知不存在的位点。在目标物种存在的每个位点，最好能有其丰度的量化数据。
      2. 确定将使用的样品体积和样品采集方法（例如，过滤、离心等）。
      3. 在每个采样点设置一个现场空白对照或阴性对照，即带至野外采样现场的洁净水，使用与环境DNA采样相同的野外设备和操作流程进行采集和处理24现场空白样旨在检测采样设备及现场携带装备可能引入的污染。应在处理现场水样之前采集现场空白样。
      4. 每个采样点采集多个水样，最好每个采样点采集3个样本。
      5. 回到实验室后，处理并提取样品。
      6. 使用类似以下的孔板设置进行检测 图5A 并比较eDNA浓度和检出频率与已知位点在发生率和丰度上的差异。通过测序确认所有检出结果。24,25.
        注意：上述步骤将通过 Thalinger 等人（2020）量表的第 4 级对检测方法进行验证6 （优化检测技术性能）并开始收集支持5级检测验证的数据。5级验证包含概率建模以及将该检测方法应用于环境DNA生态学研究。我们认为这已超出基础检测开发的范畴，但我们鼓励将经过实验室和野外验证的检测方法用于此类应用，以改进检测设计和数据解读。

结果

在设计针对细褶蚌（mucket）的物种特异性qPCR检测方法时A. ligamentina），下载了克林奇河中所有蚌科（Unionidae）物种的可用序列。密切相关的物种，例如 Lampsilis siliquoidea 尽管这些物种并未在同一条河流中发现，但仍被纳入参考数据库。由于目标河流系统中的并非所有物种都能在GenBank中找到，因此额外对部分物种进行了内部测序。使用Geneious软件对序列进行比对，并利用Primer Quest（IDT）软件设计多个检测方法。在比对结果中加入了五组引物和探针，以便进行可视化评估图2随后使用Primer-Blast进行计算机模拟测试，之后订购引物用于体外进一步验证。. 在实验室中，使用27种可获得物种的DNA提取物对所有检测方法进行了特异性验证。其中一种检测方法（A.lig.1）仅成功扩增了目标物种表1; 表2）。该检测方法被推进至进一步测试其检测效率、检出限（LOD）和定量限（LOQ）。其扩增片段长度为121个碱基对。 表3 显示所使用的序列 A. ligamentina 合成DNA标准品 图3A 和 图3B 展示一次成功检测的结果，具有良好的效率和r2 值。 图3C 和 图 3D 显示一个标准曲线效率较差的检测，该检测已被弃用。根据 Klymus 等人所述的离散法，所选检测（A.lig.1）的检出限（LOD）和定量限（LOQ）均为 5.00 拷贝/反应。5. 与检测同时进行多重扩增的IPC（内参）表3-6）未影响 A. ligamentina 检测的标准曲线。我们使用的内参对照（IPC）是小鼠HemT转录本的一段片段。该检测由IDT预先设计用于其他应用，但我们对其进行了修改，使其成为本实验室环境DNA（eDNA）应用的内参对照。

一次成功的qPCR实验应在各项性能指标上均达到特定标准（即标准曲线扩增、基因组DNA阳性对照、无模板对照以及内参阳性对照）。目标检测的标准品应呈现指数扩增曲线，若循环次数足够，这些曲线应达到平台期。这表明反应过程中荧光探针已被完全消耗，荧光信号水平达到最大极限。扩增较晚的标准品可能在40个循环内无法达到平台期。阳性对照（基因组DNA和IPC）应呈现相同的扩增模式。待测样本可能扩增也可能不扩增，但若发生扩增，其扩增曲线也应呈指数增长并出现终点平台期（图5）。

在高质量的qPCR中，标准品稀释系列的扩增Cq值应均匀分布，浓度每稀释10倍，Cq值相差约3.3个循环。每个标准品稀释浓度的重复样本应高度聚集，Cq值几乎相同（由r表示）2 值）。所有标准品稀释液均应出现扩增（图 3A）。在较差的 qPCR 实验中，标准品可能呈现非指数型扩增曲线、不同稀释度之间的 Cq 值变异不均、无法达到平台期，或某些稀释度完全不发生扩增（图3D).

标准曲线的重要参数包括扩增效率、r2、斜率和y轴截距。扩增效率应在90%–110%之间，理想值接近100%；r2值应高于0.98，理想结果接近1.015,22。斜率值应在-3.2至-3.5之间，理想结果接近-3.322。y轴截距对应的Cq值应在34–41之间，理想结果为Cq 37.0。y轴截距表示含有1个拷贝目标序列的反应所预测的Cq值，这是单次qPCR可检测的最小单位。未知样本的Cq值若高于y轴截距，可能表明存在扩增抑制。在存在抑制或引物效率较低的情况下，可能需要运行超过40个PCR循环才能检测到目标序列，但此时无法进行定量分析；应同时运行额外的阴性对照（不含目标序列但含有与未知样本相似总量的DNA），以排除非特异性扩增的可能。

内参（IPC）扩增在 未知样本应与阴性模板对照IPC的结果进行比较，因为此时不存在试剂竞争且无抑制物存在。若未知样本的IPC扩增曲线Cq值比NTC的平均Cq值大2个循环或以上，或未发生扩增，则应视为存在抑制作用。若样本中无抑制物存在，则所有IPC扩增在图中应呈现紧密聚集，且Cq值与NTC相近图6).

最后进行了现场检测。2019年9月25日至26日，从已知存在A. ligamentina的蚌类栖息地500米范围内采集了20份来自克林奇河的水样以及3份野外空白样品进行过滤。每个采样点大约过滤4份1 L水样。采样地点包括河流中蚌床底部、近岸处蚌床底部、蚌床下游100 m处的河床、蚌床下游500 m处的河床以及蚌床下游500 m处的近岸区域（图7）。回到实验室后，将每张滤膜切成两半，仅从其中一半提取DNA。每个样品剩余的滤膜半片保存于-80 °C冰箱中。随后使用A.lig.1检测法与内参质控（IPC）进行多重扩增。在23份样品中，有5份出现抑制现象。这些样品按1:10稀释后重新检测。20份野外样品中有19份在设计的检测体系中实现了扩增。在这19份样品中，有5份的扩增拷贝数高于该检测方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），即5拷贝/反应；这意味着大多数样品中均检测到了环境DNA（eDNA），但浓度较低，可能导致假阴性结果，且该检测方法无法对这14份样品的拷贝数进行可靠定量。尽管如此，在每个采样点的四个生物学位点重复样品中，75%至100%实现了扩增。三个野外空白样品中有两个为阴性，而另一个出现了扩增信号，这凸显了野外操作过程中保持清洁技术的重要性。

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图1：线粒体DNA序列数据库构建的工作流程。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：Clinch河蚌类物种的序列比对结果，显示用于 Actinonaias ligamentina ND1检测的候选引物和探针。 正向引物为深绿色，探针为红色，反向引物为浅绿色。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：标准曲线与线性回归示例。 A. 由六个标准品稀释浓度中每个浓度三个重复的扩增结果所获得的可接受标准曲线示例。标准品为10倍系列稀释，浓度最高者位于左侧，依次递减 浓度向右移动。水平方向 穿过所有扩增曲线的直线代表定量循环阈值（Cq）。每条曲线与该阈值相交的点即为Cq值的确定位置。 B由图3A的标准品重复孔绘制的线性回归曲线。标准品稀释液的重复孔以圆圈表示，未知样本（样品）以x表示。扩增效率为98.9%，r2 接近 1.0，斜率为 -3.349。 C. 由六个样本各三个复孔的扩增结果生成的不合格标准曲线示例 标准稀释液 D. 示例3C中标准品重复扩增所绘制的标准曲线的线性回归。注意其较低的扩增效率和r2 数值。还需注意，6个标准品中仅有4个发生扩增。若重复运行后标准曲线仍未改善，则问题可能源于引物/探针组合不佳，未能按预期扩增目标DNA，此时不应采用该检测方法。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图4：检测限（LOD）和定量限（LOQ）标准qPCR实验中微孔板设置示例。 标准曲线中使用标准品以蓝色表示，标准品浓度由深蓝至浅蓝递减。DNA阳性对照以绿色表示，无模板对照（NTC）以黄色表示。实验用标准品浓度以灰色表示，每个标准稀释度包含24个重复。稀释系列分布在两块 微孔板（A、B）上，每块板均包含一条标准曲线、一个阳性对照和一个NTC。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：qPCR实验的孔板设置及扩增曲线 A. 板孔设置，标准品以蓝色表示，颜色越深表示标准品浓度越高。DNA阳性对照以绿色表示，无 黄色为模板对照（NTC），灰色为样本目标。 B. qPCR 扩增曲线图。标准品以蓝色表示，DNA 阳性对照以绿色表示，无模板对照在 黄色为模板对照，红色为未知样本。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图6：内参阳性对照（IPC）的扩增曲线。 所有未知样本的IPC扩增曲线以洋红色显示，无模板对照（NTC）中的IPC以橙色带三角形标记显示。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：显示位于弗吉尼亚州与田纳西州边界沿线的克林奇河一处贻贝床环境DNA采样点的地图。 样品采集点位于贻贝床底部的华伦斯弯（Wallens Bend），以及贻贝床下游100米和500米处。采样点位置均在河道中央（河道内）或距岸边约1–2米处（岸边）。请点击此处查看该图的放大版本。

组分名称序列 5’ – 3’荧光标记
正向引物A.lig.1-fCCCTCATCACGTACCTCTTAATC
反向引物A.lig.1-rGGAATGCCCATAATTCCAACTTTA
探针A.lig.1 probeTTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGTFAM

表1：设计的Actinonaias ligamentina qPCR检测（A.lig.1），包含正向引物、反向引物和探针的序列。

物种已扩增在克林奇河中
1. Actinonaias ligamentina是是
2. Actinonaias pectorosa否是
3. Amblema plicata否是
4. Corbicula spp.否是
5. Cumberlandia monodonta否是
6. Cyclonaias tuberculata否是
7. Cyprogenia stegaria否是
8. Elliptio dilatata否是
9. Epioblasma brevidens否是
10. Epioblasma capsaeformis否是
11. Epioblasma florentina aureola否是
12. Epioblasma triquetra否是
13. Fusconaia cor否是
14. Fusconaia subrotunda否是
15. Lampsilis ovata否是
16. Lampsilis siliquoidea否否
17. Lasmigona costata否是
18. Lemiox rimosus否是
19. Lexingtonia dolabelloides否是
20. Medionidus conradicus否是
21. Plethobasus cyphyus否是
22. Pleurobema plenum否是
23. Ptychobranchus fasciolaris否是
24. Ptychobranchus subtentus否是
25. Quadrula pustulosa否是
26. Strophitus undulatus否是
27. Villosa iris否是

表2：用于A.lig.1检测方法体外特异性测试的物种列表。 该检测方法可扩增目标物种（Actinonaias ligamentina）的基因组DNA，但未扩增任何非目标物种的DNA。

组分序列 5’-3’
Actinonaias ligementina 标准品CCCTCATCACGTACCTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA
AAGCCCTCGGGTACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC
CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT
CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT
GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT
TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA
AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA
TAAC
内参模板 (Hem-T)CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT
GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC

表3：本实验所用的Actinonaias ligamentina标准品及内源性对照模板（Hem-T）的序列（5’-3’）。 正向和反向引物的序列以粗体和斜体标出，探针序列则加下划线。

组分名称序列 5’ – 3’荧光标记
正向引物HemT-FTCTGAGTGTCCCTCGAATCT
反向引物HemT-RGCAGTCCTTGAGAACATAGAGC
探针HemT-PTGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGCy5

表4：内参阳性对照（IPC）检测，包含正向引物、反向引物和探针的序列。

每样本体积（µL）组分
10Environmental Master Mix
120uM A. lig.1 F/R mix
12.5uM A. lig.1 probe
15uM IPC 引物混合物（HemT-F/R）
0.752.5uM IPC 探针（HemT-P）
1.5IPC 模板的 1 × 103 浓度
2.75H2O
2样本
20总体积

表5：用于A.lig.1检测与IPC检测多重扩增的PCR反应体系。

步骤温度 (°C )时间
1初始变性9510 min
2变性9515 sec
3退火601 min
4返回步骤 2，重复 39 次

表6：A.lig.1 检测的反应条件。

讨论

与任何研究一样，明确需要解决的科学问题是第一步，而环境DNA（eDNA）检测方法的设计取决于研究的范围26。例如，如果研究或调查的目标是检测一种或少数几种物种，则应优先选择基于特异性探针的靶向检测方法；然而，如果目标是评估更大范围的物种组合或群落结构，则高通量测序宏条形码检测方法更为合适。在确定采用何种策略后，建议开展预实验，包括检测方法的设计、测试与优化24。检测方法的设计始于物种列表的建立，如图1所述。该列表是评估检测方法在特异性以及适用地理范围方面性能的基础6,10。建议针对特定地理区域设计检测方法，这有助于设计者更好地测试该方法在该区域内与其他物种发生交叉反应的可能性，同时明确将该方法推广至其他存在目标物种的区域时可能面临的局限性24。列表完成后，可从公共遗传数据库中下载相应序列。由于这些数据库并不完整27，应尽可能在实验室内部对列表中的物种进行测序，以完善用于检测方法设计的本地参考序列数据库。应优先考虑与目标物种共存且亲缘关系较近的物种，因为这些物种最有可能作为非靶标被扩增。重点关注与目标物种同属或同科的所有物种是一个良好的起点。与近缘物种的序列比对有助于识别目标物种特有的序列区域，从而帮助判断该检测方法在其他生态系统或地理位置中的潜在表现。线粒体基因区域通常是检测方法开发的首选，原因在于“生命条形码”项目已积累了大量不同物种的线粒体基因序列信息，且线粒体DNA在细胞中的拷贝数远高于核DNA24,28,29。由于不同分类群在遗传数据库中的序列覆盖度存在差异，应评估多个基因区域以推进后续的检测方法开发。在构建完成本地参考序列数据库后，需结合手动比对可视化分析和计算机软件程序共同设计引物/探针检测体系。不应完全依赖软件来决定测试哪些检测方案。重要的是要通过比对图谱直观验证引物和探针在靶标与非靶标序列上的结合位置，以更准确地预测其在PCR反应中的行为。最终的检测方法筛选与优化包括三个层次：计算机模拟（in silico）、体外实验（in vitro）和实地验证（in situ）6,7,24,25。计算机模拟设计与测试对于筛选出成功率较高的候选检测方法至关重要，但经验性的体外实验测试对于最终选择实际性能最优的检测方法不可或缺。体外优化与测试包括评估反应效率，并确定检测方法的灵敏度与特异性。检测限（LOD）和定量限（LOQ）是检测方法开发中常被忽视但对数据解读至关重要的两个参数。通过为检测方法运行多重复的标准曲线，可轻松测定LOD和LOQ1,5,30。尽管少数研究在结果分析中考虑了检测方法的LOD或LOQ，Sengupta等人（2019）将其检测方法的LOD和LOQ整合进数据解读与图表展示中，从而更清晰地呈现了研究结果31。此外，应在设计的检测体系中加入多重内参阳性对照（IPC）。若未检测样本中的PCR抑制效应，可能导致假阴性结果24,32。我们建议将多重IPC检测与目标检测联合使用，作为最简便的PCR抑制检测方法23。最后，必须利用野外和实验室采集的样本对检测方法进行实地（in situ）验证，以确保目标片段能够在环境样本中成功扩增24。

在环境DNA（eDNA）样本中使用物种特异性的探针法qPCR检测存在一定的局限性。例如，由于序列数据的可获得性有限，可能难以设计多个用于测试的检测方法，因而不得不在检测性能的某些方面做出妥协。这些选择必须依据研究目标来确定，并应在结果报告中予以说明26。例如，如果研究目标是检测稀有物种且预期阳性样本较少，则即使检测方法的特异性不完美（即可能扩增非目标物种），只要所有检测结果都将通过测序验证，该方法仍可使用。如果目标是监测某物种的地理分布范围，且无需eDNA浓度数据，则可使用扩增效率不理想的检测方法，结果仅以检出率百分比形式报告。此外，除非在实验室中对所有可能的同属物种进行测试（这种情况很少可行），否则无法绝对确定某一检测方法的真实特异性。例如，本检测方法是在克林奇河（Clinch River）的多种淡水蚌类物种基础上设计并验证的。若要在其他河流系统中使用该检测方法，则需在新地点对该区域的一系列物种进行测试。在检测方法开发过程中未测试的物种或种群内部的遗传变异也可能影响其特异性。最后，即使某一检测方法已被证实具有良好的技术性能，但在野外工作时条件会发生变化。与检测方法本身无关的因素，如水流、pH值和动物行为，以及不同的eDNA采集和提取方案，均可能影响eDNA的可检出性。使用经过优化且描述详尽的检测方法，将有助于明确这些 参数对 eDNA检测 的影响。

环境DNA（eDNA）领域正从探索性分析阶段逐步走向方法与技术的日益标准化。这些进展将增进我们对eDNA技术、能力及其局限性的理解。我们上述所概述的优化流程可提高检测方法的灵敏度、特异性和可重复性。对eDNA方法进行完善和标准化的最终目标，是提升研究人员基于eDNA数据做出推断的能力，同时增强最终用户和相关利益方对结果的信心。

披露

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定是否发表研究成果等方面均未发挥作用。

致谢

感谢 Alvi Wadud 和 Trudi Frost 在引物开发与测试中提供的帮助。本研究中检测方法设计的资金由美国国防部战略环境研究与发展计划（RC19-1156）提供。所提及的任何贸易、产品或公司名称仅用于描述性目的，不表示美国政府的认可。本研究产生的数据可在美国地质调查局数据发布平台获取：https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带盖可逆96孔板架Globe Scientific456355AST
洁净手套（例如乳胶、丁腈等）Kimberly-Clark43431, 55090
CFX96 Touch 实时荧光定量PCR检测系统Bio-Rad1855196
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mLFisher Scientific5408129
Fisherbrand 优质微量离心管：2.0 mLFisher Scientific2681332
硬壳96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，白色/透明Bio-Rad#HSP9601
IPC 正向与反向引物Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品
IPC PrimeTime qPCR 探针Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品
IPC Ultramer DNA 寡核苷酸合成模板Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品
Labnet MPS 1000 紧凑型PCR板迷你离心机LabnetC1000
微量离心机Various-任何可容纳1.5 mL和2.0 mL离心管的微量离心机通常均可使用。
Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘性，光学透明Bio-RadMSB1001
无核酸酶水（非DEPC处理）InvitrogenAM9932
移液器吸头 GP LTS 1000 µL F 768A/8Rainin30389272
移液器吸头 GP LTS 20 µL F 960A/10Rainin30389274
移液器吸头 GP LTS 200 µL F 960A/10Rainin30389276
移液器RaininVarious根据实验室偏好，可使用手动或电子移液器，最大量程可不同。
TaqMan 环境反应主混合液 2.0Thermo Fisher Scientific4396838
目标基因正向与反向引物Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品
目标基因 PrimeTime qPCR 探针Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品
目标基因合成gBlock片段Integrated DNA Technologies, Inc.none定制产品，用于qPCR标准品稀释系列
TE缓冲液InvitrogenAM9849
VORTEX-GENIE 2 涡旋混合器Fisher Scientific50728002

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环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证
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