方法文章

可靠地工程和控制哺乳动物细胞中稳定的光遗传学基因回路

DOI：

10.3791/62109

⸱

2021年7月6日

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要光遗传学方法的标准化。为了实现这一目标，本研究概述了基因电路构建，细胞工程，光遗传学设备操作和验证分析的管道，以标准化使用负反馈光遗传学基因电路作为案例研究的光诱导基因表达研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

无论使用何种方法，哺乳动物细胞中可靠的基因表达控制都需要具有高折叠变化、低噪声和确定的输入到输出传递函数的工具。为了实现这一目标，光遗传学基因表达系统在过去十年中因哺乳动物细胞中蛋白质水平的时空控制而受到广泛关注。然而，大多数控制光诱导基因表达的现有电路在结构上各不相同，由质粒表达，并利用可变光遗传学设备，因此需要探索稳定细胞系中光遗传学成分的表征和标准化。在这里，该研究提供了可靠的基因电路构建，整合和表征的实验管道，用于控制哺乳动物细胞中的光诱导基因表达，以负反馈光遗传学电路为例。这些方案还说明了标准化光遗传学设备和光照制度如何可靠地揭示基因电路特征，如基因表达噪声和蛋白质表达幅度。最后，本文可能适用于希望采用这种技术的光遗传学不熟悉的实验室。这里描述的管道应该适用于哺乳动物细胞中的其他光遗传学回路，从而可以在哺乳动物细胞的转录，蛋白质组学和最终表型水平上更可靠，更详细地表征和控制基因表达。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，允许使用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题1，2。合成生物学中已经建立了许多控制系统的一个领域是基因表达调控领域3，4。基因表达控制可以靶向蛋白质水平和变异性（噪声或变异系数，CV = σ/μ，作为平均值的标准偏差测量），这是关键的细胞特征，因为它们在生理和病理细胞状态中的作用5，6，7，8。许多可以控制蛋白质水平和噪声的合成系统4，9，10，11，12 已经过设计，为跨工具标准化协议创造了机会。

最近出....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 基因电路设计

  1. 选择遗传成分以组合成单个基因回路/质粒（例如，哺乳动物DNA整合序列基序32，光响应元件33或功能基因34）。
  2. 使用任何基因工程和/或分子克隆软件，存储DNA序列以供以后使用和参考，注释每个序列，并检查所有必要的特征（例如，START密码子，调控或翻译序列）35。
  3. 根据整体基因电路设计开发或采用零件36。例如，对于 LITers11 中的光遗传学抑制因子，融合编码能够进行光诱导降解37，38 或灭活抑制因子 DNA 结合能力39 的基因序列，该基因序列与抑制基因（例如，TetR）的框架相邻并处于抑制基因框架中4。
    1. 对于光遗传学激活剂，确保存在激活剂结构域40 ，该激活剂结构域可在光诱导的DNA结合时促进基因表达41。对于阴性或阳性的自调节，确保在调节....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文中的基因电路组装和稳定细胞系生成基于含有转录活性，单个稳定FRT位点的商业改良HEK-293细胞（图1）。基因回路被构建到质粒内具有FRT位点的载体中，允许Flp-FRT整合到HEK-293细胞基因组中。这种方法不仅限于Flp-In细胞，因为FRT位点可以使用DNA编辑技术（如CRISPR / Cas950）添加到基因组中任何感兴趣的细胞系中。

一旦构建并验证了正确的插入，LPA和IRIS软件就被选为基因表达光诱导的标准化方案31，51。LPA系统允许对24个孔进行编程，以便在多种实验条件下诱导哺乳动物细胞，具体取决于光强度，脉冲持续时间和占空比（图2）。在本文中，对空间上均匀的光强度、脉冲持续时间和占空比进行了优先排序。然而，研究人员可以使用IRIS软件和LPA对时间光波模式进行更高级的编程。<.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文的读者可以深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）至关重要的步骤，包括1）基因回路的设计，构建和验证;2）用于将基因电路引入稳定细胞系的细胞工程（例如，Flp-FRT重组）;3）使用基于光的平台（如LPA）诱导工程电池;4）通过荧光显微镜对光诱导测定进行初始表征;5）通过各种测定进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术，定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或免疫荧光测定。

此外，上述方法对于表达目的基因的任何基因电路架构都是高度模块化的，在电路构建步骤和进行测定时进行了主要的潜在方案修改。在基因电路构建的情况下，分子克隆的灵活性允许任何目的基因与荧光标记物交换或共表达，并对引物设计或组装方案进行微小的修改。此外，虽然这里概述的程序主要集中在NF基因电路设计上，以实现精确（低噪声）基因表达控制，但可以实施其他架构，如正调控或正反馈（PF），以实现不同的特征，如高倍变化或高基因表达噪声，分别56，57.使用各种基因电路架构（例如PF，NF等）可以使研究.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢Balázsi实验室的意见和建议，Karl P. Gerhardt博士和Jeffrey J. Tabor博士帮助我们构建了第一个LPA，以及Wilfried Weber博士分享了LOV2-degron质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院[R35 GM122561和T32 GM008444]的支持;劳弗物理与定量生物学中心;以及国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金。开放获取费用的资金:NIH [R35 GM122561]。

作者贡献:M.T.G.和G.B.构思了这个项目。M.T.G.，D.C.和L.G.进行了实验。M.T.G.、D.C.、L.G.和G.B分析了数据并准备了手稿。G.B.和M.T.G.监督了这个项目。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR 管进行 PCREppendorf951010006
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CI试剂，用于分离和收获哺乳动物细胞
0.5-10 &μ;L 可调量程移液器Eppendorf3123000020工具，用于移液反应
100-1000 &μ;L 可调量程移液器Eppendorf3123000039工具，用于
20-200 &mu 的移液反应;L 可调容量移液器Eppendorf3123000055工具，用于
2-20 &mu 的移液反应;L 可调体积移液器Eppendorf3123000039工具，用于移液反应
5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞过滤器盖康宁352235试剂，用于流式细胞术
5702R 离心机，带 4 x 100 转子、15 和 50 mL 适配器、120 VEppendorf22628113用于哺乳动物培养工作的设备
琼脂糖Denville ScientificGR140-500凝胶电泳试剂
用于 96 孔板的铝箔VWR®60941-126用于在光诱导实验中覆盖板的工具
氨苄青霉素Sigma AldrichA9518-5G试剂，用于选择具有正确质粒的细菌
模拟涡旋混合器Thermo Fisher Scientific02215365PR工具，用于进行 PCR、转化或凝胶提取反应
Bacto 脱水琼脂Fisher ScientificDF0140010试剂生长细菌
BD LSRAriaBD656700用于将工程细胞系分选为单克隆群体的工具
BD LSRFortessa用于表征工程细胞系BD649225
BSA、牛血清 白蛋白政府科学来源SIGA4919-1G试剂，用于 IF 孵育缓冲液
细胞培养板 12 孔，透明，平底，带盖，聚苯乙烯，无热原，标准 TC 康宁353043板，用于单克隆细胞培养
离心VWR22628113用于哺乳动物细胞培养的
仪器 化学通风橱N/AN/A用于进行 IF 反应
仪器 透明细胞培养板 24 孔 平底 带盖BD353047用于培养单克隆细胞的板
CytoOne T25 过滤帽 TC 培养瓶USA ScientificCC7682-4825用于培养哺乳动物细胞的容器
二甲基亚砜 （DMSO）Fischer ScientificBP231-100试剂，用于冷冻工程化哺乳动物细胞
化乙锭Thermo Fisher Scientific15-585-011凝胶电泳试剂
Falcon 96 孔透明平底 TC 处理培养微孔板，带盖康宁353072容器，用于培养分选单克隆细胞
FCS ExpressDe Novo 软件：N/A软件，用于表征流式细胞术数据
胎牛血清，常规，USDA 500 mL康宁35-010-CV试剂，用于哺乳动物细胞生长
Fisherbrand 带透明盖培养皿 - 凸起的脊;100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712设备，用于培养细菌
Gibco DMEM，高葡萄糖Thermo Fisher Scientific11-965-092试剂，用于培养哺乳动物细胞
Hs00932330_m1 KRAS 亚型 a Taqman 基因表达检测Life Technologies4331182qPCR 探针
潮霉素 B （50 mg/mL），20 mLLife Technologies10687-010试剂，用于选择具有适当基因电路集成的细胞
iScript 逆转录超混合液Bio-Rad Laboratories1708890RNA 转化为 cDNA
的试剂实验室冷冻仪 -20 °CVWR76210-392
冷冻箱 -80 &度储存实验试剂设备C松下MDF-U74VC实验试剂储存设备
实验室冰箱 +4 °CVWR76359-220用于储存实验试剂的设备
LB 肉汤 （Lennox），1 kgSigma-AldrichL3022-250G用于细菌生长的试剂
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008研究，用于将基因电路转染到哺乳动物细胞中
MATLAB 2019MathWorksN/A软件，用于分析实验数据
甲醇Acros Organics免疫荧光反应
微量离心管，聚丙烯 1.7 mLVWR20170-333塑料器皿容器
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman 基因表达检测Life Technologies4331182qPCR 探针
MultiTherm 摇床Benchmark ScientificH5000-HC细菌设备转化
NanoDrop Lite 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-NDL-US-CAN设备，用于 DNA/RNA 浓度测量
NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶 2x 预混液NEBM0492S试剂，用于基因回路片段的 PCR
NEB10-β 感受态大肠杆菌（高效）New England Biolabs （NEB）C3019H细菌细胞，用于扩增基因回路感兴趣的
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液New England Biolabs （NEB）E2621L用于将基因电路结构
Nikon Eclipse Ti-E 倒置显微镜与 DS-Qi2 相机Nikon Instruments Inc.N/A用于定量基因表达的仪器
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.用于表征荧光显微镜数据N/A
基因电路组分 PCR 的IDTN/A
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 系列 CO2 培养箱，带 UV 和 H2O2 Control松下MCO-170AICUVHL-PA仪器，用于哺乳动物细胞生长
多聚甲醛，16% 电子显微镜级电子显微镜科学15710-S试剂
PBS，Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS） （1x）Invitrogen14190144试剂，IF 孵育缓冲液试剂青
霉素-链霉素 （10,000 U/mL），100xFisher Scientific15140-122试剂，用于哺乳动物细胞生长
一抗 ERK 抗体Cell Signaling Technology4370S免疫荧光一抗 ERK 抗体
KRAS 抗体Sigma-AldrichWH0003845M1荧光
QIAprep Spin 小量制备试剂盒 （250）Qiagen27106纯化基因回路质粒的试剂盒
QIAquick 凝胶提取试剂盒 （50）Qiagen28704用于纯化基因电路片段的试剂盒
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统EppendorfA28137用于 qRT-PCR
相对定量的应用程序的设备Thermo Fisher ScientificN/A软件，用于定量 RNA/cDNA 扩增子
RNeasy Plus Mini 试剂盒Qiagen74134试剂盒，用于提取工程化哺乳动物细胞
的 RNA 二抗Cell Signaling Technology8889S用于免疫荧光
二抗 KRAS 抗体用于
学移液管的奥林巴斯塑料塑料设置各种化学反应的12-102
SmartView Pro 成像仪系统主要科学UVCI-1200用于对正确 PCR 条带进行成像的工具
SnapGene Viewer（免费）或 SnapGeneSnapGeneN/A软件 DNA 序列设计和分析
载物台顶部培养箱Tokai HitINU-TIZ工具，用于携带 PCR、转化或凝胶提取反应
TaqMan Fast Advanced 预混液Thermo Fisher Scientific4444557试剂，用于基因电路片段
的 PCRTaqMan 人 GAPD （GAPDH） 内源性对照品 （VIC/MGB 探针），限制性引物，2500 次反应Life Technologies4326317EqPCR 探针
热循环仪Bio-Rad1851148工具，用于进行 PCR、转化或凝胶提取反应
VisiPlate-24 黑色、黑色 24 孔微孔板，透明底，无菌和经组织培养处理PerkinElmer1450-605板，用于光诱导实验
VWR 一次性巴斯德移液管，玻璃，硼硅酸盐玻璃移液管，短头，容量 = 2 mL，总长度 = 14.6 cm动物细胞培养VWR14673-010
VWR Mini 水平电泳系统，Mini10 凝胶系统VWR89032-290DNA 凝胶电泳设备
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007含 FRT 的工程细胞系网站
用于的 试剂的 工具机 的 溴 用于将 实验室用413775000试剂相结合的试剂 寡核苷酸的 软件 用于 试剂用于哺乳动物细胞培养的 一抗 免疫一抗 的二抗 ERK 抗体 免疫荧光血清二抗 KRAS 抗体 5.0 mL 用于 试剂 用于哺乳的 试剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Optogenetic Gene CircuitsMammalian CellsGene Expression ControlLight Inducible ExpressionStable Cell LinesFlow CytometryFluorescence MicroscopyNegative Feedback CircuitGene Expression NoiseProtein Expression Quantification

相关文章