PCR定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶 PCR定点突变, 克隆, 表达, 快速蛋白质纯化, 色氨酸合酶, 蛋白质结晶, 重组蛋白, 层析纯化, 酶学分析, 结构生物学

摘要

本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化Salmonella typhimurium色氨酸合酶复合物，并提供了一种可在一天内快速纯化该蛋白复合物的实验方案。所涵盖的方法包括定点诱变、在Escherichia coli中进行蛋白表达、亲和层析、凝胶过滤层析以及结晶。

摘要

色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α₂β₂ TS）来自 鼠伤寒沙门氏菌 已开展多项研究，以深入理解PLP依赖性酶的催化机制、变构行为以及底物向产物转化的酶促反应细节。在本研究中，建立了一种新型表达系统，用于分别制备独立的α亚基和独立的 β亚基 实现了大量高纯度亚基和α的纯化₂β₂ St在2天内从分离的亚基中重组TS复合物。纯化过程采用亲和层析，随后切除亲和标签，硫酸铵沉淀以及尺寸排阻色谱（SEC）。为了更深入理解酶β位点关键残基的作用，在前期结构研究中进行了定点突变。另设计了一种方案用于纯化野生型及突变型α₂β₂ StTS复合物。利用硫酸铵分级沉淀结合SEC的一种简单、快速且高效的方案实现了α的纯化₂β₂ StTS复合物可在一天内完成。本文所述的两种纯化方案与先前使用PEG 8000和亚精胺结晶α复合物的方法相比，具有显著优势。₂β₂ StTS复合物在纯化流程中的变化。野生型及某些突变体形式在略有不同的条件下发生结晶，使用PEG 8000和亚精胺时会干扰部分突变体的纯化。为获得适用于X射线晶体学研究的晶体，已进行多项尝试以优化结晶条件、晶体质量和冷冻保护效果。. 本文所述方法应普遍适用于色氨酸合酶亚基以及野生型和突变型α亚基的纯化₂β₂ StTS复合物。

引言

色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α₂β₂）是一种别构酶，在细菌、植物和真菌中催化氨基酸L-色氨酸生物合成的最后两个步骤^1,2,3。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，St）可引起人类及其他动物严重的胃肠道感染。由于人类和高等动物体内不存在TS（EC 4.2.1.20），抑制S. typhimurium的α₂β₂ TS复合物（α₂β₂ StTS）已被探索作为治疗隐孢子虫病和结核病⁴、生殖器与眼部感染⁵的潜在药物靶点，以及在农业中作为潜在除草剂的应用⁶。α亚基催化吲哚-3-甘油磷酸（IGP）发生醛醇裂解反应，生成甘油醛-3-磷酸（GAP）和吲哚，该过程通过形成吲哚烯互变异构中间体，随后发生碳-碳键断裂，生成GAP和吲哚^3,6。β催化位点含有一个与β-Lys87通过希夫碱连接的吡哆醛5′-磷酸（PLP）辅因子分子，其在酶β亚基的反应过程中起到电子阱的作用^3,7。β位点催化L-丝氨酸侧链上的羟基被吲哚取代，通过PLP依赖性反应生成L-色氨酸和一分子水。StTS长期以来被用作研究多酶复合物内底物通道化及别构通讯的模型体系^2,3。TS的α与β亚基之间双向的别构通讯对于协调催化步骤并在L-色氨酸合成过程中防止吲哚释放至关重要³。为进一步推进此项研究，我们通过单点突变构建了多个突变体（β-Gln114Ala、β-Lys167Thr和β-Ser377Ala），用于深入探究StTS β亚基催化位点处酶结构、机理与功能之间的关系。

关于α₂β₂StTS催化机制的详细研究最初由Edith W. Miles研究组启动。早期对天然大肠杆菌（Escherichia coli）α₂β₂ TS复合物的研究主要集中在分离的α亚基^8,9、分离的β亚基^10,11以及由分离亚基重建α₂β₂ TS复合物¹²的纯化与表征。纯化过程包括硫酸铵沉淀、样品透析、DEAE-Sephadex层析、透析，以及在DEAE-Sephadex柱上进行的第二轮层析¹²。在另一项方案中，通过将澄清的细胞裂解液上样至DEAE-Sephadex柱，随后在Sepharose 4B柱上进行层析、硫酸铵沉淀和透析，改进了该复合物的纯化流程¹³。这两种纯化方案均需耗时4至5天。大肠杆菌（Escherichia coli）α₂β₂ TS复合物虽已结晶，但当时的晶体不适合进行X射线衍射分析。

在一项创新研究中，对S. typhimurium的α₂β₂ TS复合物的重组型和野生型进行了纯化并获得晶体^14,15。重组型α₂β₂ StTS复合物在携带pEBA-10表达载体的大肠杆菌（E. coli）CB149菌株中过量表达。此前已有报道对α₂β₂ StTS复合物进行了初步结晶以及X射线衍射数据的收集与分析¹⁴。然而，所获得的α₂β₂ StTS晶体呈细长针状，不利于结构研究。为了获得更高质量的X射线衍射数据，后续提出另一种纯化方案，用于纯化α₂β₂ StTS复合物的野生型及突变体形式¹⁵。该方案首先在澄清的细胞裂解液中加入亚精胺和PEG 8,000进行初步沉淀，通过离心去除大量絮状沉淀。含有高浓度α₂β₂ StTS复合物的上清部分在4 °C下保存16至48小时，直至黄色晶体析出。晶体经洗涤后，用不同缓冲液进行广泛透析。随后在含硫酸铵的缓冲液中对蛋白复合物进行重结晶并再次透析¹⁵。尽管蛋白结晶依赖于溶液中蛋白和沉淀剂的浓度，但该方法难以监测、预测和重复用于其他α₂β₂ StTS复合物突变体的纯化过程。该方案的优点是无需使用任何层析技术；但其缺点是纯化周期较长，包括结晶、透析和重结晶步骤，通常需要5至7天。为获得适合X射线数据收集的晶体，研究人员评估了超过600种结晶条件，组合并调整了蛋白浓度、温度、沉淀剂（PEG 4,000、6,000和8,000）以及添加剂（CaCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、尸胺、腐胺、亚精胺或精胺）的种类与浓度¹⁵。在含有12% PEG 8,000和2 mM亚精胺的条件下，晶体形态更佳且生长更快。相较于4、30或42 °C，25 °C更有利于结晶，晶体在3天内即可达到最大尺寸¹⁵。当时（1996–1999年）已报道了多个α₂β₂ StTS晶体结构^{16,17,18,19,20,21}，至今已有更多相关结构被发表。

本文的主要目的是提供纯化色氨酸合酶及优化蛋白质结晶的替代性实验方案。本研究展示了对纯化野生型分离的α亚基（αStTS），分离的β亚基（βStTS），重建的 α₂β₂ St由分离的亚基组装TS复合物，以及α亚基的野生型和突变体形式₂β₂ StTS复合物. 相较于以往的实验方案，本方法具有显著优势，因为纯化时间大幅缩短，且结晶与冷冻保护条件得到了优化。α的突变体形式₂β₂ St本研究中构建的TS复合物在与野生型相近的条件下实现了结晶。然而，仍需进行精细的结晶优化，以获得足够大且质量优良的单晶，用于近原子分辨率的结构解析。截至目前，蛋白质数据库（PDB）中已收录了134个色氨酸合酶晶体结构，分别来自细菌（101个）、古菌（31个）和真核生物（2个）。其中，有73个结构属于 S. enterica 血清型 typhimurium 以及5个α的晶体结构₂β₂ StTS复合物的分辨率高于1.50埃。毫不奇怪，其中5个中有4个由我们的研究小组制备（PDB编号：5CGQ，分辨率为1.18 Å；4HT3，分辨率为1.30 Å；4HPJ，分辨率为1.45 Å；6DZ4，分辨率为1.45 Å）。突变型α的优化晶体结构₂β₂ StTS复合物有望为参与L-色氨酸合成的关键氨基酸残基的作用机制和功能提供新的见解。

方案

1. 快速纯化α和β亚基以及重组α₂β₂ StTS复合物的实验方案

1. 将DNA亚克隆至pETSUMO表达载体
   1. 获取编码色氨酸合成酶A亚基和B亚基的翻译偶联基因（trpA和trpB） α- 和 β细菌色氨酸合酶的亚基 肠道沙门氏菌 血清型 鼠伤寒沙门氏菌 克隆至pEBA-10表达载体中²²使用 pEBA-10 载体作为 DNA 模板。
      注意：或者，也可使用下表所列引物扩增这两个基因 沙门氏菌肠炎亚种 血清型 typhimurium 基因组。所有分子生物学步骤均按照《分子克隆：实验室手册》中的描述进行。²³.
   2. 使用聚合酶链式反应（PCR）分别扩增全长多核苷酸序列 α-亚基（αStTS）与引物 αStTS-FW-Bam 和 αStTS-Rev-Eco 和全长序列 β亚基（βStTS）与引物 βStTS-FW-Bam 和 βStTS-Rev-Hind。使用约 55 °C 的退火温度和 2 分钟的聚合酶延伸时间。
      1. 使用高保真DNA聚合酶（例如Phusion）并按照制造商的说明书扩增DNA序列。对于50 µL的PCR反应体系，加入34 µL无核酸酶水、10 µL 5×反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 µM正向引物、1 µL 10 µM反向引物、1 µL模板DNA（200 ng）、1.5 µL DMSO和0.5 µL Phusion DNA聚合酶。
      2. PCR程序采用热启动（98 °C下180秒），随后进行30个扩增循环（98 °C下30秒，55 °C下30秒，72 °C下120秒），最后进行终末延伸（72 °C下300秒）。
         注意：斜体序列对应于 Bam你好， 生态RI, Bam高碘酸和 后肢III限制性酶切位点。通过在PCR片段末端添加额外碱基（小写字母序列）可提高酶切效率。
         αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
         αStTS-Rev-Eco：5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
         βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
         βStTS-Rev-Hind：5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
   3. 将PCR产物在1×TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸和1 mM EDTA）中以6 V/cm的电压加载到0.8%琼脂糖凝胶上，切取目标DNA条带，并使用硅胶珠试剂盒按照制造商说明书对PCR片段进行胶回收纯化。
      1. 使用制造商推荐的限制性内切酶及相应条件，于37 °C对每种DNA片段至少200 ng进行酶切消化，反应2小时。
      2. 在50 μL限制性酶切反应体系中，加入34 µL无核酸酶水、10 µL DNA（200 ng）、5 μL 10×反应缓冲液、0.5 µL限制性内切酶1和0.5 µL限制性内切酶2。
      3. 将消化产物在1x TAE缓冲液中用0.8%琼脂糖凝胶以6 V/cm的电压进行电泳，切胶回收，并使用商业化试剂盒对消化后的片段进行胶回收纯化。
   4. 将每个片段分别亚克隆至 E. coli 经适当酶切并经凝胶纯化的表达修饰型载体pET SUMO。
      注意：该载体是商业化的pET SUMO载体的改良版本。该载体已针对限制性内切酶克隆进行了优化。pET28b载体的多克隆位点（MCS）Bam你好， 生态RI, Sac我， 盐我， 后肢三， 否我，以及 XhoI）被插入至pET SUMO载体的克隆位点。该载体包含一个与小泛素样修饰蛋白（SUMO）同框的N端6×组氨酸标签以及多个克隆位点。
   5. 将100 ng修饰后的pET SUMO质粒与50 ng PCR片段在25 °C下用T4 DNA连接酶连接2小时。
   6. 将构建的质粒转化至感受态细胞中 E. coli 菌株 DH10Bα细胞。接种细胞 开启 含LB琼脂平板 35 μg/mL 卡那霉素 将培养板倒置，在37 °C下孵育过夜。
   7. 从每次转化中挑选单个菌落，制备超纯质粒DNA，并进行DNA测序以验证 αStTS 或 βStTS 与 N 端 His6-SUMO 标签同框克隆。
      注意：制备细胞培养物的甘油冻存液（将细胞悬液与无菌甘油混合，终浓度为16%），并于-80 °C长期保存。
   8. 将表达质粒 SUMO-αStTS 或 SUMO-βStTS 分别转入感受态细胞中 E. coli 表达菌株 Rosetta (DE3) pLysS 使用基于T7启动子的系统。将重组细胞接种于含有35 μg/mL卡那霉素和氯霉素的LB（Luria Bertani）琼脂平板上。37 °C倒置培养过夜。
   9. 成功形成菌落后，挑取一个单一菌落（不含任何卫星菌落），将其分散于含有两种抗生素的5 mL LB培养基中。在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养细胞。
      注意：制备细胞培养物的甘油菌种，可于 -80 °C 长期保存，或立即用于重组蛋白表达。
2. SUMO 表达αStTS 和 SUMO-βStTS亚基
   1. 接种新鲜 E. coli Rosetta (DE3) 菌株 pLysS 携带 SUMO- 的细胞αStTS 或 SUMO-βSt将TS构建体或刮取部分冷冻甘油菌种接种至50 mL含35 μg/mL卡那霉素和氯霉素的LB培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
   2. 次日早晨，将5 mL过夜培养的菌液接种至新鲜无菌的2×1000 mL LB培养基中，培养基含2%甘油以及卡那霉素和氯霉素，置于2.8 L的Fernbach摇瓶中。于37 °C、200 rpm振荡培养菌液。
      注意：SUMO-的表达αStTS 或 SUMO-βStTS在LB肉汤中每升可产生125-150 mg的标记蛋白。可根据具体需求相应放大或缩小实验方案。
   3. 诱导重组蛋白表达，当OD₆₀₀ 通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mM，使OD600达到0.6–0.8，随后在30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
   4. 通过在 4,000 x 转速下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 20 分钟。弃上清，用 60 mL 冷裂解缓冲液 1（50 mM Tris-Cl，pH 8.0，含 500 mM NaCl、5% 甘油、10 mM 2-巯基乙醇和 40 mM 咪唑-Cl）重悬细胞沉淀。
      注意：细胞可在 -80 °C 长期保存，或直接用于蛋白质纯化。如需保存细胞，将细胞悬液分装至两个 50 mL 一次性离心管中，于 -80 °C 保存细胞沉淀，直至进行蛋白质纯化步骤。
3. 纯化 α- 色氨酸合酶的β亚基
   注意：除非另有说明，所有操作均在 4 °C 下进行。为缩短纯化时间，可在蛋白质纯化之前或重组蛋白表达期间，用缓冲液预先平衡 Ni-NTA 琼脂糖镍离子亲和层析柱和尺寸排阻层析柱。
   1. 使用数字超声波破碎仪，采用1/2英寸探头对细胞沉淀进行超声破碎" 角状探头（或类似设备）。在冰水浴中以80%振幅、10秒脉冲和20秒间歇进行20个循环，或直至细胞完全破碎。
   2. 将细胞裂解液在 30,000 x g 孵育30分钟。吸除上清液，确保沉淀物不从管壁脱落。将上清液置于冰上，用0.45 μm滤器过滤后，流经预先用裂解缓冲液1平衡的15 mL Ni-NTA琼脂糖镍离子亲和层析柱。
      注意：每个Ni-NTA琼脂糖柱将用于纯化SUMO-αStTS 或 SUMO-βStTS重组蛋白。纯化可在连接快速蛋白液相色谱系统的2x 5 mL Ni-NTA柱上进行。每次纯化一种蛋白。
   3. 用100 mL裂解缓冲液1洗涤Ni-NTA琼脂糖柱。
   4. 使用洗脱缓冲液 E1（25 mM Tris-Cl 缓冲液，pH 7.8，含 200 mM NaCl、5% 甘油和 400 mM 咪唑-Cl）进行 80 mL 一步洗脱。
      注意：SUMO蛋白酶可耐受高达300 mM的咪唑，离心过滤装置的膜可耐受高达100 mM的咪唑。我们建议采用硫酸铵沉淀法去除高浓度咪唑，并缩短纯化时间，而不是稀释蛋白样品后再进行耗时的蛋白浓缩步骤。
   5. 评估上清液部分的初始体积。逐次缓慢加入少量硫酸铵，直至达到25 °C下60%饱和度（39.48 g/100 mL）。轻轻搅拌溶液30分钟，避免产生气泡。在10,000 x g 15分钟。
   6. 吸弃上清液，小心丢弃。将沉淀部分重悬于20 mL样品缓冲液（20 mM Tris-Cl，pH 8.0，300 mM NaCl和5%甘油）中。
   7. 对于使用SUMO蛋白酶进行His-SUMO标签的切割，加入来自Ubl特异性蛋白酶1的重组片段 酿酒酵母以1:1000的比例稀释，4 °C孵育2小时。
   8. 将消化产物在10,000 x g 在25 °C下孵育20分钟，以去除蛋白质聚集体，然后将样品上样至亲和层析柱。
   9. 将20 mL重悬样品加载至预先用裂解缓冲液1平衡的15 mL Ni-NTA琼脂糖柱，以去除His6-SUMO标签残留。
   10. 收集含有非标签蛋白的穿流组分 αStTS 或 βStTS.
   11. 用 20 mL 缓冲液 1 清洗 Ni-NTA 柱，以去除未带标签蛋白的残留物 αStTS 或 βStTS.
   12. 分别使用15 mL截留分子量为10 kDa的离心过滤装置，在3,000 x g条件下离心，浓缩各亚基。 g 在 4 °C 下。将浓缩后的蛋白质转移至新的 2.0 mL 离心管中，进行微量离心（10,000 × g，10 分钟，4 °C），以去除聚集体。测定蛋白质浓度²⁴，准备20-25 mg/mL的1 mL等份试样^-1，标记，液氮速冻，并于 -80 °C 保存。
       注意：预纯化的蛋白质样品可长期保存于 -80 °C，或立即用于尺寸排阻色谱柱（SEC）上的蛋白质纯化。
   13. 取一份蛋白质等分试样（20 mg），在10,000 x g 10 分钟以在 SEC 前去除聚集体。
   14. 将样品加载到连接于快速蛋白纯化系统的尺寸排阻色谱柱上（例如 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR） 液相色谱 流速为 0.5 mL/min^-1，先前在SEC缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.8，100 mM NaCl，5%甘油，0.1 mM磷酸吡哆醛）中平衡。
       注意：为了纯化更大量的分离αStTS 或 βStTS亚基并减少SEC轮次，以20-25 mg/mL加载5 mL样品^-1 在尺寸排阻色谱柱上以1.5 mL/min的流速进行^-1.
   15. 评估 α 的质量StTS 或 βSt使用12%或15%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分别对峰值组分中的TS进行分析，并用考马斯亮蓝染色²⁵.
   16. 使用新鲜的15 mL 10 kDa截留分子量离心过滤装置浓缩蛋白质，测定蛋白质浓度²⁴，准备20-25 mg/mL的0.5 mL分装液^-1，标记，液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
4. α的纯化₂β₂ StTS复合物来自 α- 和β亚基
   注意：用SEC缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.8，100 mM NaCl，5%甘油，0.1 mM磷酸吡哆醛）平衡尺寸排阻色谱柱（Sephadex S-200 HR或Superdex 200 pg）。
   1. 纯化野生型α₂β₂ StTS复合物来自 α- 和β亚基，解冻浓缩样品 αStTS 和 βSt4 °C 下的 TS 亚基
   2. 合并等份试样（1.2 αStTS：1.0 βStTS摩尔比），4 °C孵育1小时。
      注意：必须使用过量的αStTS，以确保大部分βStTS 将被整合到 α 中₂β₂ StTS复合物
   3. 通过微量离心（10,000 × g，10 分钟，4 °C）去除蛋白质聚集体。
   4. 将澄清的上清液上样至尺寸排阻层析柱中。
   5. 评估 α 的质量StTS 或 βSt分别使用12%或15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对峰级分中的TS进行分析，并用考马斯亮蓝染色²⁵.
   6. 测定蛋白质浓度²⁴，准备 250-1000 μL 分装样品，浓度为 15-20 mg/mL^-1，液氮速冻后于-80 °C保存。

2. 野生型或突变型 α₂β₂ StTS 复合物的纯化

1. 定点突变以制备突变型 βStTS
   1. 使用 pEBA-10 表达载体构建体²² 作为DNA模板，在两步聚合酶链式反应中引入特定位点突变 β-链TS多核苷酸序列。
      注意：本方案可用于在任一目标位点引入单个点突变 α-或 β亚基来自 沙门氏菌伤寒血清型 色氨酸合成酶。此外，必须合理设计含有目标突变的新寡核苷酸引物。在本研究中，突变 βQ114A βK167T, βS377A 已列出。
   2. 使用引物对 TS-FW-NcoI/Q114A-Rev、TS-FW-NcoI/K167T-Rev 和 TS-FW-NcoI/S377A-Rev 分别进行 PCR 反应，以扩增获得片段 A1、B1 和 C1。
      注意：寡核苷酸 TS-NcoI-FW 和 TS-SacI-Rev 分别与 αβ 上游和下游区域互补结合 St克隆在 pEBA-10 载体中的 TS 多核苷酸序列。
      1. 使用高保真DNA聚合酶（例如Phusion）并按照制造商的说明书扩增DNA序列。对于50 µL的PCR反应体系，加入34 µL无核酸酶水、10 µL 5×反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 µM正向引物、1 µL 10 µM反向引物、1 µL模板DNA（200 ng）、1.5 µL DMSO和0.5 µL DNA聚合酶。
      2. PCR程序采用热启动（98 °C下180秒），随后进行30个扩增循环（98 °C下30秒，55 °C下30秒，72 °C下120秒），最后延伸（72 °C下300秒）。
         注意：所有分子生物学步骤均按照《分子克隆：实验室手册》中的描述进行²³小写字母序列对应限制性酶切位点，加粗斜体序列对应突变。
         TS-FW-NcoI：5’-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3’
         Q114A-Rev：5’-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3’
         K167T-反向：5’-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3’
         S377A-Rev：5’-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3’
   3. 使用引物对 TS-Rev-SacI/Q114A-FF、TS-Rev-SacI/K167T-FF 和 TS-Rev-SacI/S377A-FF 分别进行 PCR 反应，以扩增获得片段 A2、B2 和 C2。
      TS-Rev-SacI（5’-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3’
      Q114A-FF 5’-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3’
      K167T-FF 5’-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3’
      S377A-FF 5’-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3’
   4. 使用聚合酶链式反应分别扩增各部分片段。退火温度设为55 °C，聚合酶延伸时间为2 min。
   5. 进行第二轮PCR反应时，将上述PCR产物在1×TAE缓冲液中用0.8%琼脂糖凝胶以6 V/cm的电压进行电泳，然后对目标片段进行胶回收和胶纯化。
      1. 将片段 A1/A2、B1/B2 和 C1/C2 分别等摩尔混合，于 96 °C 加热变性 10 分钟，然后在 25 °C 下退火。根据制造商说明书，使用高保真聚合酶和脱氧核糖核苷酸延伸重组链。
   6. 为了获得高拷贝数的全长突变DNA片段，加入寡核苷酸引物TS-FW-NcoI和TS-Rev-SacI进行第二次PCR扩增。
   7. 在1x TAE缓冲液中，将PCR产物上样至0.8%琼脂糖凝胶，以6 V/cm电压电泳；切取目标DNA条带，进行凝胶回收并纯化PCR片段；随后根据生产商推荐的缓冲液和条件，进行适当的限制性酶切反应，37 °C孵育2小时。
      1. 用制造商推荐的适当限制性内切酶及条件，于37 °C孵育2小时，消化至少200 ng的每种DNA片段。配制50 μL限制性消化反应体系：加入34 µL无核酸酶水、10 µL DNA（200 ng）、5 μL 10×反应缓冲液、0.5 μL限制性内切酶1和0.5 μL限制性内切酶2。将消化产物上样至含1×TAE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶，以6 V/cm电压电泳分离 并纯化消化后的PCR片段。
   8. 用限制性内切酶消化200 ng pEBA-10质粒构建体 Nco我与 Sac按照制造商的说明操作。将消化产物在含1x TAE缓冲液的0.8%琼脂糖凝胶上以6 V/cm的电压进行电泳，切下对应于载体的条带，并对消化后的载体进行凝胶纯化。
   9. 将100 ng载体与50 ng先前经消化和纯化的PCR片段在25 °C下用T4 DNA连接酶连接2小时。将构建的质粒转化至感受态细胞中 E. coli 菌株 DH10B 细胞。将细胞接种于含有50的LB琼脂平板上 μg/mL 氨苄青霉素. 将培养板倒置，在37 °C下孵育过夜。
   10. 从每次细胞转化中挑选单个菌落（无卫星菌落），接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中。在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。从每种构建的工程质粒中提取10 μg超纯质粒DNA。制备甘油菌保存液（将菌液与无菌甘油混合至终浓度为16%），于-80 °C长期保存。
   11. 对色氨酸合酶的α和β亚基编码全长序列进行DNA测序以确认序列准确性。验证每个单点突变，并剔除含有非预期随机突变的质粒构建体。本研究中使用的寡核苷酸引物如下所示。
       TS-1F：5’-ATGACAACACTTCTCAAC-3’
       TS-1R：5’-GAAATGCCAGAACATTAC-3’
       TS-2F：5’-CAGTCGCCGAACGTC-3’
       TS-3F：5’-GATGATGCAAACAGC-3’
       TS-4F：5’-CTGGCATTGAACAGTC-3’
       TS-5F：5’-CGTTGCATCATCTCATTG-3’
       注意：寡核苷酸引物 TS-1F、TS-1R、TS-2F 和 TS-3F 结合于 β 亚基的多核苷酸序列（GenBank 登录号：CP051286.1）；引物 TS-4F 和 TS-5F 结合于 α 亚基的多核苷酸序列（GenBank 登录号：CP053865.1）。
   12. 使用每种质粒构建体（pEBA-10-）200 ngβQ114A，pEBA-10-βK167T，和 pEBA-10-βS377A）以转化感受态细胞 E. coli 表达菌株CB149，缺失 trp 操纵子²⁶成功形成菌落后，挑取单个菌落，并将细胞接种于5 mL含有相应抗生素的LB培养基中培养 50 μg/mL 氨苄青霉素，于37 °C细菌培养箱中过夜培养。制备菌种甘油冻存液，可于-80 °C长期保存，或立即用于重组蛋白表达。
       注意： α或β亚基中的单个点突变 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 色氨酸合成酶可能损害酶功能或降低L-色氨酸的合成 E. coli 菌株CB149。请考虑使用以下任意一种 E. coli BL21(DE)pLys-S 或 Rosetta (DE3)pLys-S 菌株，若无表达或重组 α 蛋白表达量较低时使用₂β₂ St在SDS-PAGE凝胶中检测到TS复合物。
2. 野生型和突变型α的表达₂β₂ StTS复合物在 大肠杆菌
   1. 培养 E. coli 在含有50 μg/mL氨苄青霉素的新鲜无菌50 mL LB培养基中接种含有目的构建体的表达菌株，于37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
   2. 将5 mL过夜培养的细胞培养物加入新鲜无菌的含有2%甘油和氨苄青霉素的2×1000 mL LB培养基中（2.8 L Fernbach摇瓶）。在37 °C、200 rpm振荡条件下培养细胞。
   3. 诱导重组蛋白表达，当OD₆₀₀ 通过加入IPTG至终浓度0.4 mM，使菌液OD值达到0.6–0.8，随后在30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
   4. 通过在 4,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C 下孵育 20 分钟。移除上清液，用 50 mL 冷裂解缓冲液 2（50 mM Tris-Cl，pH 7.80，含 100 mM NaCl、5 mM 二硫苏糖醇、1 mM EDTA 和 1 mM PMSF）重悬细胞沉淀。
      注意：细胞可在 -80 °C 长期保存，或直接用于蛋白质纯化。如需保存细胞，将细胞悬液分装至两个 50 mL 一次性离心管中，于 -80 °C 保存细胞沉淀，直至进行蛋白质纯化步骤。突变型与野生型 α 的表达₂β₂ StTS复合物在LB肉汤中每升可产生125-150 mg蛋白质。可根据具体需求相应放大或缩小实验方案。
3. 纯化野生型或突变型α₂β₂ StTS复合物
   注意：以下方案旨在纯化未加标签的重组型野生型或突变型α₂β₂ StTS复合物可在1天内完成，具体时间取决于操作者的技能水平和努力程度。为缩短纯化时间，应在蛋白纯化/表达前用缓冲液平衡尺寸排阻层析柱。野生型或突变型α的纯化₂β₂ StTS复合物的纯化通过两步法完成，包括硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱。该方案可从1 L LB培养基中获得60–100 mg的高纯度复合物。
   1. 使用数字超声波破碎仪，采用1/2探头对细胞沉淀进行超声破碎" 角状探头（或类似设备）。在冰水浴中以80%振幅、10秒脉冲和20秒间歇进行20个循环，或直至细胞完全破碎。
   2. 将细胞裂解液在 30,000 x g 在25 °C下孵育30分钟。吸除上清液，确保沉淀物不从管壁脱落。在室温下用0.45 μm滤膜过滤澄清的上清液组分。
   3. 评估澄清上清液部分的初始体积。每次缓慢加入少量硫酸铵，直至达到20%饱和度（11.51 g / 100 mL）。在25 °C下进行硫酸铵分级沉淀。轻轻搅拌溶液10分钟，并避免产生气泡。
   4. 30,000 × g 离心 g 在25 °C下孵育10分钟。将20%上清组分转移至洁净的烧瓶中。用20 mL样品缓冲液2（50 mM Tris-Cl，pH 7.80，含100 mM NaCl、1 mM EDTA和2 mM二硫苏糖醇）轻轻重悬20%沉淀组分，并制备用于SDS-PAGE凝胶电泳的样品。弃去20%沉淀组分。
   5. 评估20%上清组分的初始体积。加入硫酸铵至30%饱和度（5.94 g / 100 mL），搅拌溶液，避免产生气泡，然后按先前方法离心。将30%上清组分转移至洁净的烧瓶中。用20 mL样品缓冲液2轻轻重悬30%沉淀组分，并制备样品用于SDS-PAGE凝胶电泳。弃去30%沉淀组分。
   6. 评估30%上清组分的初始体积。加入硫酸铵直至达到40%饱和度（6.14 g / 100 mL），搅拌溶液，避免产生气泡，然后按先前方法离心。将40%上清组分转移至洁净的烧瓶中。用10 mL样品缓冲液2轻轻重悬40%沉淀组分，并制备样品用于SDS-PAGE凝胶电泳。弃去40%上清组分。
      注意：评估αβ的质量St使用30%和40%样品的TS复合物 上清液和沉淀组分在12% SDS-PAGE凝胶中25。如果你验证发现任何其他突变型αβStTS复合物位于40%上清液组分中， 继续进行  60% 饱和度的硫酸铵（13.0 g / 100 mL）。预纯化α蛋白的预纯化蛋白等分试样₂β₂ StTS复合物可长期保存于-80 °C，或立即用于尺寸排阻色谱柱（SEC）上的蛋白纯化。
   7. 将蛋白质样品在微型离心机中以 10,000 x g，20 分钟，4 °C，将上清液组分上样至连接快速蛋白纯化系统的 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 柱 液相色谱法 0.5 mL/min 的流速^-1，先前在SEC缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.8，100 mM NaCl，5%甘油，0.1 mM磷酸吡哆醛）中平衡。
      注意：为纯化大量复杂样品，以每毫升20-25毫克的载样量上样5 mL样品^-1 在流速为1.5 mL/min的HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱上^-1.
   8. 在12% SDS-PAGE凝胶上对硫酸铵分级沉淀过程中收集的样品以及SEC柱洗脱的峰组分进行检测，考马斯亮蓝染色²⁵.
   9. 浓缩 野生型或突变型 α₂β₂ StTS复合物与15 mL截留分子量为100 kDa的离心过滤装置，以3,000 x g 在 4 °C 下，将浓缩的蛋白质转移至新的 2.0 mL 离心管中，然后进行微量离心（10,000 × g，10 分钟，4 °C），以去除聚集体。
   10. 测定蛋白质浓度²⁴，准备 0.5 mL 分装液，浓度为 20–25 mg/mL^-1，标记，液氮速冻，并于 -80 °C 保存。

3. 野生型及突变型 α₂β₂ StTS 复合物的优化结晶

注意：α₂β₂ StTS 复合物的初始结晶条件此前已有报道，该条件包含 12% PEG 8,000 和 2 mM 亚精胺²²。

1. 在进行结晶实验前配制储备溶液，以提高结晶的可重复性。为开展TS的结构研究，需将蛋白质与Na共同结晶⁺ 或 Cs⁺ 双酶复合物金属配位位点的离子化。
   1. 配制5 mL 200 mM亚精胺水溶液，分装500 µL至离心管中，于-20 °C保存。
   2. 配制50 mL 30% (w/v) PEG 8000水溶液母液，将25 mL分装至50 mL一次性离心锥形瓶中，于25 °C保存。
   3. 配制25 mL 1 M CsCl水溶液，于25 °C保存。
   4. 配制25 mL 1 M NaCl水溶液，于25 °C保存。
   5. 配制 3 份 50 mL 的 1 M bicine 储存液，分别用 CsOH 或 NaOH 滴定，得到 pH 为 7.6、7.8 和 8.0 的缓冲溶液。将 25 mL 分装样保存于 4 °C。
2. 解冻一份α₂β₂ StTS复合物（20-25 mg/mL）^-1置于冰浴中。
3. 以 10,000 x g 离心样品 g 在25 °C下孵育10分钟以去除蛋白质聚集体。
4. 将澄清的上清液部分转移至一个新的洁净微量离心管中。
5. 估算的蛋白质浓度²⁴ 并取蛋白质等分试样（150–200 µL）稀释至 15 mg/mL^-1 用50 mM Bicine-CsOH或Bicine-NaOH（pH 7.8）缓冲液配制，其中含50 mM CsCl或NaCl。将蛋白质样品保持在25 °C。
6. 为3块24孔坐滴板分别准备500 µL储液，在无菌1.5 mL带标签离心管中配制。储液包含50 mM bicine-CsOH或-bicine-NaOH、50 mM CsCl或NaCl以及PEG 8000。在板的列方向上梯度改变PEG 8000浓度（6–11%），在行方向上梯度改变亚精胺浓度（2–8 mM）。每组实验更换缓冲液pH值（pH 7.6、7.8和8.0）。
7. 盖上管盖，充分涡旋振荡至少10秒。以10,000 x g 在25 °C下孵育10分钟以去除气泡. 向每个已标记的储液槽中加入 500 µL 缓冲溶液。
8. 使用 P-10 微量移液器，在 15 mg/mL 浓度下加入 5 µL 蛋白溶液^-1 每个坐滴孔中。避免产生气泡。向蛋白液滴中加入5 µL相应的储液溶液。混合过程中避免产生气泡，不要通过反复吹打来混匀混合物。
9. 用透明胶带将板子封好，并在25 °C下保存。晶体在2至5天内出现，并在两周内生长至完全尺寸。

4. X射线衍射数据收集与α₂β₂ StTS复合物结构解析

注意：在进行X射线衍射数据收集之前，需提前为每颗晶体配制冷冻保护剂溶液。使用特定的储液溶液配制3份含有逐步增加浓度的d二甲基亚砜（10%、20% 和 30% v/v）和特定配体。研究发现，二甲基亚砜作为冷冻保护剂的效果优于甘油、乙二醇和聚乙二醇 200-300。

1. 在体视显微镜下，使用冷冻环收获一块大的单晶。
2. 移液2 μL每种冷冻保护剂溶液，其中含有沉淀溶液及更高浓度的d二甲基亚砜和配体（s） 转移到新的盖玻片上。
3. 依次浸泡 c每滴中取一颗晶体，将其在冷冻保护剂溶液中平衡30秒。
4. 使用温度为 -173 °C（100 K）的氮气流对经冷冻保护的晶体进行快速冷却，或将其浸入液氮中，以便长期保存于载晶头中。
   注意：用液氮填充泡沫杜瓦瓶，预冷晶体载具，将晶体存放在低温储存杜瓦瓶中，并使用干式运输罐将晶体运送至同步辐射光源。
5. 在 -173 °C 下进行X射线衍射数据收集记录X射线衍射数据 使用0.5–4.0秒的曝光时间和0.5°的振荡角度，将晶体旋转180–360°。
6. 使用 iMosflm 处理X射线衍射图像²⁷ 生成相应空间群的衍射文件。通常，α₂β₂ StTS晶体属于空间群C 121（C2）。
7. 使用 Scala 对多个衍射观测值进行缩放处理²⁸，采用 CCP4 软件包实现²⁹.
8. 解析高分辨率 α 的结构₂β₂ St使用MolRep通过分子置换法求解TS复合物结构³⁰ 并选择合适 的搜索模型。在 Coot 中检查模型和电子密度图³¹ 在成功解析结构后。
   注意：蛋白质数据库中已收录多种含不同配体（s）的TS晶体结构。为了更好地进行分子置换并减少后续晶体结构拟合所需时间，应选择包含目标配体（s）的最佳搜索模型。随后在CCP4中进行晶体结构 refinement（精修）。^29,30 或 Phenix³¹.
9. 使用 Coot 对模型进行手动调整³²，随后使用 Refmac 进行自动优化^29,33 或 phenix.refine^31,34. 通过在 Coot 中进行多轮迭代式模型构建来建立并优化最终模型³² 和自动化优化。
10. 在蛋白质数据库（Protein Data Bank）网站上提交坐标和结构因子数据。

结果

纯化 α- 和 β色氨酸合酶的亚基
该 α-亚基（αStTS）和β亚基（βStTS）的 鼠伤寒沙门氏菌 色氨酸合酶被亚克隆至修饰后的pET SUMO载体中。 图1A 显示两条强条带的代表性SDS-PAGE结果，对应于His6-SUMO-αStTS（泳道 αON）和 His6-SUMO-βStTS（βON泳道）融合蛋白。本研究所描述的纯化方案可在2天内分别纯化得到两个亚基。第一天用于通过Ni-NTA亲和层析、硫酸铵沉淀、His-SUMO标签切割、去除残留的His-SUMO标签以及蛋白浓缩等步骤对每种蛋白进行单独纯化。 图1B 和 1C 展示具有代表性的SDS-PAGE结果...

讨论

我们已成功构建了用于结构与功能相关性研究的突变体 α₂β₂ βQ114A、α₂β₂ βK167T 和 α₂β₂ βS377A StTS 复合物。最初，我们尝试使用先前的纯化方案²²来纯化这些突变体，该方案要求在纯化过程中使用 PEG 8000 和亚精胺诱导 α₂β₂ StTS 复合物结晶。尽管结晶速率取决于突变体类型及溶液中复合物的浓度，但在大体积溶液中难以预测晶体出现的时间。结晶可能在较长时间（48–96 小时）后发生，或在结晶启动后需额外添加 PEG 8000 才能实现¹⁵。

遗憾的是，本研究中呈现的 α₂β₂ StTS 复合物突变体形式无法通过该方案成功纯化，因为在方案初始步骤中未能形成晶体，从而阻碍了晶体学研究...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 10 kDa 滤膜	MilliporeSigma	UFC901024	离心过滤装置
15 mL 100 kDa 滤膜	MilliporeSigma	UFC910024	离心过滤装置
2 mL 冻存管	Corning	CLS430489	冻存管
2 mL 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-141	微量离心管
24 孔 Cryschem 板	Hampton Research	HR3-158	24 孔坐滴结晶板
2-巯基乙醇	Fisher Scientific	O3446I-100	化学试剂
50 mL 离心锥形管	Thermo Scientific	12-565-270	离心锥形管
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH 计
琼脂糖	Fisher Scientific	BP1356-100	琼脂糖凝胶
硫酸铵	Fisher Scientific	A702-500	化学试剂
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5	抗生素
细菌培养箱	Fisher Scientific	S35836	培养箱
BamHI	New England Biolabs	R0136S	限制性内切酶
双(2-羟乙基)氨基乙酸（bicine）	Fisher Scientific	BP2646100	化学试剂
Branson 450 数字超声破碎仪	Brason	B450	细胞破碎仪
氯化铯	Fisher Scientific	BP210-100	化学试剂
氢氧化铯	Acros Organics	AC213601000	化学试剂
氯霉素	Fisher Scientific	BP904-100	抗生素
二甲基亚砜	Fisher Scientific	D1391	化学试剂
二硫苏糖醇	Fisher Scientific	BP172-5	化学试剂
DNA 聚合酶	Thermo Scientific	F530S	高保真聚合酶
dNTP 混合物	Invitrogen	10-297-018	dNTP 混合液
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	限制性内切酶
乙二胺四乙酸	Fisher Scientific	S311-100	化学试剂
Excella E25R 轨道摇床	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	轨道式培养摇床
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	快速蛋白液相色谱系统
凝胶回收试剂盒	Invitrogen	K210012	DNA 纯化试剂盒
甘油	Fisher Scientific	G33-500	化学试剂
HindIII	New England Biolabs	R0104S	限制性内切酶
His-Trap 柱	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL HisTrap 柱
咪唑	Fisher Scientific	O3196-500	化学试剂
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Thermo Fisher Scientific	R0392	诱导剂
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906-5	抗生素
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	超低温冰箱
LB 液体培养基	Fisher Scientific	BP1426-500	液体培养基
LB 琼脂培养基	Fisher Scientific	BP1425-2	固体培养基
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	化学试剂
NcoI	New England Biolabs	R0193S	限制性内切酶
Ni-NTA 亲和珠	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA 琼脂糖珠
聚乙二醇 8000	Fisher Scientific	BP233-100	化学试剂
苯甲基磺酰氟	Fisher Scientific	44-865-0	化学试剂
磷酸吡哆醛	Acros Organics	AC228170010	化学试剂
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	凝胶过滤柱
SacI	New England Biolabs	R0156S	限制性内切酶
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-100	化学试剂
Sorvall RC-5B 离心机	Sorvall	8327-30-1004	落地式离心机
亚精胺	Acros Organics	AC132750010	化学试剂
Superdex 200 制备级	Cytiva	45-002-491	凝胶过滤柱
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S	DNA 连接酶
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	化学试剂
Ubl 特异性蛋白酶 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO 蛋白酶