Summary
Die Mikrozirkulation des Rückenmarks spielt eine zentrale Rolle bei Rückenmarksverletzungen. Die meisten Methoden erlauben keine Echtzeitbewertung der Mikrozirkulation des Rückenmarks, die für die Entwicklung von mikrozirkulationsorientierten Therapien unerlässlich ist. Hier schlagen wir ein Protokoll unter Verwendung von Laser-Doppler-Flow-Nadelsonden in einem großen Tiermodell der Ischämie / Reperfusion vor.
Abstract
Rückenmarksverletzungen sind eine verheerende Komplikation der Aortenreparatur. Trotz entwicklungen zur Prävention und Behandlung von Rückenmarksverletzungen ist ihre Inzidenz immer noch beträchtlich hoch und beeinflusst daher das Patientenergebnis. Die Mikrozirkulation spielt eine Schlüsselrolle bei der Gewebeperfusion und Sauerstoffversorgung und ist oft von der Makrohämodynamik getrennt. Daher ist die direkte Evaluierung der Rückenmarksmikrozirkulation essentiell für die Entwicklung von mikrozirkulationsgezielten Therapien und die Evaluierung bestehender Ansätze in Bezug auf die Mikrozirkulation des Rückenmarks. Die meisten Methoden bieten jedoch keine Echtzeitbewertung der Mikrozirkulation des Rückenmarks. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Protokoll für die mikrozirkulatorische Auswertung des Rückenmarks in Echtzeit mit Laser-Doppler-Nadelsonden zu beschreiben, die direkt in das Rückenmark eingeführt werden. Wir verwendeten ein Schweinemodell der Ischämie / Reperfusion, um eine Verschlechterung der Mikrozirkulation des Rückenmarks zu induzieren. Zusätzlich wurde eine fluoreszierende Mikrosphären-Injektionstechnik verwendet. Anfangs wurden die Tiere betäubt und mechanisch beatmet. Danach wurde eine Laser-Doppler-Nadelsondeneinführung durchgeführt, gefolgt von der Platzierung der Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage. Eine mediane Sternotomie wurde für die Exposition der absteigenden Aorta durchgeführt, um eine Aortenkreuzklemmung durchzuführen. Ischämie/Reperfusion wurde durch supra-zöliakie-Aorten-Kreuzklemmung für insgesamt 48 min induziert, gefolgt von Reperfusion und hämodynamischer Stabilisierung. Der Laser-Doppler-Fluss wurde parallel zur makrohämodynamischen Auswertung durchgeführt. Darüber hinaus wurde eine automatisierte Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage eingesetzt, um einen stabilen Zerebrospinaldruck aufrechtzuerhalten. Nach Abschluss des Protokolls wurden Tiere geopfert und das Rückenmark für histopathologische und Mikrosphärenanalysen geerntet. Das Protokoll zeigt die Machbarkeit von Rückenmarks-Mikroperfusionsmessungen mit Laser-Doppler-Sonden und zeigt eine deutliche Abnahme während der Ischämie sowie der Erholung nach reperfusion. Die Ergebnisse zeigten ein vergleichbares Verhalten wie die Fluoreszenzmikrosphärenbewertung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue Protokoll ein nützliches Großtiermodell für zukünftige Studien mit Echtzeit-Rückenmarksmikroperfusionsbewertung bei Ischämie/ Reperfusionsbedingungen darstellen könnte.
Introduction
Eine durch Ischämie/Reperfusion (SCI) induzierte Rückenmarksverletzung ist eine der verheerendsten Komplikationen der Aortenreparatur im Zusammenhang mit einem reduzierten Ergebnis1,2,3,4. Zu den aktuellen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten für SCI gehören die Optimierung makrohämodynamischer Parameter sowie die Normalisierung des Liquordrucks (CSP) zur Verbesserung des Rückenmarksperfusionsdrucks2,5,6,7,8,9. Trotz der Durchführung dieser Manöver liegt die Inzidenz von SCI immer noch zwischen 2% und 31%, abhängig von der Komplexität der Aortenreparatur10,11,12.
In jüngster Zeit hat die Mikrozirkulation erhöhte Aufmerksamkeit erregt13,14. Die Mikrozirkulation ist der Bereich der zellulären Sauerstoffaufnahme und des Stoffwechselaustauschs und spielt daher eine entscheidende Rolle für die Organfunktion und die zelluläre Integrität13. Eine Beeinträchtigung des mikrozirkulatorischen Blutflusses ist eine wichtige Determinante der Gewebeischämie im Zusammenhang mit einer erhöhtenMortalität 15,16,17,18,19. Eine Beeinträchtigung der Mikrozirkulation des Rückenmarks ist mit einer verminderten neurologischen Funktion und dem Ergebnis20,21,22,23 verbunden. Daher ist die Optimierung der Mikroperfusion zur Behandlung von SCI ein vielversprechender Ansatz. Persistenz mikrozirkulatorischer Störungen, trotz makrozirkulatorischer Optimierung, wurde beschrieben26,27,28,29. Dieser Verlust der hämodynamischen Kohärenz tritt häufig unter verschiedenen Bedingungen auf, einschließlich Ischämie / Reperfusion, was die Notwendigkeit einer direkten mikrozirkulatorischen Bewertung und mikrozirkulationsorientierter Therapienunterstreicht 26,27,30.
Bisher haben nur wenige Studien Laser-Doppler-Sonden zur Echtzeitbewertung des mikrozirkulatorischen Verhaltens des Rückenmarks verwendet20,31. Bestehende Studien haben häufig Mikrosphäreninjektionstechniken verwendet, die durch intermittierende Anwendung und Post-mortem-Analyse begrenzt sind32,33. Die Anzahl der verschiedenen Messungen mit Mikrosphäreninjektionstechnik ist durch die Verfügbarkeit von Mikrosphären mit unterschiedlichen Wellenlängen begrenzt. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu Laser-Doppler-Techniken eine Echtzeitbewertung der Mikroperfusion nicht möglich, da für diese Methode eine postmortale Gewebebearbeitung und -analyse erforderlich ist. Hier stellen wir ein experimentelles Protokoll zur Echtzeitbewertung der Rückenmarksmikrowelle in einem porcinen Großtiermodell der Ischämie/Reperfusion vor.
Diese Studie war Teil eines großen Tierprojekts, das eine randomisierte Studie, in der der Einfluss von Kristalloiden vs. Kolloiden auf die Mikrozirkulation bei Ischämie/Reperfusion verglichen wurde, sowie eine explorative randomisierte Studie über die Auswirkungen von Flüssigkeiten vs. Vasopressoren auf die Mikroperfusion des Rückenmarks kombinierte. Die 2-Punkt-Kalibrierung der Durchflusssonde sowie die Druckspitzenkatheterkalibrierung wurden zuvor beschrieben34. Zusätzlich zu dem berichteten Protokoll wurden fluoreszierende Mikrokugeln für die Messung der Rückenmarksmikroperfusion verwendet, wie zuvor beschrieben, wobei 12 Proben von Rückenmarksgewebe für jedes Tier verwendet wurden, wobei die Proben 1-6 das obere Rückenmark und 7-12 das untere Rückenmark35,36 darstellten. Die Mikrosphäreninjektion wurde für jeden Messschritt nach Abschluss der Laser-Doppler-Aufnahmen und der makrohämodynamischen Auswertung durchgeführt. Die histopathologische Bewertung wurde mit dem Kleinman-Score durchgeführt, wie zuvor beschrieben37.
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Protocol
Die Studie wurde von der Regierungskommission für die Pflege und Verwendung von Tieren der Stadt Hamburg genehmigt (Aktenzeichen 60/17). Die Tiere wurden gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH-Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 2011) sowie den Empfehlungen und Experimenten der FELASA nach den ARRIVE-Richtlinien24,25gepflegt. Diese Studie war eine akute Studie, und alle Tiere wurden am Ende des Protokolls eingeschläfert.
ANMERKUNG: Die Studie wurde an sechs drei Monate alten männlichen und weiblichen Schweinen (Deutsche Landrasse) mit einem Gewicht von etwa 40 kg durchgeführt. Die Tiere wurden mindestens 7 Tage vor den Versuchen in die Tierpflegeeinrichtungen gebracht und gemäß den Tierschutzempfehlungen untergebracht. Die Tiere wurden ad libitum mit Futter und Wasser versorgt und ihr Gesundheitszustand regelmäßig vom zuständigen Tierarzt beurteilt. Vor den Experimenten wurde eine Fastenzeit von 12 h eingehalten. Der gesamte Versuchsablauf und Umgang mit den Tieren wurde vom zuständigen Tierarzt überwacht.
1. Anästhesie-Induktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie
- Zur Anästhesieinduktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie die Tiere prämedizieren und tief sedieren sie mit einer intramuskulären Injektion, gefolgt von intravenösen Injektionen, falls erforderlich, um eine endotracheale Intubation durchzuführen. Danach induzieren und erhalten Sie die Anästhesie durch Verwendung einer Kombination eines flüchtigen Anästhesiemittels mit einer kontinuierlichen Opioidanwendung, die durch eine zusätzliche Opioid-Bolusinjektion ergänzt wird.
- Intramuskuläre Injektionen von Ketamin 20 mg·kg-1, Azaperon 4 mg·kg-1und Midazolam 0,1 mg·kg-1 zur Prämedikation und Sedierung durchführen.
- Legen Sie einen Venenkatheter in eine Ohrvene, sichern Sie die richtige Fixierung und beurteilen Sie die Funktionalität durch schnelle Anwendung von 10 ml Kochsalzlösung.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Wärmedecke, um Wärmeverlust zu vermeiden.
- Richten Sie eine grundlegende Überwachung mit Elektrokardiographie (EKG) und Pulsoximetrie ein, um den kardiopulmonalen Zustand der Tiere zu überwachen, und schließen Sie sie an die grundlegende Überwachungshardware an.
- Verabreichen Sie 15 l·min-1 Sauerstoff über eine schweineförmige Maske zur Voroxygenierung.
- Injizieren Sie intravenöse Boli von 0,1 mg·kg-1 von 1% Propofol, falls erforderlich, und führen Sie eine endotracheale Intubation durch.
- Sichern Sie die korrekte Platzierung mit End-Tidal-Capnographie und Auskultation, verabreichen Sie 0,1 mg • kg-1 Pancuronium und stellen Sie eine ordnungsgemäße Fixierung des Endotrachealtubus sicher.
- Etablieren Sie eine volumengesteuerte Beatmung unter Verwendung von Tidalvolumina von10 ml·kg -1 Körpergewicht-1, einempositiven endspiratorischen Druck von 10 cmH 2 O undeinemAnteil an inspiriertem Sauerstoff (FiO2) von 0,3 mit dem Anästhesiegerät. Stellen Sie die Beatmungsfrequenz ein, um eine endexspiratorische Kohlendioxidspannung (etCO2)von 35-45 mmHg aufrechtzuerhalten.
- Führen Sie einen Magenschlauch ein, saugen Sie Magenflüssigkeiten ab, fixieren Sie den Schlauch richtig und verbinden Sie ihn mit einem Auffangbeutel. Schließen Sie vorsichtig die Augen des Tieres, um eine Trockenheit der Augen während der Anästhesie zu verhindern.
- Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Infusion von Fentanyl (10 μg·kg-1·h-1) und Sevofluran (3,0% abgelaufene Konzentration, vom Dampf abgegeben). Stellen Sie ein angemessenes Anästhesieniveau durch sorgfältige Beobachtung der Vitalfunktionen und Beatmungsparameter sowie durch das Fehlen von Bewegungen während des gesamten Protokolls sicher, wobei besonderes Augenmerk auf die Phasen des chirurgischen Reizes zu legen ist. Geben Sie zusätzliche Bolusdosen von Fentanyl (50 μg) an, wenn Anzeichen von Schmerzen oder Leiden vorliegen.
HINWEIS: Stellen Sie die Anwesenheit von Forschern sicher, die während des gesamten Eingriffs Erfahrung in der Tieranästhesie haben, und verwenden Sie die Aufsicht durch einen erfahrenen Tierarzt, um eine ordnungsgemäße Anästhesie sicherzustellen. - Verabreichen Sie eine Baseline-Infusionsrate von 10 ml·kg-1·h-1 balancierten Kristalloiden, um Flüssigkeitsverluste während der Anästhesie, der chirurgischen Vorbereitung und der Durchführung des experimentellen Protokolls auszugleichen. Verwenden Sie einen Flüssigkeitswärmer, um Wärmeverlust zu vermeiden.
- Reinigen Sie die Haut des Schweins vorsichtig mit Seifenwasser. Verwenden Sie eine Hautdesinfektionslösung, die Povidon-Jod enthält, um die Hautkontamination zu verringern. Verwenden Sie sterile Handschuhe für chirurgische Vorbereitungen. Tragen Sie 300 mg Clindamycin als antimikrobielle Prophylaxe auf und wiederholen Sie die Dosierung nach 6 h.
2. Platzierung der Sonde
- Platzieren Sie das Tier in der rechten Seitenposition und beugen Sie den Rücken des Tieres, um den Raum zwischen den Wirbeln zu erweitern.
- Chirurgisch den paravertebralen Bereich zur Vorbereitung von Dornfortsätzen und Wirbelbögen freilegen (Abbildung 1A).
- Legen Sie einen vaskulären 14 G peripheren Venenkatheter Paramedian in das Rückenmark auf Höhe des Brustwirbels (Th) 13/14 oder des Lendenwirbels (L) 1/2 zwischen zwei Wirbelbögen (Abbildung 1B).
- Entfernen Sie die Nadel, führen Sie die Laser/Doppler-Nadelsonde über den Venenkatheter ein (Abbildung 1C) und testen Sie die Signalqualität durch Verbindung mit der dafür vorgesehenen Hard- und Software. Stellen Sie sicher, dass ein stabiles Signal mit mäßiger Pulsatilität vorliegt.
- Befestigen Sie die Sonde vorsichtig mit Nähten (Abbildung 1D) und verwenden Sie eine Polsterung, um eine Dislokation oder ein Knicken der Sonde zu verhindern.
- Für die perkutane Platzierung der Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage zur Messung und Kontrolle des Zerebrospinaldrucks identifizieren Sie das Niveau von L 4/5 oder L 5/6, punktieren Sie die Haut und den subkutanen Raum mit der Introducer-Nadel und entfernen Sie die Inlay-Nadel.
- Legen Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte Spritze auf die Nadel und führen Sie die Nadel vorsichtig mit konstantem Druck auf die flüssigkeitsgefüllte Spritze ein.
- Sobald ein Widerstandsverlust als Beweis für die Epiduralposition empfunden wird, führen Sie die Inlay-Nadel wieder ein und führen Sie die Nadel 2-3 mm weiter ein, um die Dura mater zu stechen und die Inlay-Nadel zu entfernen.
- Überprüfen Sie die intrathekale Position durch schnelles Tropfen der klaren Flüssigkeit. Führen Sie die Drainage bis zu einer Tiefe von 20 cm ein, befestigen Sie den Luer-Lock-Adapter und überprüfen Sie die Position durch sorgfältiges Absaugen der Flüssigkeit.
- Fixieren Sie die Drainage vorsichtig mit Nähten und verbinden Sie sie mit dem Drainagesystem der Zerebrospinalflüssigkeit.
- Legen Sie den Schädel hinter dem linken Ohr frei und führen Sie mit einem 6-mm-Bohraufsatz vorsichtig eine Bohrlochtrepanation der Haut durch.
- Führen Sie eine zweite Laser-Doppler-Sonde direkt in das Gehirn ein. Befestigen Sie die Sonde vorsichtig mit Nähten und testen Sie die Signalqualität durch Anschluss an die dafür vorgesehene Hard- und Software. Stellen Sie auch hier sicher, dass ein stabiles Signal mit mäßiger Pulsatilität vorliegt.
- Trennen Sie alle Sonden, legen Sie das Tier vorsichtig in Rückenlage, um eine nicht betroffene Sondenposition zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass mindestens 4-5 Forscher dieses Manöver durchführen.
- Schließen Sie die Sonden wieder an und überprüfen Sie die Signalqualität erneut.
- Verbinden Sie die Ausgangskanäle der Laser-Doppler-Hardware mit dem Verstärker und der synchronen Erfassungshardware und -software, um zusätzlich den Laser/Doppler-Fluss gleichzeitig mit makrohämodynamischen Signalen aufzuzeichnen.
- Kalibrieren Sie den Flussstrom nach Einheit (PU) mit 2-Punkt-Kalibrierung.
- Drücken Sie die Eingabetaste, um das Menü zu öffnen und die Einstellung für den analogen Ausgang auszuwählen.
- Verwenden Sie den angezeigten Umrechnungsfaktor (5,0 V = 1000 PU), um Flux mit 2-Punkt-Kalibrierung für die Verwendung mit der synchronen Erfassungssoftware zu kalibrieren.
- Wählen Sie "Zurück", um zum vorherigen Menü zurückzukehren, und wählen Sie "Messung", um mit der Messung fortzufahren.
- Öffnen Sie die Software für die synchrone Erfassung. Wählen Sie im Menü Setup die Option Null für alle Eingaben aus. Verbinden Sie alle Eingänge mit den verwendeten Geräten und Sonden.
- Führen Sie eine 2-Punkt-Kalibrierung für Flux durch, indem Sie auf das Dropdown-Menü des Flux-Kanalsklicken. Wählen Sie 2-Punkt-Kalibrierung. Stellen Sie Einheitenumrechnung auf ein und wählen Sie BPU als Einheiten aus. Für Punkt 1setzen Sie 0 V auf 0 BPU. Für Punkt 2stellen Sie 5,0 V auf 1000 BPU ein. Wählen Sie eingestellte Einheiten für alle und neue Daten aus. Drücken Sie OK, um das Menü zu schließen.
- Beginnen Sie mit der kontinuierlichen Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage mit einem Zieldruck von 10 mmHg und einem Drainagevolumen von 20 mL·h-1.
3. Katheterplatzierung
- Legen Sie beide Oberschenkelarterien frei.
- Ligatieren Sie den distalen Teil der rechten Oberschenkelarterie, verschließen Sie vorübergehend das proximale Lumen der Arterie mit einer Gefäßschleife, führen Sie einen 2 mm langen Schnitt des Gefäßes mit einer Potts-Schere durch und führen Sie den Führungsdraht ein.
- Führen Sie den Führungsdraht weiter ein, um ein widerstandsfreies Einführen zu gewährleisten und ein Knicken des Drahtes zu vermeiden. Führen Sie den Katheter über den Draht ein.
- Fixieren Sie den Katheter mit Nähten.
- Stellen Sie die korrekte Position durch Aspiration des arteriellen Blutes sicher, verifiziert mit Blutgasanalyse und arterieller Signalmessung nach ordnungsgemäßer Verbindung mit dem Blutdruck und transkardiopulmonaler Überwachung Hard- und Software.
- Platzieren Sie eine 5-mm-Durchflusssonde auf der linken Oberschenkelarterie und testen Sie die Signalqualität durch Anschluss an den Durchflussmesser.
- Schließen Sie beide Leisten mit Nähten.
- Legen Sie die rechte Halsschlagader sowie die richtige innere Halsvene frei, um 8 Fr. Introducer-Hüllen zu platzieren.
- Bei der Katheterplatzierung ist die gleiche Vorgehensweise wie in den Abschnitten 3.2-3.4 beschrieben vorzugehen.
- Verbinden Sie das Seitenlumen der Carotis-Introducer-Hülle mit der grundlegenden Drucküberwachungs- und pulmonalen Thermodilutionshardware für die arterielle Druckmessung.
- Führen Sie einen Druckspitzenkatheter in die aufsteigende Aorta ein und überprüfen Sie die Position durch Anschluss an den Verstärker und synchrone Erfassungs hard- und software.
- Legen Sie einen Swan-Ganz-Lungenarterienkatheter über die Venenscheide in die Lungenarterie, indem Sie den Ballon mit Luft in 20 cm Tiefe aufblasen und vorsichtig einführen, bis ein Keildruck in der hämodynamischen Kurve zu sehen ist. Entlüften Sie den Ballon und ziehen Sie den Katheter 2 cm zurück. Gewährleisten Sie eine zufriedenstellende Signalqualität des Lungenarteriendrucks. Schließen Sie die Thermistoren an die grundlegende Drucküberwachungs- und pulmonale Thermodilutionshardware an.
- Verwenden Sie die sonographische Anleitung für die perkutane Platzierung eines 12 Fr. 5-Lumen Zentralvenenkatheters zur Medikamentenverabreichung und zentralvenösen Druckmessung in die äußere rechte Jugularvene. Verwenden Sie den 6-Stufen-Ansatz für die sonographische Platzierung38
- Verbinden Sie das distale Lumen des Katheters mit der Blutdruck- und transkardiopulmonalen Überwachungsfest- und -software. Schalten Sie alle Medikamente und Infusionen auf den zentralen Venenkatheter um. Verwenden Sie verschiedene Lumen für Analgetika, Flüssigkeiten und Katecholamine und sparen Sie das große Lumen für die Verabreichung von Kolloiden während der Volumenbelastungsschritte.
4. Chirurgische Vorbereitung
- Führen Sie eine Mini-Laparotomie durch, mobilisieren Sie die Blase, führen Sie einen Foley-Katheter für die Urindrainage ein, blasen Sie den Ballon mit Kochsalzlösung auf und fixieren Sie den Katheter mit Beutelnähten.
- Verbinden Sie den Katheter mit einem Urinsammelbeutel, der die Urinmenge in ml anzeigt.
- Erhöhen Sie die FiO2 auf 1,0 und verabreichen Sie erneut 0,1 mg·kg-1 Pancuronium intravenös.
- Führen Sie eine mediane Sternotomie durch, indem Sie Elektrokauter zur Vorbereitung auf das Brustbein verwenden. Sezieren Sie das Brustbein vorsichtig vom umgebenden Gewebe. Führen Sie eine retrosternale Platzierung einer Kompresse durch, um Verletzungen zu vermeiden.
- Stoppen Sie die Belüftung und teilen Sie den Knochen mit einer oszillierenden Säge. Belüften Sie weiter und reduzieren Sie FiO2 auf 0,3. Verwenden Sie Elektrokauterie, um Blutungen zu reduzieren, und versiegeln Sie das Brustbein mit Knochenwachs.
- Mobilisieren Sie vorsichtig die Spitze der linken Lunge und teilen Sie den linken lateralen Teil des Zwerchfells, um die chirurgische Exposition zu erleichtern.
- Setzen Sie die absteigende Aorta proximal dem Zöliakiestamm durch sanftes Zurückziehen der linken Lunge aus, um eine ungestörte Beatmung zu gewährleisten und ein Trauma der linken Lunge zu vermeiden (Abbildung 2A) und teilen Sie das umgebende Gewebe (Abbildung 2B). Verabreichen Sie 7 ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloid, wenn eine hämodynamische Stabilisierung erforderlich ist.
- Legen Sie einen Overhold um die absteigende Aorta, um eine ordnungsgemäße Belichtung zu gewährleisten (Abbildung 2C).
- Befestigen Sie eine Strömungssonde um die absteigende Thoraxaorta (Abbildung 2D). Sicherstellung der richtigen Signalqualität durch Anschluss an das Durchflussmodul und synchrone Erfassungs hard- und software. Verwenden Sie Kontaktgel, um die Signalqualität bei Bedarf zu verbessern.
- Befestigen Sie eine Gefäßschlaufe um die absteigende Aorta, distal zur Strömungssonde, um den Bereich der Aortenkreuzklemmung zu markieren.
5. Bewertung und Datenerfassung
- Nullen Sie alle Katheter und Füllstandskatheter mit flüssigkeitsgefüllten Leitungen, die auf der rechten Vorhofebene platziert sind.
- Platzieren Sie Nadel-EKG-Elektroden und verbinden Sie diese mit der synchronen Erfassungs-Hard- und Software.
- Die Beurteilung der transkardiopulmonalen Thermodilution sowie Aortenfluss- und Druckmessungen wurden zuvor beschrieben 34.
- Führen Sie für die Messung des Herzzeitvolumens mit Hilfe der Thermodilution der Lungenarterien 3 Injektionen mit 10 ml kalter Kochsalzlösung durch und notieren Sie sich den Mittelwert, der von der grundlegenden Überwachungshardware angezeigt wird.
- Starten Sie die Laser-Doppler-Software, indem Sie einfach Startdrücken, und setzen Sie für jeden Messschritt eine Markierung, indem Sie die Schritte sorgfältig als M0 bis M5kennzeichnen.
6. Experimentelles Protokoll
- Führen Sie Baseline-Messungen (M0) durch.
- Durchführung der hämodynamischen Optimierung unter Verwendung von Volumenbeladungsschritten von 7 ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloid. Führen Sie jeden Volumenladeschritt über 5 Minuten mit Druckinfusionen durch. Nach Abschluss jedes Volumenladeschritts 5 Minuten für die Äquilibrierung einplanen. Beginnen Sie mit der Volumenbelastung, bis der Anstieg des Herzzeitvolumens <15% beträgt.
- Wiederholungsmessungen (M1) nach Abschluss der hämodynamischen Optimierung.
- Induzieren Sie Ischämie / Reperfusion für insgesamt 48 Minuten supra-zöliakie-Aorten-Kreuzklemmung, indem Sie eine Aortenklemme an der markierten Stelle platzieren.
- Wenden Sie die Aortenklemmung in aufsteigender Reihenfolge von 1-, 2-, 5-, 10- und 30-minütigen Intervallen an, um das Überleben der Tiere während des Studienprotokolls zu verbessern.
- Setzen Sie die Aortenkreuzklemmung nach jedem Intervall nach maximal 5 Minuten oder nach Normalisierung des Flusses der Oberschenkelarterie fort.
- Führen Sie einen manuellen Zuflussverschluss der unteren Hohlvene durch, um Blutdruckerhöhungen von > mittleren arteriellen Druck von 100 mmHg zu verhindern.
- Verabreichen Sie bei Bedarf während der Klemmphase Bolusinjektionen von Noradrenalin oder Adrenalin, um eine Abnahme des mittleren arteriellen Drucks unter 40 mmHg zu verhindern.
- Wiederholen Sie die Messungen am Ende des 30-minütigen Spannintervalls vor der Reperfusion (M2).
- Öffnen Sie allmählich die Klemme, um die hämodynamische Stabilität zu gewährleisten. Schließen Sie die Klemme, wenn der Blutdruck zu schnell sinkt und lassen Sie eine Stabilisierung zu.
- Zur Stabilisierung werden 7ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloide sowie zusätzliche Bolusinjektionen von 10-20 μg Noradrenalin und/oder Adrenalin verabreicht. Verabreichen Sie 2 ml kg-1 von 8,4% Natriumbicarbonat, wenn der pH-Wert unter 7,1 fällt. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz richtig eingestellt wird, um Normocapnia sicherzustellen.
- Wiederholung der Messungen 1 h nach der Reperfusion (M3).
- Wiederholen Sie die hämodynamische Optimierung wie unter 6.2 beschrieben, und wiederholen Sie die Messungen (M4).
- Führen Sie die abschließenden Messungen 4,5 h nach der Induktion der Ischämie/Reperfusion (M5) durch.
7. Sterbehilfe
- Verabreichen Sie 40 mmol Kaliumchlorid intravenös zur Euthanasie, um Kammerflimmern und Asystolie zu induzieren.
- Beenden Sie die Beatmung und entfernen Sie alle Katheter.
8. Organraub
- Legen Sie das Tier in eine Bauchlage und entfernen Sie die Nadelsonden sowie die Drainage.
- Legen Sie die Wirbelsäule durch Hautschnitt und Entfernung von Muskelgewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette frei.
- Verwenden Sie eine oszillierende Säge, um den Wirbelbogenparamedian auf beiden Seiten zu teilen, und entfernen Sie den dorsalen Teil des Wirbelknochens, indem Sie den Dornfortsatz vorsichtig seitwärts bewegen, um die verbleibenden Verbindungen zu lösen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um das Rückenmark vorsichtig von den kaudalen bis zu den schädelförmigen Enden anzuheben, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Spinalnerven zu schneiden, um das Rückenmark zu entfernen.
- Lagern Sie das Rückenmark in 4% Formalin bis zur weiteren Verwendung zur histopathologischen Beurteilung oder Mikrosphärenquantifizierung.
9. Statistische Auswertung
- Verwenden Sie statistische Software.
- Stellen Sie die Normalverteilung sicher, indem Sie bei Bedarf Histogramme und Log-Transformationsvariablen überprüfen.
- Die abhängigen Variablen - Rückenmarksfluss, Herzzeitvolumen, Herzfrequenz, Schlagvolumen, systolischer arterieller Druck, mittlerer arterieller Druck, diastolischer arterieller Druck, zentraler Venendruck, systemischer Gefäßwiderstand - sowie Mikroperfusion des oberen und unteren Rückenmarks, wie sie mit fluoreszierenden Mikrosphären bewertet wird, falls gewünscht - allgemeinen linearen Mixed-Model-Analysen unter Verwendung der Routine GENLINMIXED für kontinuierliche Daten mit einer Identitätsverbindungsfunktion.
- Verwenden Sie Baseline-Anpassungen.
- Geben Sie Modelle mit festen Effekten für variable Baseline und Messpunkt an. Betrachten Sie den Messpunkt als wiederholte Messungen bei Tieren.
- Melden Sie p-Werte der festen Effekte für den Messpunkt für jeden Parameter.
- Verwenden Sie für die Analyse der fluoreszierenden Mikrosphäre des Rückenmarks zusätzlich die Region (unteres Rückenmark, oberes Rückenmark) als festen Effekt und Interaktion zwischen Region und Messpunkt, um die Wechselwirkungen zwischen Regionen und Messpunkten zu bewerten, und melden Sie p-Werte fester Effekte für die Interaktion.
- Berechnen Sie den baselinebereinigten Grenzwert mit einem 95%-Konfidenzintervall (CI) für alle abhängigen Variablen an den Messpunkten M1-M5, gefolgt von paarweisen Vergleichen über Tests mit der geringsten signifikanten Differenz.
- Variablen als Mittelwert ausdrücken (95% CI). Geben Sie das Tiergewicht als Mittelwert ± Standardabweichung aus.
- Präsentieren Sie unbereinigte p-Werte.
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Representative Results
Alle sechs Tiere überlebten bis zum Abschluss des Protokolls. Das Tiergewicht betrug 48,2 ± 2,9 kg; fünf Tiere waren männlich und ein Tier war weiblich. Das Einsetzen der Rückenmarksnadelsonde sowie die Messung des Rückenmarksflusses war bei allen Tieren möglich.
Beispiele für mikrozirkulatorische Aufzeichnungen des Rückenmarks in Echtzeit in Kombination mit zerebralen mikrozirkulatorischen und makrohämodynamischen Aufzeichnungen während der Aortenkreuzklemmung zur Ischämieinduktion sowie während des Entspannens und der Reperfusion sind in Abbildung 3A, Abbildung 3Bdargestellt. Auf die Störung des absteigenden Aortenflusses folgte eine deutliche Abnahme des Rückenmarksflusses, während der Druck in der aufsteigenden Aorte zunahm (Abbildung 3A). Reperfusion führte zu entgegengesetzten Effekten (Abbildung 3B).
Die statistische Analyse der makro- und mikrozirkulatorischen Parameter ist in Tabelle 1 dargestellt. Mixed-Model-geschätzte marginale Mittelwerte und ihre Konfidenzintervalle weisen auf eine deutliche Reduktion des Rückenmarksflusses während der Ischämie hin. Im Gegensatz dazu nahm der zerebrale Fluss während der Ischämie deutlich zu, wie die geschätzten Randmittelwerte und ihre Konfidenzintervalle zeigen. Dies wurde von einem Anstieg des arteriellen Drucks, der Herzfrequenz und des systemischen Gefäßwiderstands begleitet, während das Herzzeitvolumen und das Schlagvolumen abnahmen. Die fluoreszierende Mikrosphärenanalyse ergab eine deutliche Abnahme des mikrozirkulatorischen Blutflusses des Rückenmarks im unteren Rückenmark, während es keine signifikante Veränderung des oberen Rückenmarks gab, wie die geschätzten Marginalmittel und ihre Konfidenzintervalle zeigen. Reperfusion führte zu gegenteiligen Effekten. Obwohl das Herzzeitvolumen, das Schlagvolumen und der arterielle Druck am Ende des Protokolls weiter abnahmen, waren der Rückenmarksfluss sowie der mikrozirkulatorische Blutfluss des Rückenmarks stabil.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die Fähigkeit von Laser/Doppler-Nadelsonden, Veränderungen der Rückenmarksmikroperfusion in Echtzeit zu erkennen. Wie erwartet, war die Abnahme der Mikrozirkulation des Rückenmarks während der Ischämie drastisch mit minimalem mikrozirkulatorischem Fluss. Die Wiederherstellung des Rückenmarksflux erfolgte nach der Reperfusion. Die untere Rückenmarksperfusion, wie sie mit fluoreszierenden Mikrosphären beurteilt wurde, zeigte ein vergleichbares Verhalten und unterstützte somit die Methode. Wie erwartet, zeigten die Durchblutung des oberen Rückenmarks und der zerebrale Fluss unterschiedliche Verhaltensweisen. Obwohl die Mikrozirkulation des Rückenmarks stabil war, nahm die Makrozirkulation am Ende des Protokolls ab, was einen Verlust der hämodynamischen Kohärenz zeigte. Während der Fluss in der absteigenden Aorta während der Ischämie Null war, führte die Reperfusion zu einer Wiederherstellung des Aortenflusses. Histopathologische Analysen ergaben eine leichte Nekrose des Rückenmarks mit Kleinman-Scores für das untere Rückenmark zwischen 0 und 2 und für das obere Rückenmark zwischen 0 und 1.
Abbildung 1:Platzierungder Laser/Doppler-Nadelsonde im Rückenmark. (A) Chirurgische Exposition von Wirbelstrukturen. (B) Punktion des Rückenmarks mit einem Venenkatheter. (C) Einführen der Nadelsonde nach Entfernung der Inlay-Nadel. (D) Fixierung der Nadelsonde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Exposition der absteigenden Aorta und Platzierung von Strömungssonde und Gefäßschleife. (A) Exposition der absteigenden Aorta nach Mobilisierung der Spitze der linken Lunge und Teilung des links-lateralen Teils des Zwerchfells. (B) Teilung des umgebenden Gewebes für chirurgische Exposition. (C) Platzierung eines Übergriffs um die absteigende Aorta, um eine ordnungsgemäße kreisförmige Exposition zu gewährleisten. (D) Platzierung der Strömungssonde sowie der Gefäßschleife um die absteigende Aorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Probenaufnahmen von mikrozirkulatorischen und makrohämodynamischen Signalen während der Ischämie sowie der Reperfusion. Probenaufnahmen des EKGs, des Drucks in der aufsteigenden Aorta, gemessen mit einem Mikrospitzenkatheter, des Flusses in der absteigenden Aorta, gemessen mit einer Ultraschall-Durchflusssonde, des Rückenmarks sowie des zerebralen mikrozirkulatorischen FLUX, gemessen mit Laser-/Dopplernadelsonden. (A) 50 s Probe während der Ischämie-Induktion durch supra-zöliakie-Aorten-Kreuzklemmung. (B) 20 s Probe während der Reperfusionsinduktion durch sanftes Wiederöffnen der Aortenkreuzklemme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| M1 | M2 | M3 | M4 | M5 | ||
| Rückenmarksfluss | 61.35 (41.96-89.70) | 6.78 (4.63-9.91) | 58.97 (40.33-86.22) | 66.05 (45.17-96.57) | 59.09 (40.41-86.40) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,878 | p = 0,777 | p = 0,886 | |
| Zerebraler Fluss | 41.12 (28.17-60.04) | 71.73 (49.13-104.73) | 60.34 (41.33-88.10) | 59.91 (36.93-78.71) | 49.82 (34.12-72.74) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p = 0,023 | Paarweiser Vergleich M1 | p = 0,001 | p = 0,045 | p = 0,173 | p = 0,341 | |
| Rückenmarks-Mikroperfusion (ml/min/g) | Oberes Rückenmark | 0.071 (0.058-0.087) | 0.063 (0.052-0.078) | 0.088 (0.072-0.11) | 0.082 (0.067-0.100) | 0.083 (0.068-0.102) |
| Paarweiser Vergleich M1 | p = 0,420 | p = 0,146 | p = 0,344 | p = 0,281 | ||
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | ||||||
| Unteres Rückenmark | 0.079 (0.065-0.097) | 0.031 (0.026-0.039) | 0.111 (0.090-0.136) | 0.089 (0.073-0.110) | 0.105 (0.086-0.129) | |
| Interaktionsmesspunkt · Rückenmarksregion: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,021 | p = 0,400 | p = 0,051 | |
| Herzzeitvolumen (l/min) | 4.15 (3.69-4.61) | 3.13 (2.67-3.60) | 3.30 (2.84-3.76) | 3.67 (3.20-4.13) | 2.67 (2.00-2.93) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,007 | p = 0,125 | p < 0,001 | |
| Herzfrequenz (bpm) | 74.42 (53.70-95.15) | 131.09 (110.36-151.82) | 88.92 (68.19-109.65) | 80.62 (59.89-101.35) | 99.38 (78.65-120.11) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p = 0,002 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,314 | p = 0,666 | p = 0,092 | |
| Hubvolumen (ml) | 55.50 (49.20-61.81) | 25.33 (19.03-31.64) | 37.00 (30.69-43.31) | 45.33 (39.03-51.64) | 27.17 (20.86-33.47) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p < 0,001 | p = 0,004 | p < 0,001 | |
| Systolischer arterieller Druck Aufsteigende Aorta (mmHg) | 94.36 (85.20-103.52) | 122.05 (112.89-131.20) | 76.72 (67.56-85.88) | 88.36 (79.20-97.52) | 73.36 (64.20-82.52) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,006 | p = 0,321 | p = 0,002 | |
| Mittlerer arterieller Druck aufsteigende Aorta (mmHg) | 78.18 (68.68-87.67) | 107.29 (97.80-116.78) | 59.08 (49.58-68.57) | 70.38 (60.89-79.87) | 58.35 (48.85-67.84) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,005 | p = 0,217 | p = 0,004 | |
| Diastolischer arterieller Druck Aufsteigende Aorta (mmHg) | 59.20 (49.41-69.00) | 93.76 (83.97-103.56) | 45.18 (35.38-54.98) | 52.48 (42.69-62.28) | 45.33 (35.54-55.13) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,038 | p = 0,302 | p = 0,040 | |
| Systemischer Gefäßwiderstand (dyn x sec x cm-5) | 1421.13 (1236.94-1632.74) | 208089.94 (181128.10-239085.87) | 1335.36 (1162.29-1534.21) | 1412.62 (1229.54-1622.97) | 1807.46 (1573.21-2076.60) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p < 0,001 | Paarweiser Vergleich M1 | p < 0,001 | p = 0,407 | p = 0,938 | p = 0,005 | |
| Strömung (l/min) Absteigende Aorta | 3.27 (0.96-5.58) | 0 | 3.27 (0.96-5.58) | 3.54 (1.23-5.85) | 4.54 (2.32-6.85) | |
| Haupteffekt-Messpunkt: p = 0,003 | Paarweiser Vergleich M1 | p = 0,998 | p = 0,844 | p = 0,381 | ||
Tabelle 1: Änderungen der hämodynamischen Parameter während des Protokolls. Die Werte werden als basislinienbereinigte geschätzte Grenzmittelwerte mit 95%-Konfidenzintervallen angegeben. Für jeden Parameter werden unbereinigte p-Werte von F-Tests der Haupteffekte des Messpunktes sowie von Interaktionseffekten zwischen Region und Messpunkt für die Mikroperfusion des oberen und unteren Rückenmarks angegeben. Es werden auch unbereinigte p-Werte von paarweisen Vergleichen einzelner Messpunkte mit M1 dargestellt. Messpunkte sind: M1 = Hämodynamische Optimierung vor Ischämie/Reperfusion, M2 = Während der Ischämie, M3 = 1 h nach Reperfusion M4 = Hämodynamische Optimierung nach Ischämie/Reperfusion, M5 = 4,5 h nach Induktion der Ischämie/Reperfusion.
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Discussion
Die durch Rückenmarksischämie induzierte Rückenmarkslähmung ist eine Hauptkomplikation der Aortenreparatur mit enormen Auswirkungen auf das Patientenergebnis1,2,3,4,10,11,12. Mikrozirkulations-zielgerichtete Therapien zur Vorbeugung und Behandlung von Rückenmarksverletzungen sind am vielversprechendsten. Das Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode für die mikrozirkulatorische Bewertung des Rückenmarks in Echtzeit und bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen neuartiger therapeutischer Ansätze auf die Mikrozirkulation des Rückenmarks unter Ischämie- / Reperfusionsbedingungen zu bewerten.
Es gibt einige kritische methodische Schritte in diesem experimentellen Modell. Um den Verlust von Tieren zu verhindern, müssen die Forscher Erfahrung in anästhesiologischen Techniken (Zerebrospinalflüssigkeitsdrainageinsertion, sonographischer Gefäßzugang und hämodynamische Therapie während der Aortenexposition, Aortenkreuzklemmung und Reperfusion) sowie in chirurgischen Techniken (Sternotomie, Gefäßexposition, chirurgische Exposition der absteigenden Aorta) haben. Das Einführen der Rückenmarksnadelsonde erfordert Erfahrung, profunde Kenntnisse der Anatomie und fundierte technische Fähigkeiten. Nach unserer Erfahrung ist die Lernkurve jedoch beträchtlich steil, und die meisten erfahrenen Forscher werden in kurzer Zeit Erfolge erzielen, obwohl mehrere Versuche vermieden werden müssen, um Rückenmarksverletzungen zu verhindern, die die Methodik beeinträchtigen könnten.
Ein weiterer kritischer Schritt ist der Wechsel von der rechten seitlichen in die Rückenlage, um eine Luxation oder Beschädigung der Rückenmarksnadelsonde zu verhindern. Für dieses Manöver werden 4-5 Personen empfohlen, eine ordnungsgemäße Polsterung der Einführstelle ist unerlässlich, und es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, die Sonde nicht zu verrenken. Die Exposition der absteigenden Aorta erfordert auch einige kritische Schritte. Die Spitze der linken Lunge muss mobilisiert werden, um ein sanftes Zurückziehen der linken Lunge zu ermöglichen, um das Operationsfeld freizulegen. Darüber hinaus sollte der linksseitige Teil der Membran seziert werden, um die Exposition zu erleichtern. Während der Aortenvorbereitung ist eine optimale Kommunikation zwischen den Forschern, die eine Operation durchführen, und denen, die Anästhesie und hämodynamisches Management durchführen, erforderlich, um eine ausreichende kardiopulmonale Stabilität zu gewährleisten. Während der Aortenkreuzklemmung wird eine manuelle Kompression der unteren Hohlvene empfohlen, um den venösen Rückfluss zu reduzieren. Ohne dieses Manöver kann es zu starken Nachlasterhöhungen kommen, die zu einer schädlichen Myokardverletzung führen können39,40.
Die Reperfusion sollte vorsichtig mit gebrauchsfertigen Flüssigkeiten, Vasopressoren und Inotropen durchgeführt werden. Während der Reperfusion treten dramatische Veränderungen auf, die zu schwerer Hypotonie, Herzrhythmusstörungen und Kreislaufversagen führen können41. Die vorsichtige Beobachtung des hämodynamischen Verhaltens, die rechtzeitige Einleitung von Eingriffen sowie die Verwendung einer strukturierten und sanften Leistung in dieser kritischen Phase können jedoch den Verlust von Tieren verhindern. Darüber hinaus induziert die Verwendung von aufsteigenden Intervallen der Aortenkreuzklemmung, gefolgt von Zeiträumen zur Verbesserung der Regeneration, wie sie im Protokoll verwendet werden, ischämische Präkonditionierungseffekte, die die hämodynamische Stabilität während der Reperfusion verbessern42,43.
Das Modell bietet die Möglichkeit, die Mikrozirkulation des Rückenmarks zusätzlich zur makrozirkulatorischen Bewertung zu überwachen. Aufgrund des Verlustes der hämodynamischen Kohärenz, der häufig bei Hochrisikooperationen und kritisch kranken Patienten auftritt, ist eine direkte Beurteilung der Mikrozirkulation des Rückenmarks erforderlich13,30. Die sublinguale Mikrozirkulation wird häufig verwendet, um die direkte mikrozirkulatorische Bewertung im interessierenden Organ zu ersetzen44. Es wurde jedoch eine Dissoziation zwischen sublingualer Mikrozirkulation und lebenswichtigen Organen gezeigt, was den Wert der direkten mikrozirkulatorischen Bewertung im Rückenmark unterstreicht, wie sie im experimentellen Modell45verwendet wird. Schließlich hat das Modell den Vorteil der Echtzeitüberwachung des Blutflusses des Rückenmarks im Vergleich zur Fluoreszenzmiksphärenbewertung, die durch intermittierenden Einsatz und Post-mortem-Analyse begrenzt ist46. Die Auswirkungen der Echtzeitbewertung können am besten gesehen werden, wenn man sich Beispielaufzeichnungen während der Ischämie sowie der Reperfusionsinduktion ansieht, die schnelle Veränderungen der Mikroperfusion des Rückenmarks zeigen. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass das Einsetzen einer Laser-Dopplersonde in das Rückenmark zu kleinen, aber erheblichen Verletzungen des Rückenmarks führen kann.
Da die Integrität des Rückenmarks möglicherweise die hämodynamischen Parameter beeinflussen könnte, könnte dies ein Nachteil der Methode sein. Die Verwendung von Laser-Doppler-Techniken zur Beurteilung der Mikroperfusion des Rückenmarks wurde jedoch zuvor verwendet47,48,49,50. Obwohl wir keine hämodynamischen Veränderungen nach dem Einsetzen der Sonde beobachteten, konnten wir hämodynamische Effekte, die durch diese Methode induziert wurden, nicht ausschließen. Es sollte beachtet werden, dass hämodynamische Veränderungen auch durch die Verwendung von Mikrosphäreninjektionen induziert werden können, die jedoch bei großen Tieren von untergeordneter Bedeutungwären 51. Darüber hinaus kann die sensorische oder motorische Funktion durch das Einsetzen der Sonde beeinträchtigt werden, weshalb die Verwendung einer sensorisch oder motorisch evozierten Potenzialbewertung in Kombination mit einer Laser-Doppler-Bewertung mit Vorsicht durchgeführt werden sollte.
In dieser Hinsicht könnte die Mikrosphäreninjektionstechnik von Vorteil sein. Darüber hinaus sollten die Techniken nicht für chronische Studien verwendet werden; Dies gilt jedoch auch für Mikrosphäreninjektionen, die auf akute Studien beschränkt sind, da sie auf eine postmortale Gewebeanalyse angewiesen sind. Die meisten Studien mit Laser-Doppler-Techniken wurden an Kleintieren durchgeführt47,48,49,50 Hier beschreiben wir eine Technik für den Einsatz bei Schweinen als Großtiermodell, die die Translation in klinische Studien erleichtern könnte. Die Paramedian-Einführungstechnik überwindet das Problem großer Dornfortsätze bei Schweinen, was die richtige Platzierung von Rückenmarkssonden erschwert. Darüber hinaus hat die Technik den Vorteil, dass eine Laminektomie oder Entfernung von Duragewebe nicht erforderlich ist, wodurch ein ständiger Liquorverlust verhindert wird. Da der Liquordruck einen enormen Einfluss auf die Rückenmarksperfusion32hat, hat das Modell den Vorteil, dass es neben der Rückenmarksmikroperfusion auch den Druck der Zerebrospinalflüssigkeit messen und optimieren kann, und wird in zukünftigen Projekten die Wirkung des Liquordrucks auf die Mikroperfusion des Rückenmarks berücksichtigen.
Das Protokoll hat einige Einschränkungen, die erwähnt werden sollten. Die absoluten Werte des Rückenmarksflusses unterscheiden sich zwischen den Tieren aufgrund von Unterschieden in der genauen Sondenposition und der Nähe größerer Rückenmarksgefäße erheblich. Daher sollten beim Vergleich von Werten Baseline-Anpassungen durchgeführt werden. Intraindividuelle Unterschiede zwischen den Messpunkten sind jedoch sehr konsistent, solange akribische Vorsicht walten gelassen wird, um Bewegungen der Nadelsonde während des Protokolls zu vermeiden. Darüber hinaus wurde diese Studie nicht als Vergleichsstudie zwischen der Laser-Doppler- und der fluoreszierenden Mikrosphärenmethode konzipiert. Angesichts der Anzahl der Tiere haben wir keine Korrelationsanalyse zwischen diesen beiden Methoden durchgeführt.
Obwohl beide Methoden ein vergleichbares Verhalten mit signifikanten Reduktionen während der Ischämie und der Genesung nach Reperfusion für beide zeigten, sollte ein Vergleich der Methoden in Zukunft mit richtig konzipierten Studien durchgeführt werden. Dennoch ermöglichte die Verwendung von Mikrosphären zusätzlich die Bewertung unterschiedlicher Verhaltensweisen für die Mikroperfusion des oberen und unteren Rückenmarks. Darüber hinaus ergab die histopathologische Analyse nur eine moderate Rückenmarksnekrose im Vergleich zu anderen Modellen der Rückenmarksischämie37. Die Verlängerung der Dauer der Ischämie sowie das Weglassen von Vorkonditionierungsmaßnahmen können zu schwereren Veränderungen führen, die von einigen Forschern gewünscht werden können. Obwohl wir nur leichte histopathologische Veränderungen untersucht haben, kann dies bei einer längeren Dauer der Ischämie anders sein. In dieser Hinsicht kann ein längerer Zeitraum nach Ischämie/Reperfusion vor Beendigung des Protokolls auch zu schwereren histopathologischen Veränderungen geführt haben. Das Protokoll ermöglichte jedoch eine hämodynamische Stabilität eine Stunde nach der Reperfusion, ohne dass eine zusätzliche oder sogar kontinuierliche Inotrop- oder Vasopressoranwendung erforderlich war.
Für die Bewertung verschiedener hämodynamischer Eingriffe bietet dieses Modell optimale Bedingungen. Obwohl wir die Fluidoptimierung als Beispiel für eine hämodynamische Intervention verwendet haben, können andere Ansätze mit dieser Methode bewertet werden. Während dieses Protokoll eine mikrozirkulatorische Bewertung in einem Modell der Ischämie / Reperfusion ermöglicht, begrenzt die Dauer der Ischämie die Bewertung therapeutischer Ansätze während der Ischämie vor der Reperfusion. Darüber hinaus trat während der Ischämie eine Variation der hämodynamischen Veränderungen auf (z. B. Bluthochdruck, Hypotonie, Tachykardie, Bradykardie sowie Herzrhythmusstörungen). Der manuelle Zuflussverschluss beeinflusst die hämodynamischen Variablen während dieser Phase weiter. Daher wird das Protokoll nicht für die Bewertung therapeutischer Ansätze während der Ischämie vor der Reperfusion empfohlen. Andere experimentelle Einstellungen, wie die Verwendung von Embolisations- oder Ligationstechniken, können jedoch mit der Bewertung von Rückenmarkslaser/ Dopplernadelsonden kombiniert werden, wie in diesem Protokoll beschrieben.
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Disclosures
Constantin J.C. Trepte hat einen Ehrenpreis für Vorträge von Maquet erhalten. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Diese Studie wurde vom European Society of Anaesthesiology Young Investigator Start-Up Grant 2018 unterstützt.
Acknowledgments
Die Autorinnen und Autoren danken Lena Brix, V.M.D, Institut für Tierversuche, Medizinische Hochschule Hannover, sowie Frau Jutta Dammann, Versuchstierpflegeeinrichtung, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland, für die prä- und perioperative Tierpflege und ihre technische Unterstützung beim Umgang mit Tieren. Die Autoren danken ferner Dr. Daniel Manzoni, Klinik für Gefäßchirurgie, Hôpital Kirchberg, Luxemburg, für seine technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioMed Flowmeter | Medistim AS, Oslo, Norway | CM4000 | Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery |
| CardioMed Flow-Probe, 5mm | Medistim AS, Oslo, Norway | PS100051 | Flow-Probe Femoral Artery |
| COnfidence probe, | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | MA16PAU | Flow-Probe Aorta |
| 16 mm liners | |||
| DIVA Sevoflurane Vapor | Dräger Medical, Lübeck, Germany | Vapor | |
| Hotline Level 1 Fluid Warmer | Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany | HL-90-DE-230 | Fluid Warmer |
| Infinity Delta | Dräger Medical, Lübeck, Germany | Basic Monitoring Hardware | |
| Infinity Hemo | Dräger Medical, Lübeck, Germany | Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware | |
| LabChart Pro | ADInstruments Ltd., Oxford, UK | v8.1.16 | Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software |
| LiquoGuard 7 | Möller Medical GmbH, Fulda, Germany | Cerebrospinal Fluid Drainage System | |
| Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) | ADInstruments Ltd., Oxford, UK | SPR-350 | Pressure-Tip Catheter Aorta |
| moor VMS LDF | moor Instruments, Devon, UK | Designated Laser-Doppler Hardware | |
| moor VMS Research Software | moor Instruments, Devon, UK | Designated Laser-Doppler Software | |
| Perivascular Flow Module | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | TS 420 | Flow-Module for Flow-Probe Aorta |
| PiCCO 2, Science Version | Getinge AB, Göteborg, Sweden | v. 6.0 | Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software |
| PiCCO 5 Fr. 20cm | Getinge AB, Göteborg, Sweden | Thermistor-tipped Arterial Line | |
| PowerLab | ADInstruments Ltd., Oxford, UK | PL 3516 | Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware |
| QuadBridgeAmp | ADInstruments Ltd., Oxford, UK | FE 224 | Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition |
| Silverline | Spiegelberg, Hamburg, Germany | ELD33.010.02 | Cerebrospinal Fluid Drainage |
| SPSS statistical software package | IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA | v. 27 | Statistical Software |
| Twinwarm Warming System | Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany | 12TW921DE | Warming System |
| Universal II Warming Blanket | Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany | 906 | Warming Blanket |
| VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) | moor Instruments, Devon, UK | Laser-Doppler Probe | |
| Zeus | Dräger Medical, Lübeck, Germany | Anesthesia Machine |
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