优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

序列晶体学实验可能具有挑战性。在实际操作中，一个关键难题是微晶样品的制备。本方案展示了如何可靠地制备此类样品。

该方法利用内切蛋白酶（endothiapepsin）建立了一个优化框架，可将小体积蒸气扩散板中生长的大晶体转化为大体积的微晶浆液。我们不能声称该方案在所有情况下均能成功。然而，我们希望此处提出的思想和方法能为其他研究者在其他蛋白质上应用提供一个实验框架。

首先，使用 Formulatrix 机器人在 96 孔板中加入结晶缓冲液，每孔两滴。使用液体处理机器人将 150 纳升新鲜解冻的内切蛋白酶与 150 纳升结晶缓冲液在每孔中混合。密封该板，并将板置于 Formulatrix Hotel 中静置 24 小时，使晶体生长。

24 小时后，打碎并从 96 孔结晶板的五个孔中取出晶体，放入盛有 250 微升结晶缓冲液的 1.5 毫升离心管中，将离心管置于冰桶内。向离心管中加入 10 至 15 颗直径为 1 毫米的玻璃珠。

将晶体和珠子在1000 RPM下涡旋震荡30秒，然后放回冰上冷却30秒。所得晶种可立即使用，或在-20摄氏度下保存。进行形态图实验时，在2滴96孔网格筛板的列中加入5%至40%浓度的PEG 6000，并加入1摩尔Tris-HCl（pH 7）和0.15摩尔氯化镁；同时在0.1摩尔乙酸钠溶液中对内切蛋白酶进行连续稀释，浓度从100毫克/毫升至12.5毫克/毫升，共8个梯度。

然后将每个稀释液八微升以及两微升的种子储备液加入液体处理机器人板中。使用液体处理机器人，将每个内切天冬酶稀释液150纳升分配至筛选板的1号和2号子孔中。从2号子孔中多通道吸取50纳升解冻的种子储备液和100纳升的孔溶液，并将两者加入蛋白质溶液中。

每次加入结晶缓冲液或结晶缓冲液与晶种混合物后，将溶液混合三次。现在密封培养板，并在第一天的0、3、6、12、18和24小时进行成像，第一周内每天重复此操作，随后四周内每周进行一次，温度保持在20摄氏度。24小时后，在显微镜下观察培养板，估算每个孔中的晶体数量，并测量部分晶体的尺寸。

将这些估算值记录在提供的形态图生成器工作表中。将内切天冬酶和 PEG 6000 的起始浓度输入到相应的输入框中。该工作表将自动以传统的相图形式绘制结果，其中横轴为沉淀剂浓度，纵轴为蛋白质浓度。

只有在接种晶种的液滴中才出现晶体的条件对应于相图中的亚稳区，而在接种与未接种晶种的液滴中均出现晶体的条件则对应成核区。根据形态图分析，选择最有前景的条件用于在24孔板中扩大规模。随后，以100毫克/毫升的内切蛋白酶和35% PEG 6000开始实验。

配制5毫升结晶缓冲液，其中含35% PEG 6000、0.1摩尔Tris-HCl（pH 7）和0.15摩尔氯化镁。将0.5毫升结晶缓冲液加入经硅化处理的24孔悬滴板的三个孔中。在玻璃盖玻片上，将15微升内切蛋白酶与15微升结晶溶液混合。

将溶液加入孔中，将板放置24小时。24小时后，在显微镜下观察板，估计液滴中晶体的数量并测量其尺寸。如果晶体不符合要求，重复此步骤，但调整蛋白质浓度，或在晶体成核不足时加入晶种。

通过添加更高浓度PEG 6000的晶种重复24孔板扩大实验。在已涂油的24孔悬滴板的三个孔中各加入0.5毫升新的结晶缓冲液。取15微升内切蛋白酶置于玻璃盖玻片上，加入5微升晶种储备液和10微升结晶溶液，与内切蛋白酶溶液混合。

将盖玻片倒置，放置在孔上，静置24小时。重新检查液滴，观察晶体是否变小且浓度更高。估算液滴中晶体的数量，并再次测量其大小，以确认晶体是否已达到合适尺寸。

进行接种-分批实验时，配制含有40% PEG 6000、0.1 mol/L Tris-HCl（pH为7）和0.15 mol/L氯化镁的结晶缓冲液。预先将50 µL种子储备液与100 µL结晶溶液混合，然后在1.5 mL离心管中与蛋白质溶液混合。涡旋振荡管子10秒，随后将其置于20 °C的摇床或振荡器上。

每20分钟取2.5微升该批次溶液。使用血细胞计数板监测晶体的大小和数量。在显微镜下计数晶体数量并测量其尺寸。

当晶体生长至约15微米尺寸时，加入150微升含有0.5摩尔醋酸钠、0.5摩尔Tris-HCl、0.075摩尔氯化镁和20% PEG 6000的溶液以终止反应。使用血细胞计数板重新检查晶体大小和浓度。将晶体在20摄氏度下保存。

内切天冬氨酸蛋白酶形态图分析表明，成核过程受到蛋白质浓度和沉淀剂浓度的共同影响。该图中的亚稳态区、成核区和沉淀区可以清晰区分。与未添加晶种的液滴相比，加入晶种显著增加了晶体数量。

在200至300微升体积下对内切蛋白酶微晶结晶过程的分析揭示了晶体成核及最长尺寸随时间的变化。将聚乙二醇（PEG）浓度提高至35%显著改善了结晶效果，最终晶体浓度约为每毫升3.6×10⁶，晶体最长尺寸为42微米。为减小最终晶体的尺寸，采用了降低蛋白浓度的方法，但该方法不幸显著降低了晶体浓度，最终反而产生了更大的晶体。

然而，将PEG浓度提高至40%的方法获得了每毫升约3.1×10⁶个晶体，尺寸约为39微米。此外，加入晶种后晶体浓度显著增加，达到每毫升约1.1×10⁸个，尺寸减小至约4.2微米。在结晶反应中尝试的淬灭效应最终得到每毫升约2.6×10⁶个晶体，尺寸约为15微米。

将CC1/2值与X射线数据的分辨率作图后显示，晶体分辨率从10微升体积到200至300微升体积略有下降。然而，晶体衍射分辨率仍达到1.5埃，被认为足够使用。内皮蛋白酶是一种易于操作的蛋白。

我们希望尝试这种内切蛋白酶的实验方案能够为其他蛋白质的研究提供有益的思路和方法。尤其是在晶体学领域，与其仅仅遵循书面方案，不如亲自观察和体会实验过程中的实际现象更为有益。本视频有望为您提供部分这样的直观感受。