优化用于连续晶体学实验的内硫肽晶体的生长

连续晶体学实验可能具有挑战性。他们实践中的一个关键障碍是微晶样品的创建。该协议显示了如何可靠地创建此类样本。

该方法使用内硫肽来提供用于优化在小体积蒸汽扩散板中生长的大晶体到大体积微晶浆料的框架。我们不能声称这个协议会普遍成功。然而，我们希望这里提出的想法和方法能为其他人提供一个用于其他蛋白质的实验框架。

首先，使用Formulatrix机器人准备带有结晶缓冲液的两滴96孔板。使用液体处理机器人混合物，在每个孔中将150纳升新鲜解冻的内硫肽与150纳升结晶缓冲液混合。密封板，让晶体在Formulatrix酒店内生长24小时。

24小时后，从96孔结晶板的五个孔中分解并去除晶体。将它们放入250微升结晶缓冲液中，置于置于冰桶中的1.5毫升离心管中。将 10 至 15 个 1 毫米大小的玻璃珠加入离心管中。

以 1000 RPM 的速度涡旋晶体和珠子 30 秒，然后在冰上更换它们 30 秒。然后种子可以立即使用或储存在零下20摄氏度。为了进行形态图实验，沿着两滴96孔网格筛选的板柱加入5%至40%浓度的PEG 6000，pH为7的1摩尔Tris-HCl和0.15摩尔氯化镁在8个步骤中从每毫升100至12.5毫克修复内硫肽的顺序稀释。

然后移液将每次稀释液8微升，然后将2微升种子原液放入液体处理机器人平板中。使用液体处理机器人，将每次稀释的 150 纳脂肽分配到筛网的第一和二子孔中。从子孔二中多次吸出50纳升解冻的种子原液和100纳升的孔溶液，并将两者分配到蛋白质溶液中。

加入结晶缓冲液或结晶缓冲液和种子混合物后混合溶液三次。现在将板和图像密封在第一天的零、三、六、12、18 和 24 小时，第一周每天，在接下来的四周每周在 20 摄氏度下。24小时后，在显微镜下观察板，估计每个孔内的晶体数量并测量晶体样品。

将这些估计值记录在提供的形态图生成器工作表中。将内硫肽和PEG 6000的起始浓度输入到适当的框中。工作表将自动以传统的相图格式绘制结果，沉淀剂和蛋白质浓度分别位于X轴和Y轴上。

仅在晶种液滴中产生晶体的井条件表示图的亚稳区域，而晶种和非晶种液滴中都有晶体的条件表示成核区。从形态图分析中，选择最有希望缩放到24孔板的条件。然后从每毫升100毫克的内噻菌肽和35%PEG 6000开始。

用35%PEG 6000，pH 7的0.1摩尔Tris-HCl和0.15摩尔氯化镁制备5毫升结晶缓冲液。现在将0.5毫升结晶缓冲液放入涂有油脂的24孔悬挂式滴板的三个孔中。在玻璃盖玻片上将15微升内噻菌素与15微升结晶溶液混合。

将溶液放在孔上，将板放置24小时。24小时后，在显微镜下观察板，估计液滴中的晶体数量，并测量它们的大小。如果晶体不正确，请重复此步骤，但如果晶体成核不够高，则更改蛋白质浓度或添加种子。

通过添加较高浓度的PEG 6000的种子来重复24孔缩放实验。将0.5毫升新的结晶缓冲液放入涂有油脂的24孔悬挂板的三个孔中。将15微升内噻菌素放在玻璃盖玻片上，并将5微升种子原液和10微升结晶溶液与内噻菌肽溶液混合。

倒置盖玻片，将它们放在孔上，放置 24 小时。重新检查液滴，看看晶体是否更小，浓度是否更高。估计液滴中的晶体数量并再次测量它们的大小，看看它们现在是否是正确的大小。

为了执行晶种批次方案，制备40%PEG 6000，0.1摩尔Tris-HCl，pH为7和0.15摩尔氯化镁的结晶缓冲液。预混合50微升种子原液和100微升结晶液，并在1.5毫升离心管中与蛋白质溶液混合。涡旋管10秒钟，然后将其放在20摄氏度的摇臂或摇床上。

每20分钟取2.5微升等分试样的批次溶液。使用血细胞计数器监测晶体的大小和数量。计算晶体的数量并在显微镜下测量它们的大小。

当晶体达到约15微米尺寸时，用150微升0.5摩尔乙酸钠补充0.5摩尔Tris-HCl，0.075摩尔氯化镁和20%PEG 6000淬灭反应。使用血细胞计数器重新检查晶体尺寸和浓度。将晶体储存在 20 摄氏度。

内硫肽素形态图分析表明，成核受蛋白质和沉淀物浓度的影响。图中的亚稳态、成核和沉淀区域可以很好地区分。与没有种子的液滴相比，添加种子显着增加了晶体数量。

对200至300微升体积的内噻性肽微结晶的分析揭示了晶体成核的变化和最长尺寸随时间的变化。将PEG浓度提高到35%明显改善结晶，最终晶体浓度约为每毫升10至6的3.6倍，最长晶体尺寸为42微米。为了减小最终晶体的尺寸，应用了蛋白质浓度降低方法，不幸的是，该方法显着降低了晶体浓度，最终产生了更大的晶体。

然而，将PEG浓度增加到40%的方法产生了大约3.1乘以10至每毫升6的晶体，尺寸约为39微米。此外，添加晶种导致晶体浓度的显着增加，约为每毫升8的1.1倍10和约4.2微米的较小尺寸。在结晶反应中尝试的淬灭效应使最终晶体浓度约为每毫升6的2.6乘以10，尺寸约为15微米。

根据X射线数据的分辨率绘制的CC半值显示晶体分辨率从10微升略微下降到200至300微升体积。然而，晶体仍然衍射到1.5安格，这被认为是足够的。内噻菌素是一种宽容的蛋白质。

我们希望尝试这种内噻菌肽方案将为其他蛋白质产生有用的想法和方法。特别是在晶体学方面，看到事物的外观和感觉是有益的，而不是试图只遵循书面协议。希望这个视频能给你一些这样的感觉。