方法文章

PCR定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶 PCR定点突变, 克隆, 表达, 快速蛋白质纯化, 色氨酸合酶, 蛋白质结晶, 重组蛋白, 层析纯化, 酶学分析, 结构生物学

DOI：

10.3791/61839

⸱

2020年9月26日

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1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

本文内容

摘要

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本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化Salmonella typhimurium色氨酸合酶复合物，并提供了一种可在一天内快速纯化该蛋白复合物的实验方案。所涵盖的方法包括定点诱变、在Escherichia coli中进行蛋白表达、亲和层析、凝胶过滤层析以及结晶。

摘要

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色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α2β2 TS）来自 鼠伤寒沙门氏菌 已开展多项研究，以深入理解PLP依赖性酶的催化机制、变构行为以及底物向产物转化的酶促反应细节。在本研究中，建立了一种新型表达系统，用于分别制备独立的α亚基和独立的 β亚基 实现了大量高纯度亚基和α的纯化2β2 St在2天内从分离的亚基中重组TS复合物。纯化过程采用亲和层析，随后切除亲和标签，硫酸铵沉淀以及尺寸排阻色谱（SEC）。为了更深入理解酶β位点关键残基的作用，在前期结构研究中进行了定点突变。另设计了一种方案用于纯化野生型及突变型α2β2 StTS复合物。利用硫酸铵分级沉淀结合SEC的一种简单、快速且高效的方案实现了α的纯化2β2 StTS复合物可在一天内完成。本文所述的两种纯化方案与先前使用PEG 8000和亚精胺结晶α复合物的方法相比，具有显著优势。2β2 StTS复合物在纯化流程中的变化。野生型及某些突变体形式在略有不同的条件下发生结晶，使用PEG 8000和亚精胺时会干扰部分突变体的纯化。为获得适用于X射线晶体学研究的晶体，已进行多项尝试以优化结晶条件、晶体质量和冷冻保护效果。. 本文所述方法应普遍适用于色氨酸合酶亚基以及野生型和突变型α亚基的纯化2β2 StTS复合物。

引言

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色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α2β2）是一种别构酶，在细菌、植物和真菌中催化氨基酸L-色氨酸生物合成的最后两个步骤1,2,3。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，St）可引起人类及其他动物严重的胃肠道感染。由于人类和高等动物体内不存在TS（EC 4.2.1.20），抑制S. typhimurium的α2β2 TS复合物（α2β2 StTS）已被探索作为治疗隐孢子虫病和结核病4、生殖器与眼部感染5的潜在药物靶点，以及在农业中作为潜在除草剂的应用6。α亚基催化吲哚-3-甘油磷酸（IGP）发生醛醇裂解反应，生成甘油醛-3-磷酸（GAP）和吲哚，该过程通过形成吲哚烯互变异构中间体，随后发生碳-碳键断裂，生成GAP和吲哚3,6

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方案

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1. 快速纯化α和β亚基以及重组α2β2 StTS复合物的实验方案

  1. 将DNA亚克隆至pETSUMO表达载体
    1. 获取编码色氨酸合成酶A亚基和B亚基的翻译偶联基因（trpA和trpB） α- 和 β细菌色氨酸合酶的亚基 肠道沙门氏菌 血清型 鼠伤寒沙门氏菌 克隆至pEBA-10表达载体中22使用 pEBA-10 载体作为 DNA 模板。
      注意：或者，也可使用下表所列引物扩增这两个基因 沙门氏菌肠炎亚种 血清型 typhimurium 基因组。所有分子生物学步骤均按照《分子克隆：实验室手册》中的描述进行。23.
    2. 使用聚合酶链式反应（PCR）分别扩增全长多核苷酸序列 α-亚基（αStTS）与引物 αStTS-FW-Bam 和 αStTS-Rev-Eco 和全长序列 β亚基（βStTS）与引物 βStTS-FW-Bam 和 βStTS-Rev-Hind。使用约 55 °C 的退火温度和 2 分钟的聚合酶....

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结果

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纯化 α- 和 β色氨酸合酶的亚基
该 α-亚基（αStTS）和β亚基（βStTS）的 鼠伤寒沙门氏菌 色氨酸合酶被亚克隆至修饰后的pET SUMO载体中。 图1A 显示两条强条带的代表性SDS-PAGE结果，对应于His6-SUMO-αStTS（泳道 αON）和 His6-SUMO-βStTS（βON泳道）融合蛋白。本研究所描述的纯化方案可在2天内分别纯化得到两个亚基。第一天用于通过Ni-NTA亲和层析、硫酸铵沉淀、His-SUMO标签切割、去除残留的His-SUMO标签以及蛋白浓缩等步骤对每种蛋白进行单独纯化。 图1B 和 1C 展示具有代表性的SDS-PAGE结果.......

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讨论

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我们已成功构建了用于结构与功能相关性研究的突变体 α2β2 βQ114A、α2β2 βK167T 和 α2β2 βS377A StTS 复合物。最初，我们尝试使用先前的纯化方案22来纯化这些突变体，该方案要求在纯化过程中使用 PEG 8000 和亚精胺诱导 α2β2 StTS 复合物结晶。尽管结晶速率取决于突变体类型及溶液中复合物的浓度，但在大体积溶液中难以预测晶体出现的时间。结晶可能在较长时间（48–96 小时）后发生，或在结晶启动后需额外添加 PEG 8000 才能实现15。

遗憾的是，本研究中呈现的 α2β2 StTS 复合物突变体形式无法通过该方案成功纯化，因为在方案初始步骤中未能形成晶体，从而阻碍了晶体学研究.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露，并声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本工作由美国国立卫生研究院（GM097569）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 10 kDa 滤膜MilliporeSigmaUFC901024离心过滤装置
15 mL 100 kDa 滤膜MilliporeSigmaUFC910024离心过滤装置
2 mL 冻存管CorningCLS430489冻存管
2 mL 微量离心管Fisher Scientific05-408-141微量离心管
24 孔 Cryschem 板Hampton ResearchHR3-15824 孔坐滴结晶板
2-巯基乙醇Fisher ScientificO3446I-100化学试剂
50 mL 离心锥形管Thermo Scientific12-565-270离心锥形管
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH 计
琼脂糖Fisher ScientificBP1356-100琼脂糖凝胶
硫酸铵Fisher ScientificA702-500化学试剂
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-5抗生素
细菌培养箱Fisher ScientificS35836培养箱
BamHINew England BiolabsR0136S限制性内切酶
双(2-羟乙基)氨基乙酸（bicine）Fisher ScientificBP2646100化学试剂
Branson 450 数字超声破碎仪BrasonB450细胞破碎仪
氯化铯Fisher ScientificBP210-100化学试剂
氢氧化铯Acros OrganicsAC213601000化学试剂
氯霉素Fisher ScientificBP904-100抗生素
二甲基亚砜Fisher ScientificD1391化学试剂
二硫苏糖醇Fisher ScientificBP172-5化学试剂
DNA 聚合酶Thermo ScientificF530S高保真聚合酶
dNTP 混合物Invitrogen10-297-018dNTP 混合液
EcoRINew England BiolabsR0101S限制性内切酶
乙二胺四乙酸Fisher ScientificS311-100化学试剂
Excella E25R 轨道摇床Eppendorf New BrunswickM1353-0004轨道式培养摇床
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004快速蛋白液相色谱系统
凝胶回收试剂盒InvitrogenK210012DNA 纯化试剂盒
甘油Fisher ScientificG33-500化学试剂
HindIIINew England BiolabsR0104S限制性内切酶
His-Trap 柱GE HealthcareGE17-5255-015 mL HisTrap 柱
咪唑Fisher ScientificO3196-500化学试剂
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Thermo Fisher ScientificR0392诱导剂
卡那霉素Fisher ScientificBP906-5抗生素
Kelvinator Series-100Kelvinatordiscontinued超低温冰箱
LB 液体培养基Fisher ScientificBP1426-500液体培养基
LB 琼脂培养基Fisher ScientificBP1425-2固体培养基
NaClFisher ScientificS271-500化学试剂
NcoINew England BiolabsR0193S限制性内切酶
Ni-NTA 亲和珠Thermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA 琼脂糖珠
聚乙二醇 8000Fisher ScientificBP233-100化学试剂
苯甲基磺酰氟Fisher Scientific44-865-0化学试剂
磷酸吡哆醛Acros OrganicsAC228170010化学试剂
S-200 HRCytiva45-000-196凝胶过滤柱
SacINew England BiolabsR0156S限制性内切酶
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100化学试剂
Sorvall RC-5B 离心机Sorvall8327-30-1004落地式离心机
亚精胺Acros OrganicsAC132750010化学试剂
Superdex 200 制备级Cytiva45-002-491凝胶过滤柱
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202SDNA 连接酶
TrisFisher ScientificBP152-500化学试剂
Ubl 特异性蛋白酶 1Thermo Scientific12588018SUMO 蛋白酶

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (1....

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重印与许可

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8000 SDS PAGE

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