Name: 优化用于连续晶体学实验的内硫肽晶体的生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解用于连续晶体学实验的内硫肽晶体优化生长方法。该方案将小规模气相扩散技术转化为大规模批量微结晶技术，利用液体处理机器人和形态图分析优化结晶条件，为结构生物学研究提供可靠的微晶制备框架。

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本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议第701647号下的资金支持。&#160;衷心感谢瑞士光源X10SA-PXII光束线科学家们提供的协助与支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法展示了如何将内切蛋白酶的晶体从稀疏矩阵96孔板中生长的大晶体（最长尺寸≥100 µm）优化为在离心管（300 µL体积）中生长的微晶。 通过 批次。该方案背后的理念是，用于优化内切天冬氨酸蛋白酶的步骤也可应用于其他蛋白质。最终，解决大规模制备（&#62;100 µL 的微晶（10–20 µm），用于在X射线自由电子激光装置（XFELs）和同步辐射光源上进行序列晶体学实验。
该方案将大体积微晶结晶的任务分为三个步骤：（1）&#160;优化晶体形态，（2）&#160;转为批量法，以及（3）&#160;放大规模。在第1步中，应在蒸汽扩散板中探索蛋白质可能形成的晶体形态范围。目标是获得单一、呈方盒状且衍射分辨率达到要求的晶体。在第2步中，可将选定的条件从蒸汽扩散法转换为批量法。此处的优化标准是晶体生长时间，目标是找到能在24小时内形成蛋白质晶体的条件。此外，还可绘制形态图（morphogram），帮助实验者了解溶解度线和成核区边界的可能位置。该形态图在第3步（放大）中具有重要用途，可提示仅通过增加成核数Xn是否足以降低饱和浓度Xs。随着实验体积的增大，Xn和Xs可被持续评估，作为衡量放大成功与否的关键指标。
对于内切天冬氨酸蛋白酶（Endothiapepsin），步骤1发现了一种可能是此前未知的晶体形态。该形态与先前报道的晶体具有相同的空间群，但更重要的是，其形状更接近立方体，这对序列晶体学研究尤为有利。单个晶体似乎从单一成核点生长而成，不同于其他条件下形成的扇状聚集体（图4）。对于所选条件，步骤2已部分满足，因为晶体在&#60;24小时内即完成生长。形态图谱表明，在步骤3的放大过程中，直接批量生长或接种批量生长方案均可能成功。初步采用直接批量法进行放大，所得晶体的数密度（Xn）和尺寸（Xs）分别为3.6 ± 1.2 × 106 个晶体·mL-1 和 42 ± 4.1 µm。尽管这些晶体可用于某些序列晶体学实验，但仍被认为过大，因此进行了进一步优化。最终方案获得的晶体浓度为3.1 × 106 个晶体·mL-1，尺寸为15 ± 3.9 µm，完全符合计划实验的理想要求。
该方法着重于将通过蒸气扩散法培养板生长的“可溶性”蛋白质晶体转化为批量法（batch）。之所以关注这一点，是因为绝大多数可溶性蛋白质晶体均通过蒸气扩散法生长via vapor diffusion26。然而，所述概念也可应用于采用其他方法（如微批量法）生长的可溶性蛋白质晶体。这些概念也可能适用于在LCP中生长的膜蛋白晶体；因为这同样是一种批量结晶过程。
该方案的一个关键方面是将通过蒸气扩散板培养的晶体生长条件转化为适用于批量培养的条件。为实现这一转化，该方法采用了 Beale 等人（2019）提出的标准。26结晶生长 通过 即使在蒸汽扩散板中，批量处理过程也会迅速形成&#60; 24 小时）。该标准是基于蒸气扩散液滴平衡速度的估算，对于聚乙二醇（PEG）类沉淀剂条件最为适用。然而，结晶条件中包含多种多样的化合物，这些化合物会影响平衡所需时间。盐类结晶条件的平衡过程， 例如 高浓度的氯化铵在1-2天内即可发生，因此基于盐类条件下的24小时标准可能并不适用。此外，盐类条件还可能具有更复杂的相图26, 30 可能不符合本方案中所述的标准模式。如果无法扩大至更大体积，则可能需要将基于盐条件的时间标准缩短至12小时或6小时。
该方法的另一个局限性在于其表面上的复杂性。为优化内切蛋白酶微晶结晶所遵循的实验方案，实际上对稀疏矩阵筛选中的原始条件改动较小。在PACT筛选中观察到的首个阳性结果为：0.1 M HEPES（pH 7.0）、0.2 M MgCl2 和20%（w/v）PEG 6,000。最终放大的结晶缓冲液组成为：0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）、0.15 M MgCl2 和40%（w/v）PEG 6,000。此外，缓冲体系由HEPES更换为Tris-HCl以及MgCl2浓度的调整，可能对实验成功贡献甚微。因此，真正的优化可能仅在于PEG 6,000浓度的提高，而这一调整本可以非常简单地实现。
然而，这种评估也过于简单化。它不仅忽略了在放大过程中遇到的问题（即 使用晶种和淬灭），也忽视了一个事实：即使这种蛋白质的放大过程较为顺利，也不能保证下一种蛋白质同样如此。本方案中建议的步骤之所以被制定，是因为优化蛋白质结晶体积的放大过程可能会消耗大量蛋白质。在所示的七次软蛋白酶（endothiapepsin）放大试验中，共消耗了100 mg蛋白质。诚然，其中部分步骤是为了展示在此方案背景下可能产生的结果而进行的。即便如此，100 mg蛋白质，加上实验过程中可能额外消耗的50 mg蛋白质（表1），无论在时间还是经费上都是一笔不小的投入。
幸运的是，并非所有蛋白质都需要如此大量的样品。内皮蛋白酶具有很高的溶解度，因此需要较高的蛋白质浓度才能达到过饱和状态。而对于其他一些蛋白质（目前仍在优化中），在 10 甚至 5 mg/mL 的浓度下即可达到过饱和。这类变量具有蛋白质特异性，出现时需予以充分考虑。
该方法的其他局限性包括依赖复杂的设备，例如用于筛选和制板的液体处理机器人，以及在需要时自动拍摄平板图像的成像仪。已有替代方案可减少对部分设备的需求，但若缺少这些设备，实验流程将更加耗时。本方案还建议测试优化后晶体的衍射能力。对于无法常规使用同步辐射光源的晶体学家而言，这些测试可能具有挑战性。尽管并非每一步骤都必须设置对照，但强烈建议在发现阳性结果后，以及在数据缩放前和缩放后进行这些测试。在X射线自由电子激光装置（XFEL）中，无法衍射的晶体并不罕见。因此，在对晶体衍射能力做出假设时，采取谨慎态度更为妥当。
最终，本文提供的实验方案和结果将为那些在制备用于序列晶体学实验样品方面存在困难的研究人员提供指导、思路和实例。希望随着序列晶体学技术的进一步发展，该技术对样品的需求能够降低，从而减少对这类实验方案的需求。然而，即使在那种情况下，本文所展示的策略对于希望探索其蛋白质结晶条件空间的研究人员而言，仍将具有重要参考价值。

室温（RT）大分子晶体学在结构生物学领域再次受到关注。X射线自由电子激光（XFEL）光源的发展推动了室温样品输送技术的进步1,2,3,4，这些方法现已应用于同步辐射光源5,6,7,8。室温方法不仅为泵浦-探测实验策略提供了可能9,10,11,12，而且越来越多的证据表明，它们还能促进蛋白质内部产生不同的构象状态13,14,15,16,17。
然而，冷冻方法在20世纪90年代末期相较于室温方法获得广泛采用的主要原因，是在低于零度的晶体温度下辐射损伤的进程得以减缓18。冷冻方法19开始使得从单个蛋白质晶体中收集完整的衍射数据集成为可能。现代在X射线自由电子激光装置（XFELs）和同步辐射光源上发展的室温方法，通过开发快速（> 100 Hz）的晶体输送策略，解决了单晶辐射损伤的问题1,2,3,4。这些方法使得可以从数千个独立曝光的晶体中收集完整的数据集。因此，这些室温输送方法需要制备大量含有均一微晶的溶液（> 100 µL，晶体尺寸 < 50 µm）。然而，由于冷冻方法通常仅需单个晶体，目前在蛋白质晶体学实验室中，制备此类微晶悬液的方法尚未普及。
文献中已有部分关于微晶优化流程在序列晶体学样品中应用的示例。此处应区分膜蛋白与可溶性蛋白。针对在单油酸甘油酯（或其它脂类）中生长的微膜蛋白晶体（用于脂立方相（LCP））的优化方案已有较为详尽的描述20,21,22。然而，针对可溶性蛋白的微结晶方法，包括在非LCP条件下生长的膜蛋白，总体上仍较为缺乏。以往的研究多集中于该过程的特定环节，例如微晶筛选23,24、促进成核24以及利用自由界面扩散进行放大培养25，但尚未建立完整的方法体系。
然而，最近有研究描述了一种尝试提供完整实验方案的方法26。与蛋白质晶体学的许多方面一样，该方法并非全新，其中提出的许多理念此前已被 Rayment（2002 年）阐述过27。该方法旨在指导晶体学家如何将通过蒸气扩散法生长的单个晶体转化为批量培养方法，以获得数千个微晶。该方法以蒸气扩散法作为常见的起始点，因为蛋白质数据库（PDB）中 95% 的晶体结构数据均来源于蒸气扩散板中生长的晶体26。然而，蒸气扩散法并非微晶培养的理想方法26，因此文中描述了一种将其转化为批量结晶的方法。一旦能够在批量条件下生长晶体，扩大培养规模至更大体积的路径便更具可行性。鉴于蛋白质结晶过程的不确定性，作者强调该方法并非万无一失。但该实验方案至少应能提供对蛋白质“结晶空间”的深入理解。
该方法依赖于蛋白质结晶相图，以及对相图的理解如何在微结晶优化过程中起到指导作用。蛋白质相图通常被描绘为一个 x/y 沉淀剂和蛋白质浓度的图 x 和 y 轴，分别（图1A）。从纯水点（左下角 - 图1A），蛋白质和沉淀剂的浓度均逐渐增加，直至达到溶解度线。溶解度线标志着过饱和点（紫色线 - 图1A）。当蛋白质处于过饱和状态时，溶液在热力学上变得不稳定，会开始分离成两相：“富含蛋白质”相和稳定的饱和溶液相。这种分离可发生在溶解度曲线之外的任何区域，其动力学过程取决于蛋白质的性质及溶液组分的特性。
当蛋白质和沉淀剂浓度过高时，蛋白质会不稳定地从溶液中析出，形成无定形沉淀（粉红色区域——图1A）。然而，在成核区域可能发生有序的相分离［详见Garcia-Ruiz（2003）28的详细描述］，并倾向于形成晶体成核中心（绿色区域——图1A）。成核与生长过程会将蛋白质从溶液中移除，使液滴进入亚稳态区，在此区域内晶体可继续生长，直至达到溶解度线［详见McPherson和Kuznetsov（2014）29的详细讨论］。对于绝大多数结晶条件而言，该相图是一种高度简化的表示方法30。尽管如此，该图对于微晶结晶研究者仍具有重要实用价值，因为通过该图的映射可确定溶解度线以及成核动力学参数。
在制备微晶时，结晶过程中需要优化的两个因素是晶体数量（Xn）及其平均最长尺寸（Xs）。Xn 与成核事件的次数（n）成正比（公式1）。
<img alt="静态平衡；公式：Xₙ ∝ n；数学表达式；正比概念。" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">     公式 1
Xs 与溶解度线以上游离蛋白的浓度（Ps）除以 Xn 成正比（公式 2）。
<img alt="静力平衡公式，带有比例符号的示意图，用于教学。" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">     公式 2
在理想情况下，每一次成核事件都会产生一个可能的晶体，且每一个这样的晶体都能均等地接触溶液中可利用的蛋白质。图2 是 Xn 与 Xs 之间关系在理想情况下的图示。实际上，晶体学家对 Xn 和 Xs 的主要控制手段是通过影响成核数量，或通过添加晶种晶体来实现。微晶晶体学家必须判断如何提高 Xn，以便同时获得合适的晶体浓度和晶体尺寸。
大多数结晶技术都需要一个“过渡期”（图1B）。例如，在蒸汽扩散实验中，当蛋白质溶液与沉淀剂溶液混合后，随着液滴与储液池溶液达到平衡，各组分的浓度将发生变化。理想情况下，这些变化会逐步使液滴进入成核区，从而提高结晶倾向。当晶体开始成核并生长时，溶液中的蛋白质含量将逐渐下降，从而降低进一步成核的概率。最终的成核数量取决于具体的蛋白质和实验条件，同时也与进入成核区的深度有关。由于需要过渡步骤的方法对成核区的渗透深度有限，因此成核水平最终将受限于亚稳态-成核区边界的成核速率。
由于增强微晶结晶过程中成核水平的重要性，转向批量结晶方法十分关键。批量法能够更充分地利用整个成核区域（图1C）。在批量法中，其原理是将蛋白质与沉淀剂混合，形成过饱和溶液，而无需改变组分浓度。混合后应可立即发生成核。因此，理论上批量法可达到整个成核区，任何超出亚稳态-成核边界范围的成核动力学提升均能被利用。
如果基础水平的晶体成核不足以产生大量的Xn，则可采用微晶接种方法。在微晶接种中，预先生长的晶体被破碎，形成含有晶体碎片的悬浊液，这些碎片可作为新晶体生长的支架31,32。微晶接种已被广泛应用于序列晶体学样品制备中，以增加Xn，而无需提高晶体成核率（图1C）。
从气相扩散法转变为批量法的过程可以在相图上表示为将实验起始点从非过饱和区或亚稳区移至成核区。这可以通过增加液滴中蛋白质和/或沉淀剂的浓度，和/或两者之间的比例（图1D），并观察哪些条件下晶体迅速出现（&lt; 24 小时）26来实现。完全的气相扩散液滴平衡可能需要数天甚至数周时间33。因此，通过寻找能够快速形成晶体的条件，即可在无需转向其他结晶筛选模式（如微批量法34,35,36,37）的情况下确定批量法的条件。
一旦找到成核区域，即可确定批量结晶条件，并构建形态图——此处为粗略的相图。在考虑采用接种批量法还是直接批量法时，形态图具有重要参考价值。通过绘制蛋白质浓度和沉淀剂浓度函数关系下的Xn值，可评估成核动力学26。若在整个成核区域内Xn值均较低，则可能需要采用接种批量法，以使Xn足够大，从而限制晶体生长。该评估是向更大体积（> 100 µL）放大实验过程的第一步。
该方法的设计使得大多数结晶实验室均可使用标准的蒸气扩散结晶设备来完成。若具备相应设备，已有许多研究描述了可促进该过程各个步骤的技术。这些技术包括但不限于动态光散射（DLS）25,27、非线性成像20,24,25、粉末衍射20,24,27以及电子显微镜技术26[详见Cheng等（2020）40的综述]。
本研究的目的是提供一种从少量体积（&lt; 500 nL）蒸汽扩散结晶法至大体积（&gt; 100 µL) 批次结晶。来自内座壳菌的内座壳蛋白酶 Cryphonectria parasitica 已被用作演示该转化的示例系统。微晶所需的实验类型和样品递送方法将影响理想的Xs 输出26. 对于需要毫秒级时间分辨率的混合实验41 或气动虚拟喷嘴42，最终的 Xs 的 &lt; 5 µm 可能需要实现这一目标。本实验的目的是利用固定靶标递送方法，获得衍射分辨率约为1.5 Å的蛋白质晶体，用于光子激活的泵浦-探测实验。
为了说明使用内切蛋白酶进行此类序列晶体学实验的样品需求，表1列出了一个假设实验的实验参数。样品信息基于下文所述的实验方案。根据对命中率和数据收集需求的一些保守估算，整个实验的总样品消耗量预计为50 mg。
图3展示了一个完整的优化流程图，从初始的小体积蒸汽扩散结晶过渡到大规模批量结晶。对于大多数序列晶体学项目，该方案将从第2步“过渡到批量结晶”开始，因为目标蛋白已经完成结晶。然而，第1步仍被包含在内以保证流程完整性，并提醒读者其重要性。找到能够产生衍射质量良好、单一且较大的晶体的条件，是微晶优化的最佳起点。在第2步中，可将此条件从蒸汽扩散法优化为批量法，并绘制出成核区与亚稳区的形态图。完成此步骤后，可在第3步中将批量条件放大至更大体积。在流程图结束时，晶体学家将建立一个可重复的、大体积（&gt; 100 µL）的内切天冬氨酸蛋白酶微晶批量结晶方案。该方法随后可应用于其特定的目标蛋白。

<table><tbody><tr><td>Swissci 96孔2滴板</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD11-002</td><td>96孔2滴结晶板</td></tr><tr><td>Swissci 96孔3滴板</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD11-003</td><td>96孔3滴结晶板</td></tr><tr><td>mosquito LCP 液体处理机器人</td><td>sptlabtech</td><td>mosquito LCP</td><td>结晶机器人</td></tr><tr><td>ClearVue 密封膜片</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD6-015</td><td>96孔结晶板密封膜</td></tr><tr><td>Safe-Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL 离心管</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Swan and Morton</td><td>No. 3 手术刀片和 No. 3 刀柄</td><td>用于切割打开板密封膜的手术刀片</td></tr><tr><td>MS 3 涡旋振荡器</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>用于混合溶液及制备晶种储备液的涡旋振荡器</td></tr><tr><td>24孔XRL板</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD3-11</td><td>24孔悬滴结晶板</td></tr><tr><td>试管旋转混合仪/旋转器</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>88881001</td><td>扩增过程中用于混合溶液的试管旋转仪</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>手动移液器系列，0.5–10、1–20、10–100、100–1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>适用于手动移液器的各种吸头规格</td></tr><tr><td>Suparen 600</td><td>Prochem AG</td><td>Suparen 600</td><td>内切蛋白酶溶液</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>乙酸钠</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>8382T014</td><td>Tris</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>氯化镁</td></tr><tr><td>PEG 6,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255-1kg</td><td>PEG 6,000</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-1L</td><td>用于晶体低温保护的乙二醇</td></tr><tr><td>PACT Premier HT 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-36</td><td>PACT Premier 96孔晶体筛选板</td></tr><tr><td>DOW CORNING 高真空润滑脂</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD6-02</td><td>用于密封24孔板的润滑脂</td></tr><tr><td>Hirschmann 22 × 22 mm 玻璃盖玻片</td><td>Hirschmann</td><td>8000104</td><td>用于密封24孔坐滴板的盖玻片</td></tr><tr><td>晶体取样针</td><td>PSI</td><td>自制</td><td>微小晶体的薄膜支撑装置</td></tr><tr><td>1–1.3 mm SiLibeads Type S</td><td>Faust</td><td>6239547</td><td>用于制备微晶种储备液的玻璃珠</td></tr><tr><td>Macbook Pro</td><td>Apple</td><td>Macbook Pro</td><td>用于数据分析的计算机</td></tr><tr><td>CCP4 软件套件</td><td>CCP4</td><td></td><td>衍射图样数据处理软件</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td><td>相图绘制工具</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line 计数室</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>02-671-51B</td><td>用于计算晶体浓度的工具</td></tr><tr><td>PACT Premier</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29-ECO</td><td>稀疏矩阵结晶筛选试剂盒</td></tr><tr><td>Rock Imager</td><td>Formulatrix</td><td>Rock Imager</td><td>温控晶体板储存与成像系统</td></tr><tr><td>Rock MakerWeb</td><td>Formulatrix</td><td>Rock MakerWeb</td><td>晶体板制备与图像存储软件</td></tr><tr><td>Formulator</td><td>Formulatrix</td><td>Formulator</td><td>96孔晶体筛选板制备液体处理机器人</td></tr><tr><td>Leica MZ16 显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16</td><td>光学显微镜</td></tr><tr><td>LAS V4.6</td><td>Leica</td><td>LAS V4.6</td><td>Leica 显微镜配套软件</td></tr><tr><td>Spectra/Por 3.5 kDa 透析管</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 透析膜</td><td>3.5 kDa 透析膜</td></tr><tr><td>透析管封口夹</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 通用封口夹</td><td>用于密封透析管末端的夹子</td></tr><tr><td>Amicon 10 kDa 离心浓缩管</td><td>Merck-Millipore</td><td>Amicon Ultra-15 10 kDa 离心浓缩管</td><td>10 kDa 离心滤膜</td></tr><tr><td>5810 R 摆桶式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R 离心机</td><td>摆桶式离心机</td></tr></tbody></table>

优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

本文介绍了一种用于制备大体积（&#62; 100 µL）微晶悬浮液的实验方案，适用于同步辐射光源和X射线自由电子激光装置（XFELs）上的序列晶体学实验。该方法基于对蛋白质晶体相图的理解，并充分利用这一知识指导实验设计。整个方法分为三个阶段：（1）优化晶体形貌，（2）转为批量培养，（3）放大规模。第一阶段的目标是获得衍射质量良好、单一的晶体，理想情况下呈现近似立方体的形态，但并非必须如此。在第二阶段中，通过优化晶体生长时间来改进第一阶段所确定的条件，该策略可将原本通过蒸气扩散法生长的晶体转为批量培养模式。当晶体能够在约24小时内完成生长后，即可绘制该蛋白质与沉淀剂混合体系的形态图谱（morphogram），并以此为基础制定第三阶段的放大策略。一旦实现批量培养，即可尝试扩大反应体积，同时优化晶体的尺寸和浓度。本方案以Endothiapepsin作为示范蛋白进行说明。部分决策针对Endothiapepsin的具体特性而定，但希望其所体现的思路能够启发研究者将其方法论灵活应用于各自的科研项目中。

本文的目的是使读者充分理解如何将小体积蒸气扩散法用于生长大尺寸单晶蛋白晶体的实验方案，转变为适用于序列晶体学的大体积批量微晶结晶方法。

本文介绍了一种用于制备大量（> 100 µL）适用于序列衍射实验的微晶浆液的实验方案。

序列晶体学实验可能具有挑战性。在实际操作中，一个关键难题是微晶样品的制备。本方案展示了如何可靠地制备此类样品。该方法利用内切蛋白酶（endothiapepsin）建立了一个优化框架，可将小体积蒸气扩散板中生长的大晶体转化为大体积的微晶浆液。我们不能声称该方案在所有情况下均能成功。然而，我们希望此处提出的思想和方法能为其他研究者在其他蛋白质上应用提供一个实验框架。首先，使用 Formulatrix 机器人在 96 孔板中加入结晶缓冲液，每孔两滴。使用液体处理机器人将 150 纳升新鲜解冻的内切蛋白酶与 150 纳升结晶缓冲液在每孔中混合。密封该板，并将板置于 Formulatrix Hotel 中静置 24 小时，使晶体生长。24 小时后，打碎并从 96 孔结晶板的五个孔中取出晶体，放入盛有 250 微升结晶缓冲液的 1.5 毫升离心管中，将离心管置于冰桶内。向离心管中加入 10 至 15 颗直径为 1 毫米的玻璃珠。将晶体和珠子在1000 RPM下涡旋震荡30秒，然后放回冰上冷却30秒。所得晶种可立即使用，或在-20摄氏度下保存。进行形态图实验时，在2滴96孔网格筛板的列中加入5%至40%浓度的PEG 6000，并加入1摩尔Tris-HCl（pH 7）和0.15摩尔氯化镁；同时在0.1摩尔乙酸钠溶液中对内切蛋白酶进行连续稀释，浓度从100毫克/毫升至12.5毫克/毫升，共8个梯度。然后将每个稀释液八微升以及两微升的种子储备液加入液体处理机器人板中。使用液体处理机器人，将每个内切天冬酶稀释液150纳升分配至筛选板的1号和2号子孔中。从2号子孔中多通道吸取50纳升解冻的种子储备液和100纳升的孔溶液，并将两者加入蛋白质溶液中。每次加入结晶缓冲液或结晶缓冲液与晶种混合物后，将溶液混合三次。现在密封培养板，并在第一天的0、3、6、12、18和24小时进行成像，第一周内每天重复此操作，随后四周内每周进行一次，温度保持在20摄氏度。24小时后，在显微镜下观察培养板，估算每个孔中的晶体数量，并测量部分晶体的尺寸。将这些估算值记录在提供的形态图生成器工作表中。将内切天冬酶和 PEG 6000 的起始浓度输入到相应的输入框中。该工作表将自动以传统的相图形式绘制结果，其中横轴为沉淀剂浓度，纵轴为蛋白质浓度。只有在接种晶种的液滴中才出现晶体的条件对应于相图中的亚稳区，而在接种与未接种晶种的液滴中均出现晶体的条件则对应成核区。根据形态图分析，选择最有前景的条件用于在24孔板中扩大规模。随后，以100毫克/毫升的内切蛋白酶和35% PEG 6000开始实验。配制5毫升结晶缓冲液，其中含35% PEG 6000、0.1摩尔Tris-HCl（pH 7）和0.15摩尔氯化镁。将0.5毫升结晶缓冲液加入经硅化处理的24孔悬滴板的三个孔中。在玻璃盖玻片上，将15微升内切蛋白酶与15微升结晶溶液混合。将溶液加入孔中，将板放置24小时。24小时后，在显微镜下观察板，估计液滴中晶体的数量并测量其尺寸。如果晶体不符合要求，重复此步骤，但调整蛋白质浓度，或在晶体成核不足时加入晶种。通过添加更高浓度PEG 6000的晶种重复24孔板扩大实验。在已涂油的24孔悬滴板的三个孔中各加入0.5毫升新的结晶缓冲液。取15微升内切蛋白酶置于玻璃盖玻片上，加入5微升晶种储备液和10微升结晶溶液，与内切蛋白酶溶液混合。将盖玻片倒置，放置在孔上，静置24小时。重新检查液滴，观察晶体是否变小且浓度更高。估算液滴中晶体的数量，并再次测量其大小，以确认晶体是否已达到合适尺寸。进行接种-分批实验时，配制含有40% PEG 6000、0.1 mol/L Tris-HCl（pH为7）和0.15 mol/L氯化镁的结晶缓冲液。预先将50 µL种子储备液与100 µL结晶溶液混合，然后在1.5 mL离心管中与蛋白质溶液混合。涡旋振荡管子10秒，随后将其置于20 °C的摇床或振荡器上。每20分钟取2.5微升该批次溶液。使用血细胞计数板监测晶体的大小和数量。在显微镜下计数晶体数量并测量其尺寸。当晶体生长至约15微米尺寸时，加入150微升含有0.5摩尔醋酸钠、0.5摩尔Tris-HCl、0.075摩尔氯化镁和20% PEG 6000的溶液以终止反应。使用血细胞计数板重新检查晶体大小和浓度。将晶体在20摄氏度下保存。内切天冬氨酸蛋白酶形态图分析表明，成核过程受到蛋白质浓度和沉淀剂浓度的共同影响。该图中的亚稳态区、成核区和沉淀区可以清晰区分。与未添加晶种的液滴相比，加入晶种显著增加了晶体数量。在200至300微升体积下对内切蛋白酶微晶结晶过程的分析揭示了晶体成核及最长尺寸随时间的变化。将聚乙二醇（PEG）浓度提高至35%显著改善了结晶效果，最终晶体浓度约为每毫升3.6×10⁶，晶体最长尺寸为42微米。为减小最终晶体的尺寸，采用了降低蛋白浓度的方法，但该方法不幸显著降低了晶体浓度，最终反而产生了更大的晶体。然而，将PEG浓度提高至40%的方法获得了每毫升约3.1×10⁶个晶体，尺寸约为39微米。此外，加入晶种后晶体浓度显著增加，达到每毫升约1.1×10⁸个，尺寸减小至约4.2微米。在结晶反应中尝试的淬灭效应最终得到每毫升约2.6×10⁶个晶体，尺寸约为15微米。将CC1/2值与X射线数据的分辨率作图后显示，晶体分辨率从10微升体积到200至300微升体积略有下降。然而，晶体衍射分辨率仍达到1.5埃，被认为足够使用。内皮蛋白酶是一种易于操作的蛋白。我们希望尝试这种内切蛋白酶的实验方案能够为其他蛋白质的研究提供有益的思路和方法。尤其是在晶体学领域，与其仅仅遵循书面方案，不如亲自观察和体会实验过程中的实际现象更为有益。本视频有望为您提供部分这样的直观感受。

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