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优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

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DOI：

10.3791/61896

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2021年2月4日

 , 
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

本文内容

摘要

本文的目的是使读者充分理解如何将小体积蒸气扩散法用于生长大尺寸单晶蛋白晶体的实验方案，转变为适用于序列晶体学的大体积批量微晶结晶方法。

摘要

本文介绍了一种用于制备大体积（> 100 µL）微晶悬浮液的实验方案，适用于同步辐射光源和X射线自由电子激光装置（XFELs）上的序列晶体学实验。该方法基于对蛋白质晶体相图的理解，并充分利用这一知识指导实验设计。整个方法分为三个阶段：（1）优化晶体形貌，（2）转为批量培养，（3）放大规模。第一阶段的目标是获得衍射质量良好、单一的晶体，理想情况下呈现近似立方体的形态，但并非必须如此。在第二阶段中，通过优化晶体生长时间来改进第一阶段所确定的条件，该策略可将原本通过蒸气扩散法生长的晶体转为批量培养模式。当晶体能够在约24小时内完成生长后，即可绘制该蛋白质与沉淀剂混合体系的形态图谱（morphogram），并以此为基础制定第三阶段的放大策略。一旦实现批量培养，即可尝试扩大反应体积，同时优化晶体的尺寸和浓度。本方案以Endothiapepsin作为示范蛋白进行说明。部分决策针对Endothiapepsin的具体特性而定，但希望其所体现的思路能够启发研究者将其方法论灵活应用于各自的科研项目中。

引言

室温（RT）大分子晶体学在结构生物学领域再次受到关注。X射线自由电子激光（XFEL）光源的发展推动了室温样品输送技术的进步1,2,3,4，这些方法现已应用于同步辐射光源5,6,7,8。室温方法不仅为泵浦-探测实验策略提供了可能9,10,11,12，而且越来越多的证据表明，它们还能促进蛋白质内部产生不同的构象状态13,14,15,16,17。

然而，冷冻方法在20世纪90年代末期相较于室温方法获得广泛采用的主要原因，是在低于零度的晶体温度下辐射损伤的进程得以减缓18。冷冻方法19开始使得从单个蛋白质晶体中收集完整的衍射数据集成为可能。现代在X射线自由电子激光装置（XFELs）和同步辐射光源上发展的室温方法，通过开发快速（> 100 Hz）的晶体输送策略，解决了单晶辐射损伤的问题1,2,3,4。这些方法使得可以从数千个独立曝光的晶体中收集完整的数据集。因此，这些室温输送方法需要制备大量含有均一微晶的溶液（> 100 µL，晶体尺寸 < 50 µm）。然而，由于冷冻方法通常仅需单个晶体，目前在蛋白质晶体学实验室中，制备此类微晶悬液的方法尚未普及。

文献中已有部分关于微晶优化流程在序列晶体学样品中应用的示例。此处应区分膜蛋白与可溶性蛋白。针对在单油酸甘油酯（或其它脂类）中生长的微膜蛋白晶体（用于脂立方相（LCP））的优化方案已有较为详尽的描述20,21,22。然而，针对可溶性蛋白的微结晶方法，包括在非LCP条件下生长的膜蛋白，总体上仍较为缺乏。以往的研究多集中于该过程的特定环节，例如微晶筛选23,24、促进成核24以及利用自由界面扩散进行放大培养25，但尚未建立完整的方法体系。

然而，最近有研究描述了一种尝试提供完整实验方案的方法26。与蛋白质晶体学的许多方面一样，该方法并非全新，其中提出的许多理念此前已被 Rayment（2002 年）阐述过27。该方法旨在指导晶体学家如何将通过蒸气扩散法生长的单个晶体转化为批量培养方法，以获得数千个微晶。该方法以蒸气扩散法作为常见的起始点，因为蛋白质数据库（PDB）中 95% 的晶体结构数据均来源于蒸气扩散板中生长的晶体26。然而，蒸气扩散法并非微晶培养的理想方法26，因此文中描述了一种将其转化为批量结晶的方法。一旦能够在批量条件下生长晶体，扩大培养规模至更大体积的路径便更具可行性。鉴于蛋白质结晶过程的不确定性，作者强调该方法并非万无一失。但该实验方案至少应能提供对蛋白质“结晶空间”的深入理解。

该方法依赖于蛋白质结晶相图，以及对相图的理解如何在微结晶优化过程中起到指导作用。蛋白质相图通常被描绘为一个 x/y 沉淀剂和蛋白质浓度的图 x 和 y 轴，分别（图1A）。从纯水点（左下角 - 图1A），蛋白质和沉淀剂的浓度均逐渐增加，直至达到溶解度线。溶解度线标志着过饱和点（紫色线 - 图1A）。当蛋白质处于过饱和状态时，溶液在热力学上变得不稳定，会开始分离成两相：“富含蛋白质”相和稳定的饱和溶液相。这种分离可发生在溶解度曲线之外的任何区域，其动力学过程取决于蛋白质的性质及溶液组分的特性。

当蛋白质和沉淀剂浓度过高时，蛋白质会不稳定地从溶液中析出，形成无定形沉淀（粉红色区域——图1A）。然而，在成核区域可能发生有序的相分离［详见Garcia-Ruiz（2003）28的详细描述］，并倾向于形成晶体成核中心（绿色区域——图1A）。成核与生长过程会将蛋白质从溶液中移除，使液滴进入亚稳态区，在此区域内晶体可继续生长，直至达到溶解度线［详见McPherson和Kuznetsov（2014）29的详细讨论］。对于绝大多数结晶条件而言，该相图是一种高度简化的表示方法30。尽管如此，该图对于微晶结晶研究者仍具有重要实用价值，因为通过该图的映射可确定溶解度线以及成核动力学参数。

在制备微晶时，结晶过程中需要优化的两个因素是晶体数量（Xn）及其平均最长尺寸（Xs）。Xn 与成核事件的次数（n）成正比（公式1）。

静态平衡；公式：Xₙ ∝ n；数学表达式；正比概念。     公式 1

Xs 与溶解度线以上游离蛋白的浓度（Ps）除以 Xn 成正比（公式 2）。

静力平衡公式，带有比例符号的示意图，用于教学。     公式 2

在理想情况下，每一次成核事件都会产生一个可能的晶体，且每一个这样的晶体都能均等地接触溶液中可利用的蛋白质。图2 是 Xn 与 Xs 之间关系在理想情况下的图示。实际上，晶体学家对 Xn 和 Xs 的主要控制手段是通过影响成核数量，或通过添加晶种晶体来实现。微晶晶体学家必须判断如何提高 Xn，以便同时获得合适的晶体浓度和晶体尺寸。

大多数结晶技术都需要一个“过渡期”（图1B）。例如，在蒸汽扩散实验中，当蛋白质溶液与沉淀剂溶液混合后，随着液滴与储液池溶液达到平衡，各组分的浓度将发生变化。理想情况下，这些变化会逐步使液滴进入成核区，从而提高结晶倾向。当晶体开始成核并生长时，溶液中的蛋白质含量将逐渐下降，从而降低进一步成核的概率。最终的成核数量取决于具体的蛋白质和实验条件，同时也与进入成核区的深度有关。由于需要过渡步骤的方法对成核区的渗透深度有限，因此成核水平最终将受限于亚稳态-成核区边界的成核速率。

由于增强微晶结晶过程中成核水平的重要性，转向批量结晶方法十分关键。批量法能够更充分地利用整个成核区域（图1C）。在批量法中，其原理是将蛋白质与沉淀剂混合，形成过饱和溶液，而无需改变组分浓度。混合后应可立即发生成核。因此，理论上批量法可达到整个成核区，任何超出亚稳态-成核边界范围的成核动力学提升均能被利用。

如果基础水平的晶体成核不足以产生大量的Xn，则可采用微晶接种方法。在微晶接种中，预先生长的晶体被破碎，形成含有晶体碎片的悬浊液，这些碎片可作为新晶体生长的支架31,32。微晶接种已被广泛应用于序列晶体学样品制备中，以增加Xn，而无需提高晶体成核率（图1C）。

从气相扩散法转变为批量法的过程可以在相图上表示为将实验起始点从非过饱和区或亚稳区移至成核区。这可以通过增加液滴中蛋白质和/或沉淀剂的浓度，和/或两者之间的比例（图1D），并观察哪些条件下晶体迅速出现（< 24 小时）26来实现。完全的气相扩散液滴平衡可能需要数天甚至数周时间33。因此，通过寻找能够快速形成晶体的条件，即可在无需转向其他结晶筛选模式（如微批量法34,35,36,37）的情况下确定批量法的条件。

一旦找到成核区域，即可确定批量结晶条件，并构建形态图——此处为粗略的相图。在考虑采用接种批量法还是直接批量法时，形态图具有重要参考价值。通过绘制蛋白质浓度和沉淀剂浓度函数关系下的Xn值，可评估成核动力学26。若在整个成核区域内Xn值均较低，则可能需要采用接种批量法，以使Xn足够大，从而限制晶体生长。该评估是向更大体积（> 100 µL）放大实验过程的第一步。

该方法的设计使得大多数结晶实验室均可使用标准的蒸气扩散结晶设备来完成。若具备相应设备，已有许多研究描述了可促进该过程各个步骤的技术。这些技术包括但不限于动态光散射（DLS）25,27、非线性成像20,24,25、粉末衍射20,24,27以及电子显微镜技术26[详见Cheng等（2020）40的综述]。

本研究的目的是提供一种从少量体积（< 500 nL）蒸汽扩散结晶法至大体积（> 100 µL) 批次结晶。来自内座壳菌的内座壳蛋白酶 Cryphonectria parasitica 已被用作演示该转化的示例系统。微晶所需的实验类型和样品递送方法将影响理想的Xs 输出26. 对于需要毫秒级时间分辨率的混合实验41 或气动虚拟喷嘴42，最终的 Xs 的 < 5 µm 可能需要实现这一目标。本实验的目的是利用固定靶标递送方法，获得衍射分辨率约为1.5 Å的蛋白质晶体，用于光子激活的泵浦-探测实验。

为了说明使用内切蛋白酶进行此类序列晶体学实验的样品需求，表1列出了一个假设实验的实验参数。样品信息基于下文所述的实验方案。根据对命中率和数据收集需求的一些保守估算，整个实验的总样品消耗量预计为50 mg。

图3展示了一个完整的优化流程图，从初始的小体积蒸汽扩散结晶过渡到大规模批量结晶。对于大多数序列晶体学项目，该方案将从第2步“过渡到批量结晶”开始，因为目标蛋白已经完成结晶。然而，第1步仍被包含在内以保证流程完整性，并提醒读者其重要性。找到能够产生衍射质量良好、单一且较大的晶体的条件，是微晶优化的最佳起点。在第2步中，可将此条件从蒸汽扩散法优化为批量法，并绘制出成核区与亚稳区的形态图。完成此步骤后，可在第3步中将批量条件放大至更大体积。在流程图结束时，晶体学家将建立一个可重复的、大体积（> 100 µL）的内切天冬氨酸蛋白酶微晶批量结晶方案。该方法随后可应用于其特定的目标蛋白。

方案

注意：所有 96 孔坐滴结晶实验均使用 2 或 3 滴板进行设置。采用液体处理机器人和结晶成像仪/培养箱以辅助所有 96 孔筛选实验的制备与监测。结晶实验中所有试剂的浓度均为混合前的起始浓度。

1. 优化晶体形貌

注意：步骤 1.1.1 和 1.1.6 描述了如何确定内切天冬氨酸蛋白酶的结晶条件，以及如何优化这些条件以获得能够产生单一、衍射质量良好的晶体的单一条件。

  1. 稀疏矩阵优化
    1. 制备新鲜的内切蛋白酶溶液。
      ​注意：当购得的内切天冬酶为Superan 600时，必须将其从储存液中进行缓冲液置换并浓缩。
      1. 在 4 °C 下配制 3 L 的 0.1 M 醋酸钠溶液（pH 4.6） °C.
      2. 剪取20 cm透析管，用缓冲液短暂清洗。用夹子封闭透析管一端，将50 mL内孢霉蛋白酶溶液加入管中，然后封闭另一端。
      3. 让溶液透析至少4小时 4 ℃下 h（或过夜） °在 1 L 的 Na 醋酸盐缓冲液中。由于储存缓冲液的组分，透析袋中的溶液现在大约为 100 mL。
      4. 将含有内切天冬酶的透析袋转移至新鲜的1升4 °C，0.1 M 醋酸钠，pH 4.6。重复此步骤一次，使原始缓冲液相对于醋酸钠稀释2000倍。
      5. 内切天冬氨酸酶的浓度现约为10 mg/mL。使用10 kDa离心浓缩器和离心机将其浓缩至100 mg/mL。
      6. 快速冷冻 液氮中保存的内切蛋白酶溶液50 µL 等分试样并于 -80 保存 °C.
    2. 准备一份PACT Premier 96孔稀疏矩阵筛选板。
      1. 使用液体处理机器人，将100 nL的70 mg/mL内切蛋白酶和100 nL的井溶液分别加入每个孔中的一个子孔内。在加入结晶缓冲液后，将蛋白质溶液与井溶液混合3次。
      2. 密封培养板，在20 ℃下放置28天 °C 每天拍摄图像，持续一周，之后每星期拍摄一次，持续4周。
    3. 稀疏矩阵分析
      1. 筛选出能够产生单个内切蛋白酶晶体的初筛条件。从PACT筛选中，选择含有MgCl2 以单晶形式生长，而非针状簇集。
    4. 稀疏矩阵优化
      1. 从 MgCl2 在步骤1.1.3.1中确定的条件下，创建一个96孔板筛选实验，随机组合并改变各孔中的组分。
      2. 使用液体处理机器人，将100 nL的70 mg/mL内切蛋白酶和100 nL的井溶液分别加入每个孔中的单个子孔内。在加入结晶缓冲液后，将蛋白质溶液与井溶液混合3次。
      3. 密封培养板，于20℃放置28天 °C 每天拍摄图像，持续一周，之后每星期拍摄一次，持续四周。
    5. 优化分析
      1. 利用 合适的电子表格软件，根据晶体质量和沉淀程度对产生晶体的结晶条件进行排序，无晶体 （0）到理想（5）以及低（0）到高（5），分别表示。关于晶体质量，其宽泛标准为具有立方体状形态的单晶。
      2. 对结晶条件成分与晶体产量及沉淀水平之间进行皮尔逊相关性分析。
      3. 将这些数据绘制成热图。寻找与理想结果相关的组分和条件。
    6. 衍射分析。
      1. 通过X射线衍射实验，确认在步骤1.1.5中确定的条件下生长的晶体是否适用于序列晶体学。
      2. 将每种已确定条件下获得的内切天冬氨酸蛋白酶晶体样品装载到支撑物上，以便在100 K或293 K下进行数据收集，并开展X射线衍射实验。若在低温条件下操作，使用25%乙二醇作为冷冻保护剂。
      3. 处理这些数据 通过 合适的软件套件。内切蛋白酶晶体的衍射分辨率应达到1.5 Å以上 Å检查是否存在孪晶，因为孪晶会显著增加序列晶体学数据处理的复杂性。
      4. 如果晶体为单晶且衍射至1.5 Å Å 进入第2步。如果不符合，则返回第1.1.2步，尝试更多稀疏矩阵筛选，以确定有前景的结晶条件。在完成第1.1.5步和第1.1.6步的分析后，获得的结晶条件为25% (w/v) PEG 6,000、0.1 M Tris-HCl pH 7.0 和 0.15 M MgCl₂2 应已找到近似理想条件。

2. 转换至批量培养

  1. 形貌图实验
    1. 制备微晶种子储备液。
      ​注意：制备晶种储备液时，最好使用专门为该目的培养的晶体来制备晶种，这将极大提高实验的可重复性。在步骤 2.1.1.1 至 2.1.1.11 中提出的其他建议包括：始终使用来自标准数量孔（此处为 5 个孔）中生长的晶体，并在制备完成后对储备液进行分装，以避免冻融循环。
      1. 在96孔结晶板的各孔中加入结晶缓冲液：25% (w/v) PEG 6,000、0.1 M Tris-HCl pH 7.0 和 0.15 M MgCl₂2.
      2. 使用液体处理机器人，将200 nL解冻后的70 mg/mL内切蛋白酶和200 nL储液分别加入每个孔中的单个子孔内。加入结晶缓冲液后，将蛋白质溶液与储液混合3次。
      3. 密封培养板并静置24小时。
      4. 用 250 填充一个 1.5 mL 离心管 µL 结晶缓冲液和 10–15 个 1 mm 玻璃珠。将离心管置于冰上冷却 5–10 分钟。
      5. 选择5个有晶体的孔，用手术刀打开孔，然后使用移液枪头在孔内将晶体碾碎。
      6. 吸液 1 µ从冰冻的离心管中取出缓冲液，用于匀浆研碎的晶体悬液。待悬液均匀后，抽吸全部悬液并收集至冷却的离心管中。
      7. 对每个5个子孔重复步骤2.1.2.6。
      8. 将含有缓冲液、汇集的晶体悬液和珠子的离心管在1000 rpm下涡旋30秒。
      9. 将离心管放回冰上静置30秒。
      10. 重复步骤 2.1.2.8 和 2.1.2.9 两次。
      11. 种子储备液现已准备就绪，可分装为10 µL批次并储存在-20 °C.
    2. 进行形态图实验。
      1. 制备一个2滴式96孔网格筛选板。沿板的列方向改变PEG 6,000的浓度，范围为5%至40%（w/v），同时保持缓冲液和盐的浓度分别为0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）和0.15 M MgCl₂。2分别。
      2. 在0.1 M醋酸钠（pH 4.6）中配制内孢霉蛋白酶从100至12.5 mg/mL的连续稀释液，共8个梯度。每行孔板使用不同浓度的内孢霉蛋白酶。
      3. 使用液体处理机器人，向1号和2号副孔中各加入150 nL的endothiapepsin。在1号副孔中，加入150 nL的井溶液。在2号副孔中，多次吸取50 nL解冻的晶种储备液和100 nL的井溶液，然后将两者加入蛋白质溶液中。加入结晶缓冲液后，混合溶液3次。
      4. 密封培养板并在20 °C下静置 °每隔 0、3、6、12、18、24 小时拍摄图像，然后在第一周内每天拍摄，之后四周内每周拍摄一次。如果无法自动成像，可不必在意第一天的每小时成像。
  2. 形貌图分析
    1. 观察24小时后拍摄的图像，估算每个孔中晶体的数量，并将这些估算值记录在 "形态图生成器" 请使用提供的工作表进行估算。这些估算无需十分精确；若存在大量微晶，逐一计数并不现实，也无必要。主要应确保整块板上的估算结果具有一致性。
      ​注意：24小时规则是基于Beale的观察结果得出的 等 (2019)26. 蒸气扩散结晶条件可能需要数天至数周才能达到平衡。快速出现的晶体更有可能是在非平衡状态下生长的 通过 一种批量过程，而非通过液滴组分的逐步平衡实现。因此，24小时这一标准在一定程度上是任意的，批量实验与蒸汽扩散实验之间确切的时间分界点将取决于具体条件的混合物[参见Beale 等人 (2019)26 详见完整说明。
    2. 在指定的输入框中填入内切蛋白酶和聚乙二醇6000的起始浓度。
    3. 该工作表将自动以传统相图形式绘制结果，其中横轴和纵轴分别为沉淀剂和蛋白质浓度 x 和 y 分别对应坐标轴。仅在接种滴中产生晶体的孔位条件表明相图的亚稳态区（透明蓝色），而在接种滴和非接种滴中均产生晶体的条件则表明成核区（实心绿色）。
      ​注意：理想情况下，图中应包含大部分成核区域（即，图底部应有一些清晰的孔，且在高蛋白和高沉淀剂浓度下应可见沉淀物。如果情况并非如此，可考虑重复实验，但提高蛋白和/或沉淀剂的浓度（如果可行）。
    4. 如果晶体在24小时内出现，则进入步骤2.3.1；否则进入步骤2.4，继续优化以实现批量生长。
  3. 晶体分析
    1. 如步骤1末尾所述，在进入下一步之前，需确保这些晶体具有理想的形态和衍射质量。关于形态，晶体是否明显无孪晶，且以单晶形式生长，而非呈针束状或扇状结构？ 关于衍射，应尽可能收集晶体的衍射数据。如果这些晶体无法产生衍射，那么在更大体积下生长的晶体产生衍射的可能性也极低。
    2. 将来自形态图实验的内切蛋白酶晶体样品装载到支撑物上，以便在100 K或293 K条件下进行数据收集，并开展X射线衍射实验。若在低温条件下操作，使用25%乙二醇作为冷冻保护剂。
    3. 处理这些数据 通过 合适的软件套件。内切蛋白酶晶体的衍射分辨率应优于1.5 Å Å在晶体样品中 观察晶胞尺寸、总观测次数和镶嵌度；这些参数可反映衍射晶体的均一性。
    4. 如果晶体形态和衍射质量足够理想，则进入第3步。
  4. 优化晶体生长时间。
    注意：形态图分析（步骤 2.2）将给出结晶起始点的提示（即， 相图中该区域 液滴位于亚稳区还是溶解度线以下（即沉淀剂与蛋白质溶液混合时液滴的位置）？批量结晶起始于成核区。图1C）。此步骤的目标是将这一起始点从溶解度线以下或亚稳区移动至成核区（图1D如果步骤2.2中的接种液滴迅速产生了晶体，则表明该液滴混合物已处于亚稳区；否则，该液滴很可能未达到过饱和状态。
    1. 优化晶体生长时间。
      1. 使用与步骤 2.1.3 相同的筛选试剂盒，在 3 滴式 96 孔板中制备一个蒸气扩散结晶实验。
      2. 提高内切天冬氨酸蛋白酶（endothiapepsin）的起始蛋白浓度 y 轴即，可进一步浓缩蛋白质，例如内切天冬酶可浓缩至120 mg/mL。
      3. 进行连续稀释，如步骤 2.1.3.2 所述，使板的每一行包含依次降低的蛋白质浓度。
      4. 在板上的三个液滴中分别使用不同的液滴比例：1:1、1:2 和 2:1，即蛋白质：沉淀剂。
      5. 在第1天的0、3、6、12、18、24小时观察或成像该培养板，随后在第一周内每天观察或成像一次，之后四周内每周观察或成像一次。如果无法自动成像，第1天的小时级成像可忽略。
      6. 确定产生晶体出现速度最快的液滴，并以此作为重复优化的起点，直至晶体在24小时内生长出来。
      7. 当确定了一种快速出现晶体的条件后，返回步骤2.1，重新绘制形态图，作为开始放大的前奏。

3. 放大

  1. 分级放大路线在此阶段，无需确定单一的放大路径，只需识别并排序各种可行方案，以便依次进行探索。在放大过程中，随着批量混合物体积的增加，成核速率和晶体尺寸分布将发生变化。然而，通过在增大放大体积的同时精细调整各组分浓度，可克服这些问题。
    ​注意：步骤 3.1.1 和 3.1.2 描述了如何根据形态图判断采用批量法还是接种批量法更为合适。
    1. 直接批量实验方案
      1. X 是吗n 在成核区，晶体形成是否与蛋白质和/或沉淀剂浓度成正比？ 即 是否 Xn 随着沉淀剂和/或蛋白质浓度的增加而增加吗？是？进入步骤 3.1.1.2。 否？进入步骤 3.1.2。
      2. 寻找能够产生所需尺寸晶体的条件，并进入步骤 3.2。
    2. 接种-批量法实验方案
      1. X 是吗n 在整个成核区是否均匀？ 即， Xn 既不随沉淀剂浓度也不随蛋白质浓度的增加而增加。
      2. 找到能产生所需尺寸晶体的接种条件，并进入步骤 3.2。如果所有晶体均过大，则进入步骤 3.1.2.3。
      3. 重复形态图实验（步骤 2.1），但此次增加接种孔中所用晶种储备液的浓度。可通过在制备晶种储备液时使用更多的晶体来提高其浓度。例如，在步骤 2.1.1.5 中，不再使用 5 个孔，而是使用 10 个孔。
      4. 在0、3、6、12、18、24小时时间点观察或成像该培养板。
      5. Xn 应有所增加且Xs 在接种的液滴中晶体尺寸减小。如果需要更小的晶体，可重复此循环，然后进行接种的批量培养实验。
  2. 逐步放大
    1. 在96孔板中进行放大从内切蛋白酶的形态图出发，采用一种直接批量法，结晶条件为 0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl₂、30% (v/v) 2-甲基-2,4-戊二醇。2，最初选择30%（w/v）PEG 6,000用于放大。将100 mg/mL的endothiapepsin与结晶缓冲液按1:1比例混合。
      1. 在96孔坐滴板的2-3个孔中，每孔加入100 µL reservoir溶液 µ0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl₂ 的 L2，以及30% (w/v) PEG 6,000。
      2. 使用新解冻的100 mg/mL内切蛋白酶溶液，分装0.5 µL 蛋白质和 0.5 µ每孔加入 L 沉淀剂， 密封并在20℃下保存°C.
      3. 在最初的 0、3、6、12、18、24 小时内观察或成像检测平板。记录 X 范围内的任何变化s 和 Xn.
      4. 如果发生改变，重复步骤 3.2.1.1 至 3.2.1.2，但增加或减少蛋白质、沉淀剂和/或晶种浓度，以将任何变化恢复至 X 范围内s 和 Xn.
      5. 当 X 的范围s 和 Xn 可接受，则进入步骤 3.2.2。
    2. 在24孔悬滴板中进行放大培养
      1. 用真空脂涂抹24孔悬滴板单个孔的边缘，以准备一个孔。
      2. 配制 0.5 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）、0.15 M MgCl2，以及 30% (w/v) PEG 6,000，并填充涂油的孔洞。
      3. 使用新解冻的endothiapepsin溶液，用移液器吸取1 µ将蛋白质溶液滴加到玻璃盖玻片表面。用移液器吸取1 µ将100 µL结晶缓冲液加入蛋白液滴中，并用移液枪混匀。
      4. 在0、3、6、12、24小时时间点观察或成像该培养板，记录X范围内发生的任何变化s 和 Xn.
      5. 如果发生改变，则重复步骤 3.2.2.1 至 3.2.2.4，但增加或减少蛋白质、沉淀剂和/或晶种浓度，以将任何变化恢复至 X 范围内s 和 Xn.
      6. 当/如果X的范围s 和 Xn 可接受，则继续进行步骤 3.2.2.7。
      7. 重复步骤 3.2.2.1 至 3.2.2.5，逐步将实验总体积增加至 10 µL.
      8. 达到10 µL体积后 µL 或更大时，进入 3.2.3 步骤的离心管操作。
    3. 离心管中的放大培养
      注意：内切蛋白酶 batch 条件的优化主要发生在 200 µL 体积的阶段。 µL体积（见结果，放大）。该过程起始于0.1 M Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl₂2，以及 30% (w/v) PEG 6,000。然而，最终 PEG 浓度调整为 40% (w/v)。同时需要使用晶种来控制 Xn，并防止晶体生长过大，必须终止晶体生长。步骤 3.2.3.1 至 3.2.3.7 详细说明了条件优化的过程。步骤 3.2.4 描述了最终的批量实验方案。
      1. 配制1 mL结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl₂2，以及 30% (w/v) PEG 6,000。
      2. 使用 freshly defrosted 的 100 mg/mL endothiapepsin，加入 25 µ将蛋白溶液加入1.5 mL离心管中。
      3. 用移液枪头将结晶缓冲液与蛋白质溶液按1:1比例充分混匀。将离心管置于摇床上，以20℃剧烈振荡混合 °C.
      4. 定期（5、10、30、60 分钟，2、5、10、24 小时）取 2.5 µL 的等分试样，用血细胞计数板观察。记录 Xn 和 Xs 范围。
      5. 若发生改变，重复步骤 3.2.3.1 至 3.2.3.4，但调整蛋白质、沉淀剂和/或晶种浓度，以使任何变化恢复至 X 范围内s 和 Xn
      6. 当 若 Xs 和 Xn 的范围可接受，则进入步骤 3.2.3.7。
      7. 重复步骤 3.2.2.1 至 3.2.2.5，逐步将实验总体积增加至 200 µL 或更大，根据需要而定。
    4. 最终接种-批量法方案
      1. 制备晶种储备液。
        1. 配制 2 mL 结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl₂2，以及 40% (w/v) PEG 6,000。
        2. 使用 freshly defrosted 的 100 mg/mL endothiapepsin，加入 100 µ将蛋白溶液加入1.5 mL离心管中。
        3. 用移液枪头将结晶缓冲液与蛋白质溶液以1:1比例充分混匀。将离心管置于摇床上，以20℃高速振荡混合 °C下孵育24小时以使50 µm晶体生长。
        4. 向50中加入10-15个1 mm玻璃珠 µ微晶悬浊液
        5. 将含有悬浊液和珠子的离心管在1000 rpm下涡旋30秒。
        6. 将离心管放回冰上静置30秒。
        7. 重复步骤 3.2.4.1.5 和 3.2.4.1.6，再进行 10 次。
        8. 这现在 200 µL 的 1x 种子储备液。通过加入 1.8 mL 结晶缓冲液将种子储备液稀释 10 倍。将 10x 种子储备液分装至 50 µL批次并储存在-20 °C.
      2. 接种-批量法实验方案。
        1. 配制结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl₂2，以及 40% (w/v) PEG 6,000。
        2. 在离心管中，混合 100 µL结晶缓冲液与50 µ新鲜解冻的10x晶种储备液L
        3. 使用新解冻的100 mg/mL内切蛋白酶，加入150 µ将 L 的蛋白质加入 1.5 mL 离心管中。
        4. 用移液枪头将结晶缓冲液/晶种混合物与内切天冬酶溶液充分混匀，然后将离心管置于摇床或旋转仪上，在20℃下高速振荡。 °C.
        5. 通过定期取样 2.5 µL 进行结晶过程的监测 µL等分试样，使用血细胞计数板观察晶体，并记录Xn 和 Xs 范围。
        6. 大约 80 分钟后，当晶体达到 Xs 15 的 µm，通过加入150 µ0.05 M 醋酸钠 pH 4.6、0.05 M Tris-HCl pH 7.0、0.075 M MgCl₂ 的 L2，以及20% (w/v) PEG 6,000（由内切天冬氨酸蛋白酶缓冲液与结晶缓冲液按1:1混合组成的溶液）。
        7. 将晶体储存在 20 °C.
      3. 该方案是否已产生适用于预期实验的可接受晶体尺寸范围和数量？是 完成- 否——返回步骤 3.1，尝试另一种放大方案。例如，可尝试不同的蛋白质：沉淀剂比例，或此前未进行过时可加入晶种。当所有这些方法均无法奏效时，可能需要返回步骤 1 寻找新的结晶条件。

结果

优化晶体形态
步骤1：优化晶体形态，旨在提醒读者其重要性。尽管有可能从衍射性能较差的针状晶体团中获得理想的微晶，但作者建议应分别优化这两个方面。首先，寻找能够产生衍射质量良好、单一体晶体的条件 通过 蒸气扩散法，然后将这些条件转化为批量反应，而不是尝试将两个步骤合并在一起。在此阶段，发现高成核条件并非必要；主要目标是获得良好的晶体形貌和衍射质量。

在开始内切蛋白酶的微晶化之前，对来自PDB数据库中已收录结构的结晶条件进行了分析。在48个内切蛋白酶的结构收录中，有47个可以获得其结晶条件和大致的实验方案。这些条件总体上均基于Moews和Bunn（1970年）首次进行的内切蛋白酶结晶实验46。鉴于这些条件具有相似性且源于“经典”方法，因此采用96孔板的气相扩散稀疏矩阵筛选法，以探索更广泛的结晶条件。将内切蛋白酶浓缩至70 mg/mL，并在96孔坐滴板中于20 °C下进行PACT稀疏矩阵筛选47，每孔将100 nL蛋白溶液与100 nL储液混合。该实验中所有条件在36小时后均产生了晶体。然而，对晶体形态的分析表明，某些条件可能更有利于微晶化的优化。

图4A 显示了PACT筛选中具有代表性的液滴，这类情况在整块板中普遍存在。初看之下，这些晶体可能看似值得进一步优化以用于微晶结晶。晶体尺寸较大，且似乎存在显著的成核现象。然而，整体晶体形态并不理想。首先，晶体并非明显的单晶，而是从单一成核点生长出多个晶体。其次，晶体尺寸高度不对称，主要沿单一轴向生长。这类晶体在送入X射线束时理论上更容易发生优先取向。这两种特性都会在串行晶体学数据的收集和处理过程中带来问题。

图4B，显示了在MgCl2存在下生长的内切蛋白酶晶体。所有含MgCl2的条件均产生一致的晶体形貌，因此表明该形貌由MgCl2引起。含MgCl2的条件生成了单一、更接近立方体形态的晶体，更适合作为最终串行实验的理想目标。

PACT 筛选中包含四种含有 MgCl2 的条件。为了更好地理解这些条件中各组分对内切蛋白酶结晶的影响，进行了随机优化。设计了一个筛选方案，其中包含不同浓度和 pH 值范围内的缓冲液和沉淀剂的随机组合。同时改变了 MgCl2 的浓度，然后根据晶体外观质量和沉淀程度，将所得液滴随意分为 0-5 级（0 表示无晶体或无沉淀）。

图5A展示了降水水平与晶体质量以及筛选变量之间皮尔逊相关性分析结果的热图（本实验中液滴的示例见图5B、C和D）。结果表明，溶液的pH值与沉淀水平高度相关，碱性缓冲液导致更多的沉淀。MgCl2浓度与沉淀水平呈轻微相关，而pH值和沉淀剂浓度则与晶体质量相关。

根据这些结果，决定将生长在 0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、20% (w/v) PEG 6,000 条件下的晶体推进至实验方案的下一步——转为批量培养。晶体形态可接受，且对这些晶体的X射线衍射及数据质量指标的分析表明，在有无 Mg2+ 条件下生长的晶体之间无显著差异（图9）。

向批量法过渡
对于许多序列晶体学微晶优化实验而言，第2步将是起点。目标蛋白此前已通过悬滴扩散法完成结晶，用于冷冻晶体学研究，现在需要将该结晶方案转化为生成微晶悬液的批量法。本方案仅使用96孔悬滴扩散板进行向批量法的转化，因为目前蛋白质数据库（PDB）中95%的条目所采用的结晶方法均为悬滴扩散法26。本方案未涉及向微量批量法（microbatch）34,35,37的转换，因为此类转换可能仍需类似的优化过程。但这并不意味着本方案只能在悬滴扩散板中进行；如果原始结晶方法为微量批量法，则本方案所列的所有步骤在该体系中同样适用。

为了评估内切肽酶在选定条件下的结晶情况，创建了一个形态图（或称粗略的相图）。形态图实验的目的有三：首先，对形态图的分析在评估第三步中的放大路线时具有重要价值； 缩放其次，形态图可作为优化工具，有助于发现能够产生晶体的蒸气扩散条件 通过 批次即， 快速出现的晶体（< 24 h）]。第三，如果晶体未能迅速出现，对接种后的液滴进行分析可使晶体学家大致判断当前条件在相图中的位置。例如，若接种的条件产生了晶体，而未接种的条件没有产生晶体，则这些条件很可能位于亚稳区。

内切天冬酶的形态图实验基于以下条件进行：0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、20% (w/v) PEG 6,000。蛋白质浓度范围为100至12.5 mg/mL，PEG浓度范围为5%至40% (w/v)。通过所提供的工作表对液滴进行分析并绘制结果（图6A）。

从那时起，这一点已经很明显 优化晶体形态 在此条件下，且在这些蛋白质浓度下，内切天冬氨酸蛋白酶晶体的生长将在24小时内完成。这表明结晶过程正在发生 通过 一个批次过程，而非由蒸气扩散驱动的过程。因此，在这些条件下生长的晶体适合放大至更大体积的规模。

如果在24小时后未观察到未接种晶种的液滴中有晶体形成，则表明结晶过程可能仍依赖于成核转变（图1B），因此不属于批量结晶。在这种情况下，形态图实验的结果仍然具有参考价值。这些结果可提示相图上结晶可能起始的位置，从而指导后续优化实验的进行。观察接种晶种的液滴：晶种能够在亚稳态区域促进晶体生长，而无需依赖成核过程。例如，若在接种晶种的液滴中24小时内出现晶体，而在未接种晶种的液滴中未出现晶体，则表明可观察到部分亚稳态区域的存在。如果在接种和未接种晶种的液滴中均未观察到晶体，则说明所有孔位仍处于未饱和状态。

放大实验
通过观察形态图（图6A），可以得出若干结论。成核数量似乎同时受到蛋白质浓度和沉淀剂浓度的影响。此外，不同液滴的结果之间存在非常清晰的界限：液滴中要么无任何产物，要么形成晶体，要么出现沉淀物（图6B）。加入晶种后（图6D），与未加晶种的液滴（图6C）相比，Xn 值显著提高。综合以上所有结果，决定尝试在30% (w/v) PEG 6,000 和 100 mg/mL 内切蛋白酶条件下，放大批次反应及加晶种的批次反应流程。

初步的放大实验在24孔悬滴板中进行。逐步增加液滴体积，以便观察结晶行为的任何变化（图7）。如图所示，无论是未接种的液滴还是接种的液滴均发生了晶体生长。所有未接种的液滴中均生长出不同尺寸的晶体，但主要为大尺寸晶体（100–200 µm —— 最长维度）。然而，接种的液滴则产生了较小的晶体（5–50 µm —— 最长维度）。这些初步实验表明，需要使用晶种来降低Xs，同时也表明该条件适用于较大体积的实验。

当体积增加200 µL时，在晶体生长过程中持续振荡结晶体系。振荡的主要目的是确保结晶溶液保持均一，防止生长中的晶体沉降在管底或管壁上。晶体沉降可能导致晶体群体不均一，出现大小差异显著的晶体。振荡结晶溶液还可促进成核44,45。

遗憾的是，未接种的30% (w/v) PEG 6,000未产生任何晶体，因此将PEG浓度提高至35% (w/v)。这一调整显著改善了结晶效果，最终Xn和Xs分别为3.6 ± 1.2 × 106 crystals·mL-1和42 ± 4.1 µm（图8A 和 B - 黑色）。尽管结晶效果已有显著提升且晶体浓度达到可接受水平，但最终晶体尺寸对于计划中的实验而言过大，因此进一步开展了优化。为减小最终晶体的尺寸，探索了两条途径（图1E）：降低蛋白质浓度以尝试限制晶体的最终生长（图8A 和 B - 亮粉色）；提高PEG浓度以尝试增加成核数量（图8A 和 B - 绿色）。

不幸的是，降低蛋白质浓度也显著降低了Xn，最终导致晶体尺寸更大。将PEG浓度提高至40%后，最终Xn和Xs分别为3.1 ± 0.7 × 106 个晶体·mL-1和39 ± 2.3 µm。该结果与35%浓度条件相比无显著差异，但由于最终晶体尺寸减小，因此在后续优化中继续采用此条件。

为了增加 Xn，加入了晶种。这显著提高了 Xn（1.1 ± 1.8 × 108 个晶体·mL-1），并导致 Xs 减小（4.2 ± 4.0 µm）（图8A 和 B— 紫色虚线）。这些晶体虽然非常适合某些序列晶体学实验，但被认为尺寸过小，因此调整了所加晶种的浓度。

然而，添加晶种的调控过程被证明难以稳定重复，因此尝试了淬灭法。在加入晶种后，监测晶体尺寸，一旦达到合适的晶体尺寸（约10 - 20 µm），即对批次结晶进行淬灭（图8C 和 D）。关于微结晶，淬灭法曾在Kupitz等（2014）的研究中被提出25。尽管该方法可能并非理想选择，因为最终会浪费部分蛋白溶液26，但在本实验情境下该技术非常有用，因为晶体生长难以控制。淬灭的基本原理是将结晶混合物迅速恢复至溶解度曲线稍上方的位置（图1F）。一旦溶液回到溶解度曲线处，即重新达到稳定的饱和状态，晶体将不再继续生长。

尝试淬灭结晶反应并非没有风险。如果加入的淬灭溶液过多，溶液中的蛋白质可能会被过度稀释，导致穿过溶解度线。在这种情况下，溶液将变为欠饱和状态，晶体将开始溶解。为防止此情况发生，可根据形态图结果估算所需淬灭溶液的量。在淬灭时，记录蛋白质溶液的浓度，通过比较溶解度线处的蛋白质浓度与溶液中的实际蛋白质浓度，即可估算出所需的稀释倍数。

40% (w/v) PEG 6,000 经 10 倍稀释的淬灭种子实验，最终获得的晶体浓度和尺寸范围分别为 2.6 ± 3.1 x 106 crystals·mL-1 和 15 ± 3.9 µm。

在整个过程中，使用瑞士光源PXII光束线对内切蛋白酶晶体进行X射线数据采集，光束尺寸为10 × 30 µm 聚焦，能量为12.4 keV，衰减80%，并在低温条件下进行。数据使用dials处理 图9 显示了CC的比较½. CC 中无显著变化½ 在优化过程中观察到。

蛋白质结晶相图，显示沉淀、成核、亚稳态和溶解度。
图1：过渡结晶与分批结晶的概述，以及在相图上标示的放大方法。A. 蛋白质结晶相图的典型区域与边界。沉淀剂浓度和蛋白质浓度分别绘制在横轴和纵轴上。 x 和 y 分别以轴表示，原点为纯水点。紫色线表示蛋白质过饱和边界，亚稳区、成核区和沉淀区分别以蓝色、绿色和粉色表示。 B. 一种“过渡相”结晶方法（如蒸汽扩散法）的成核区渗透极限示例。在此理论实验中，液滴中的沉淀剂和蛋白质浓度初始值略低于溶解度线——尚未达到过饱和状态。随着液滴逐渐平衡，其组分浓度不断上升，使液滴进入过饱和状态，并持续向成核区移动或过渡。一旦晶体开始成核，溶液中的蛋白质浓度即开始下降。随着晶体生长，浓度持续降低，直至最终停止在溶解度线上。蓝色虚线标记了进入成核区的理论极限。一旦成核开始，蛋白质浓度即会下降，从而阻止进一步渗透。 C. 批量结晶与接种批量结晶过程示例。在批量结晶中，蛋白质与沉淀剂的混合必须在成核区内形成过饱和溶液，以促使晶体生长。而在接种批量结晶中，由于加入了微晶种，不一定需要处于成核区，因此也可探索亚稳区内的条件。 D. 所示结晶实验的假设优化方案 B 从蒸气扩散法转向批量法。最初的蒸气扩散起始方法已发生转变， 通过 将所得优化向量应用于成核区内的新起始位置。该向量是两次优化的结果：蛋白质浓度和沉淀剂浓度均有所增加。 E. 扩大批量条件时的优化示例以定制最终 Xn 和 Xs. F. 通过加入结晶缓冲液终止结晶实验。关键在于，淬灭过程不能使蛋白质浓度脱离亚稳态区域，从而低于蛋白质过饱和点；否则，晶体将开始重新溶解到溶液中。 B. 和 C. 改编自 Beale 等（2019）26 经作者许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。

结晶分析图；显示成核事件与晶体尺寸和数量的关系。
图 2：提高 Xn 并降低 Xs。 结晶实验中所得晶体数量与其平均最长尺寸之间的理想化关系。绘制该图时采用了一种假设的10 kDa模型蛋白的结晶过程。该蛋白在10 mg/mL浓度下结晶，得到空间群为P212121的晶体，晶胞尺寸为49×50×51 Å。假设每次成核事件均产生一个晶体，且晶体从各个晶面均呈均相生长。请点击此处查看该图的放大版本。

晶体形态优化流程图；用于高分辨率晶体生长过程的示意图。
图3：流程图显示了将小体积（<500 nL）的蒸气扩散实验中生长的晶体优化为大体积（> 100 µL）批量实验晶体的步骤。 晶体优化分为三个阶段：（1）优化晶体形态；（2）过渡到批量法；（3）放大。在第一阶段，重要的是识别适用于微晶实验的合适晶体。某些蛋白质无论在何种结晶条件下都仅呈现一种晶体形态。然而，应努力寻找能够产生单一、类立方体晶体的条件，或尽可能接近此类形态的条件。从理论上和经验上来看，单一且类立方体的晶体通常在序列晶体学实验中获得更优的结果。一旦选定晶体形态并确认其衍射能力，就需要将结晶实验从蒸气扩散法过渡到批量法（第二阶段）。在此阶段，应根据成核时间对晶体进行优化。目标是找到能快速形成晶体（> 24 h）的条件，因为这些条件很可能直接进入成核区，因而适用于批量法。一旦确定了处于成核区的条件，便可构建形态图（morphogram）。形态图可用于绘制大部分成核区范围，并识别出第三阶段可能的放大路径。随后，可逐步或迅速放大所确定的批量条件的体积，最终达到 >100 µL 的体积。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结晶实验；A：SPG，PEG 1500；B：HEPES，MgCl2，PEG 6000；显微镜图像。
图4：来自PACT稀疏矩阵筛选的内切天冬氨酸蛋白酶结晶条件分析。A. 和 B. 分别为PACT筛选中A4孔和C10孔在24小时后的照片。图中已标示出结晶缓冲液的组分。SPG缓冲液由琥珀酸、磷酸二氢钠和甘氨酸按2:7:7的摩尔比混合而成。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结晶过程；沉淀水平、晶体质量；实验结果；不同pH值、MgCl2条件。
图5：基于PACT MgCl2条件的内切蛋白酶结晶优化分析。A. 缓冲液pH值、MgCl2浓度与沉淀剂浓度同沉淀水平及晶体质量之间的皮尔逊相关性分析热图。沉淀水平和晶体质量均在24小时后根据0-5的任意评分标准进行评估（0表示无晶体或沉淀）。B. C. 和 D. 展示了三个不同液滴中结晶与沉淀的示例，同时显示了结晶条件以及对沉淀水平和晶体质量的评估结果。请点击此处查看该图的放大版本。

结晶相图、显微镜图像；蛋白质成核、PEG沉淀。
图6：内切天冬氨酸蛋白酶在0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）、0.15 M MgCl2 和 PEG 6,000 条件下结晶的形态图。A. 使用所提供的“相图生成器”电子表格创建的形态图。每个液滴中晶体的相对数量由圆圈的大小表示，液滴1（蛋白质和沉淀剂）和液滴2（蛋白质、沉淀剂和晶种）的结果分别以绿色和蓝色突出显示。x 轴和 y 轴上的蛋白质和沉淀剂浓度值表示各组分预混后的浓度，而非最终体积。根据实验结果，已用黑线和紫线分别标示出成核区和亚稳区的边界。B. C. 和 D. 展示了该实验的一些典型结果。A. 中标记的红色和蓝色点分别对应 B.、C. 和 D. 的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

结晶过程、显微图像、不同体积、晶体形成、显微分析。
图7：内切蛋白酶在24孔悬滴板中的初步扩量结晶试验。 所有试验均使用相同的蛋白质和沉淀剂浓度：100 mg/mL 内切蛋白酶溶于0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 4.6）和0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、0.15 M MgCl2，以及30% (w/v) PEG 6,000。所有图像均在24小时后拍摄，各图像中标注了液滴的最终体积。左侧面板（A、D 和 G）为蛋白质与沉淀剂按1:1比例混合的结果，中间面板（B、E 和 H）为晶种、沉淀剂与蛋白质按1:2:3比例混合的结果，右侧面板（C、F 和 I）为中间面板的放大图像。请点击此处查看该图的放大版本。

晶体生长动力学、浓度随时间变化、淬灭点分析、图表、PEG 溶液。
图 8：内切蛋白酶微晶在 200–300 µL 体积中的结晶过程分析。A 和 C 显示实验过程中 Xn 随时间的变化情况。B 和 D 显示 Xs（最长维度）随时间的变化情况。为便于清晰展示，实验结果已分别呈现。C 和 D 中的红色虚线表示实施淬灭的时间点。请点击此处查看该图的放大版本。

含 Mg²⁺ 的结晶结果；CC₁/₂ 与分辨率关系图；晶体生长各阶段的显微镜图像。
图9：用于评估衍射质量的微结晶过程中各阶段获得的晶体的 CC½ 结果及图像。A. 根据在不同条件下培养的晶体收集的数据绘制的 CC½ 随分辨率变化曲线：有无 Mg²⁺ 的对比——属于第1阶段优化实验，分别在 200 nL、10 µL 和最终的 300 µL 体积中进行结晶。B.C. 和 D. 分别显示了来自 200 nL、10 µL 和 300 µL 体积的晶体图像。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质信息
蛋白质Endothiapepsin
分子量 (kDa)33.8
空间群P1211
a, b, c (Å)45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)90.0, 109.2, 90.0
固定靶参数
每芯片加载体积 (µL)150
每芯片孔径数25,600
所需晶体浓度 (晶体/mL)500,000
样品信息
制备200 µL样品所用蛋白质质量 (mg)10
晶体最长尺寸 (µm)15
晶体浓度 (晶体/mL)2,500,000
实验变量
所需时间点数量5
每个时间点所需图像数量50,000
命中率 (已积分图谱/采集图像)0.3
每个时间点所需固定靶数量 (向上取整)7
样品需求
每个时间点所需样品体积 (µL)1,050
实验所需总样品体积 (mL)5.25
所需蛋白质总质量 (mg)52.5

表1：使用固定靶标进行假设性光学泵浦-探测实验的样品需求示例。 本理论实验中使用的蛋白质为内切天冬氨酸蛋白酶（endothiapepsin）。固定靶标参数基于Ebrahim 等（2019）48 和Davy 等（2019）49 报道的实验。样品信息来自本视频文章中报告的实验方案，实验变量则根据实际经验进行了保守估算。在此前假设基础上，进一步计算了以下样品需求。

讨论

本文所述方法展示了如何将内切蛋白酶的晶体从稀疏矩阵96孔板中生长的大晶体（最长尺寸≥100 µm）优化为在离心管（300 µL体积）中生长的微晶。 通过 批次。该方案背后的理念是，用于优化内切天冬氨酸蛋白酶的步骤也可应用于其他蛋白质。最终，解决大规模制备（>100 µL 的微晶（10–20 µm），用于在X射线自由电子激光装置（XFELs）和同步辐射光源上进行序列晶体学实验。

该方案将大体积微晶结晶的任务分为三个步骤：（1） 优化晶体形态，（2） 转为批量法，以及（3） 放大规模。在第1步中，应在蒸汽扩散板中探索蛋白质可能形成的晶体形态范围。目标是获得单一、呈方盒状且衍射分辨率达到要求的晶体。在第2步中，可将选定的条件从蒸汽扩散法转换为批量法。此处的优化标准是晶体生长时间，目标是找到能在24小时内形成蛋白质晶体的条件。此外，还可绘制形态图（morphogram），帮助实验者了解溶解度线和成核区边界的可能位置。该形态图在第3步（放大）中具有重要用途，可提示仅通过增加成核数Xn是否足以降低饱和浓度Xs。随着实验体积的增大，Xn和Xs可被持续评估，作为衡量放大成功与否的关键指标。

对于内切天冬氨酸蛋白酶（Endothiapepsin），步骤1发现了一种可能是此前未知的晶体形态。该形态与先前报道的晶体具有相同的空间群，但更重要的是，其形状更接近立方体，这对序列晶体学研究尤为有利。单个晶体似乎从单一成核点生长而成，不同于其他条件下形成的扇状聚集体（图4）。对于所选条件，步骤2已部分满足，因为晶体在<24小时内即完成生长。形态图谱表明，在步骤3的放大过程中，直接批量生长或接种批量生长方案均可能成功。初步采用直接批量法进行放大，所得晶体的数密度（Xn）和尺寸（Xs）分别为3.6 ± 1.2 × 106 个晶体·mL-1 和 42 ± 4.1 µm。尽管这些晶体可用于某些序列晶体学实验，但仍被认为过大，因此进行了进一步优化。最终方案获得的晶体浓度为3.1 × 106 个晶体·mL-1，尺寸为15 ± 3.9 µm，完全符合计划实验的理想要求。

该方法着重于将通过蒸气扩散法培养板生长的“可溶性”蛋白质晶体转化为批量法（batch）。之所以关注这一点，是因为绝大多数可溶性蛋白质晶体均通过蒸气扩散法生长via vapor diffusion26。然而，所述概念也可应用于采用其他方法（如微批量法）生长的可溶性蛋白质晶体。这些概念也可能适用于在LCP中生长的膜蛋白晶体；因为这同样是一种批量结晶过程。

该方案的一个关键方面是将通过蒸气扩散板培养的晶体生长条件转化为适用于批量培养的条件。为实现这一转化，该方法采用了 Beale 等人（2019）提出的标准。26结晶生长 通过 即使在蒸汽扩散板中，批量处理过程也会迅速形成< 24 小时）。该标准是基于蒸气扩散液滴平衡速度的估算，对于聚乙二醇（PEG）类沉淀剂条件最为适用。然而，结晶条件中包含多种多样的化合物，这些化合物会影响平衡所需时间。盐类结晶条件的平衡过程， 例如 高浓度的氯化铵在1-2天内即可发生，因此基于盐类条件下的24小时标准可能并不适用。此外，盐类条件还可能具有更复杂的相图26, 30 可能不符合本方案中所述的标准模式。如果无法扩大至更大体积，则可能需要将基于盐条件的时间标准缩短至12小时或6小时。

该方法的另一个局限性在于其表面上的复杂性。为优化内切蛋白酶微晶结晶所遵循的实验方案，实际上对稀疏矩阵筛选中的原始条件改动较小。在PACT筛选中观察到的首个阳性结果为：0.1 M HEPES（pH 7.0）、0.2 M MgCl2 和20%（w/v）PEG 6,000。最终放大的结晶缓冲液组成为：0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）、0.15 M MgCl2 和40%（w/v）PEG 6,000。此外，缓冲体系由HEPES更换为Tris-HCl以及MgCl2浓度的调整，可能对实验成功贡献甚微。因此，真正的优化可能仅在于PEG 6,000浓度的提高，而这一调整本可以非常简单地实现。

然而，这种评估也过于简单化。它不仅忽略了在放大过程中遇到的问题（即 使用晶种和淬灭），也忽视了一个事实：即使这种蛋白质的放大过程较为顺利，也不能保证下一种蛋白质同样如此。本方案中建议的步骤之所以被制定，是因为优化蛋白质结晶体积的放大过程可能会消耗大量蛋白质。在所示的七次软蛋白酶（endothiapepsin）放大试验中，共消耗了100 mg蛋白质。诚然，其中部分步骤是为了展示在此方案背景下可能产生的结果而进行的。即便如此，100 mg蛋白质，加上实验过程中可能额外消耗的50 mg蛋白质（表1），无论在时间还是经费上都是一笔不小的投入。

幸运的是，并非所有蛋白质都需要如此大量的样品。内皮蛋白酶具有很高的溶解度，因此需要较高的蛋白质浓度才能达到过饱和状态。而对于其他一些蛋白质（目前仍在优化中），在 10 甚至 5 mg/mL 的浓度下即可达到过饱和。这类变量具有蛋白质特异性，出现时需予以充分考虑。

该方法的其他局限性包括依赖复杂的设备，例如用于筛选和制板的液体处理机器人，以及在需要时自动拍摄平板图像的成像仪。已有替代方案可减少对部分设备的需求，但若缺少这些设备，实验流程将更加耗时。本方案还建议测试优化后晶体的衍射能力。对于无法常规使用同步辐射光源的晶体学家而言，这些测试可能具有挑战性。尽管并非每一步骤都必须设置对照，但强烈建议在发现阳性结果后，以及在数据缩放前和缩放后进行这些测试。在X射线自由电子激光装置（XFEL）中，无法衍射的晶体并不罕见。因此，在对晶体衍射能力做出假设时，采取谨慎态度更为妥当。

最终，本文提供的实验方案和结果将为那些在制备用于序列晶体学实验样品方面存在困难的研究人员提供指导、思路和实例。希望随着序列晶体学技术的进一步发展，该技术对样品的需求能够降低，从而减少对这类实验方案的需求。然而，即使在那种情况下，本文所展示的策略对于希望探索其蛋白质结晶条件空间的研究人员而言，仍将具有重要参考价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议第701647号下的资金支持。 衷心感谢瑞士光源X10SA-PXII光束线科学家们提供的协助与支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Swissci 96孔2滴板Molecular DimensionsMD11-00296孔2滴结晶板
Swissci 96孔3滴板Molecular DimensionsMD11-00396孔3滴结晶板
mosquito LCP 液体处理机器人sptlabtechmosquito LCP结晶机器人
ClearVue 密封膜片Molecular DimensionsMD6-01596孔结晶板密封膜
Safe-Tube 1.5 mLEppendorf301200861.5 mL 离心管
手术刀片Swan and MortonNo. 3 手术刀片和 No. 3 刀柄用于切割打开板密封膜的手术刀片
MS 3 涡旋振荡器IKA3319000用于混合溶液及制备晶种储备液的涡旋振荡器
24孔XRL板Molecular DimensionsMD3-1124孔悬滴结晶板
试管旋转混合仪/旋转器Thermo Fischer Scientific88881001扩增过程中用于混合溶液的试管旋转仪
Eppendorf Research plus 移液器Eppendorf手动移液器系列，0.5–10、1–20、10–100、100–1000 µL
Eppendorf 移液器吸头Eppendorf适用于手动移液器的各种吸头规格
Suparen 600Prochem AGSuparen 600内切蛋白酶溶液
乙酸钠Sigma-Aldrich241245-1KG乙酸钠
TrisMerck8382T014Tris
氯化镁Sigma-AldrichM2670-1kg氯化镁
PEG 6,000Sigma-Aldrich81255-1kgPEG 6,000
乙二醇Sigma-Aldrich324558-1L用于晶体低温保护的乙二醇
PACT Premier HT 筛选试剂盒Molecular DimensionsMD1-36PACT Premier 96孔晶体筛选板
DOW CORNING 高真空润滑脂Molecular DimensionsMD6-02用于密封24孔板的润滑脂
Hirschmann 22 × 22 mm 玻璃盖玻片Hirschmann8000104用于密封24孔坐滴板的盖玻片
晶体取样针PSI自制微小晶体的薄膜支撑装置
1–1.3 mm SiLibeads Type SFaust6239547用于制备微晶种储备液的玻璃珠
Macbook ProAppleMacbook Pro用于数据分析的计算机
CCP4 软件套件CCP4衍射图样数据处理软件
ExcelMicrosoftMicrosoft Office相图绘制工具
Hausser Scientific Bright-Line 计数室Thermo Fischer Scientific02-671-51B用于计算晶体浓度的工具
PACT PremierMolecular DimensionsMD1-29-ECO稀疏矩阵结晶筛选试剂盒
Rock ImagerFormulatrixRock Imager温控晶体板储存与成像系统
Rock MakerWebFormulatrixRock MakerWeb晶体板制备与图像存储软件
FormulatorFormulatrixFormulator96孔晶体筛选板制备液体处理机器人
Leica MZ16 显微镜LeicaLeica MZ16光学显微镜
LAS V4.6LeicaLAS V4.6Leica 显微镜配套软件
Spectra/Por 3.5 kDa 透析管SpectrumlabsSpectra/Por 3 透析膜3.5 kDa 透析膜
透析管封口夹SpectrumlabsSpectra/Por 3 通用封口夹用于密封透析管末端的夹子
Amicon 10 kDa 离心浓缩管Merck-MilliporeAmicon Ultra-15 10 kDa 离心浓缩管10 kDa 离心滤膜
5810 R 摆桶式离心机Eppendorf5810 R 离心机摆桶式离心机

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