在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

摘要

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。

摘要

在哺乳动物细胞中实现可靠的基因表达调控需要具备高倍数变化、低噪声以及明确输入-输出传递函数的工具，而不论所采用的具体方法如何。为此，光遗传学基因表达系统在过去十年中受到广泛关注，因其能够对哺乳动物细胞中的蛋白质水平实现时空精确控制。然而，目前大多数控制光诱导基因表达的现有回路在结构上各不相同，通常由质粒表达，并使用各异的光遗传设备，因此有必要在稳定细胞系中探索光遗传组件的表征与标准化。本文提供了一套用于构建、整合和表征哺乳动物细胞中光诱导基因表达回路的实验流程，并以负反馈光遗传回路作为实例进行说明。该实验方案还展示了如何通过标准化光遗传设备和光照条件，可靠地揭示基因回路的特性，例如基因表达噪声和蛋白质表达水平。最后，本研究可能对尚未熟悉光遗传学技术但希望引入该技术的实验室具有参考价值。此处描述的实验流程可推广至其他哺乳动物细胞中的光遗传回路，有助于在转录组、蛋白质组乃至最终的表型水平上，实现对基因表达更可靠、更精细的表征与控制。

引言

与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，从而利用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题^1,2。在合成生物学中，基因表达调控是已构建多种控制系统的领域之一^3,4。基因表达控制可同时针对蛋白质水平及其变异性（噪声或变异系数，CV = σ/µ，定义为标准差与均值之比），这两者是细胞的重要特征，因其在细胞生理与病理状态中发挥关键作用^5,6,7,8。目前已开发出多种能够调控蛋白质水平和噪声的合成系统^4,9,10,11,12，为在不同工具间实现方案的标准化提供了可能。

方案

1. 基因线路设计

1. 选择要组合到单个基因回路/质粒中的遗传元件（例如，哺乳动物DNA整合序列基序）³²光响应元件³³或功能基因³⁴).
2. 使用任何基因工程和/或分子克隆软件，保存DNA序列以供后续使用和参考，对每条序列进行注释，并分析所有必要的特征（例如起始密码子、调控序列或翻译序列）³⁵.
3. 根据整体基因线路设计开发或采用相应元件³⁶例如，对于光遗传学抑制因子（如 LITers 中的情况）¹¹，融合一个编码具有光诱导降解能力结构域的基因序列^37,38 或抑制阻遏蛋白的DNA结合能力³⁹，位于阻遏蛋白基因（如 TetR）的邻近位置且处于其阅读框内⁴.
   1. 对于光遗传学激活因子，需确保存在激活结构域⁴⁰ 在光诱导的DNA结合后促进基因表达⁴¹对于负向或正向自调控，需确....

结果

本文中的基因回路组装和稳定细胞系的构建基于商业化的、经过修饰的HEK-293细胞，这些细胞含有一个转录活性的、单拷贝稳定FRT位点（图1）。基因回路被构建到含有FRT位点的载体中，从而可通过Flp-FRT系统整合至HEK-293细胞基因组中。该方法不仅限于Flp-In细胞，还可利用CRISPR/Cas9⁵⁰等DNA编辑技术，将FRT位点插入任何目标细胞系基因组中的任意位置。

在构建并验证细胞系的正确插入后，选择LPA和IRIS软件作为光诱导基因表达的标准操作流程^31,51。LPA系统可对24孔板进行编程，以在多种实验条件下根据光照强度、脉冲持续时间和占空比对哺乳动物细胞进行诱导（图2）。本文中优先采用空间上均匀的光照强度、脉冲持续时间和占空比。然而，研究人员可利用IRIS软件和LPA系统对时间光波模式.......

讨论

本文读者可深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）的关键步骤，包括：1）基因回路的设计、构建与验证；2）细胞工程，将基因回路导入稳定细胞系（例如 Flp-FRT 重组）；3）利用基于光的平台（如 LPA）对工程化细胞进行诱导；4）通过荧光显微镜初步表征光诱导实验；以及 5）采用多种检测方法进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术、定量实时 PCR（qRT-PCR）或免疫荧光检测。

此外，上述方法对于表达目的基因的任何基因线路架构均具有高度模块化特性，主要的潜在方案修改 集中在线路构建步骤以及所进行的检测方法上。在基因线路构建方面，分子克隆的灵活性允许通过轻微调整引物设计或组装方案，即可实现目的基因的替换或与荧光标记共表达。此外，尽管本文所述流程主要聚焦于负反馈（NF）基因线路设计，以实现精确（低噪声）的基因表达调控，但也可采用其他架构，例如正向调控或正反馈（PF），分别实现高倍变化或高基因表达噪声等不同特性^56,57。利用多种基因线路架构（例如 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL PCR管	Eppendorf	951010006	用于进行PCR的试剂
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1X	赛默飞世尔科技	MT25053CI	用于细胞解离的试剂 &哺乳动物细胞的扩增与收获
0.5-10 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000020	用于移液反应的工具
100-1000 μ可调体积移液器	Eppendorf	3123000039	用于移液反应的工具
20-200 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000055	用于移液反应的工具
2-20 μL 可调体积移液器	Eppendorf	3123000039	用于移液反应的工具
5 mL 聚苯乙烯圆底管配细胞滤网帽	康宁	352235	流式细胞术试剂
5702R 离心机，配备 4 × 100 转子、15 和 50 mL 适配器，120 V	Eppendorf	22628113	哺乳动物细胞培养实验设备
琼脂糖	德文特科学	GR140-500	凝胶电泳试剂
适用于96孔板的铝箔封膜	VWR®	60941-126	用于光照诱导实验中覆盖培养皿的工具
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A9518-5G	用于筛选含正确质粒细菌的试剂
模拟旋涡混合器	赛默飞世尔科技	02215365PR	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
Bacto 脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140010	用于培养细菌的试剂
BD LSRAria	BD	656700	用于将基因工程细胞系分选为单克隆群体的工具
BD LSRFortessa	BD	649225	用于表征基因工程细胞系的工具
BSA，牛血清白蛋白	政府科学来源	SIGA4919-1G	免疫荧光孵育缓冲液试剂
12孔细胞培养板，透明，平底，带盖，聚苯乙烯，无热原，标准组织培养处理	康宁	353043	用于培养单克隆细胞的培养板
离心	VWR	22628113	哺乳动物细胞培养仪器
化学通风橱	N/A	N/A	用于进行免疫荧光反应的仪器
24孔平底带盖透明细胞培养板	BD	353047	用于培养单克隆细胞的培养板
CytoOne T25 带滤膜瓶盖组织培养瓶	USA Scientific	CC7682-4825	用于培养哺乳动物细胞的容器
二甲基亚砜（DMSO）	Fischer Scientific	BP231-100	用于冷冻保存基因工程哺乳动物细胞的试剂
溴化乙锭	赛默飞世尔科技	15-585-011	凝胶电泳试剂
Falcon 96 孔透明平底 TC 处理细胞培养微孔板（带盖）	康宁	353072	用于培养经分选的单克隆细胞的容器
FCS Express	De Novo 软件	N/A	用于表征流式细胞术数据的软件
胎牛血清，常规型，USDA，500 mL	康宁	35-010-CV	哺乳动物细胞培养试剂
Fisherbrand 带透明盖培养皿 - 带凸起环缘；100 × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	用于培养细菌的设备
Gibco DMEM，高糖	赛默飞世尔科技	11-965-092	用于培养哺乳动物细胞的试剂
Hs00932330_m1 KRAS 亚型 a Taqman 基因表达检测	Life Technologies	4331182	qPCR 探针
潮霉素B（50 mg/mL），20 mL	Life Technologies	10687-010	用于筛选正确整合基因线路的细胞的试剂
iScript 逆转录超级混合液	伯乐生命科学公司	1708890	用于将RNA转为cDNA的试剂
实验室冰箱 -20 °C	VWR	76210-392	储存实验试剂的设备
实验室超低温冰箱 -80 °C	松下	MDF-U74VC	用于储存实验试剂的设备
实验室冰箱 +4 °C	VWR	76359-220	储存实验试剂的设备
LB肉汤（Lennox），1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	用于培养细菌的试剂
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	用于将基因回路转染至哺乳动物细胞的试剂
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	用于分析实验数据的软件
甲醇	Acros Organics	413775000	免疫荧光反应试剂
微量离心管，聚丙烯材质，1.7 mL	VWR	20170-333	塑料器皿容器
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman基因表达检测	Life Technologies	4331182	qPCR 探针
MultiTherm 摇床	Benchmark Scientific	H5000-HC	细菌转化设备
NanoDrop Lite 分光光度计	赛默飞世尔科技	中国台湾-中国台湾-美国-加拿大	用于DNA/RNA浓度测定的设备
NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶 2x 预混液	NEB	M0492S	基因回路片段PCR用试剂
NEB10-beta 感受态大肠杆菌（高效）	New England Biolabs (NEB)	C3019H	用于扩增目标基因线路的细菌细胞
NEBuilder HiFi DNA组装预混液	New England Biolabs (NEB)	E2621L	用于连接基因线路片段的试剂
尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜配备DS-Qi2相机	尼康仪器公司	N/A	用于定量基因表达的仪器
NIS-Elements	尼康仪器公司	N/A	用于表征荧光显微镜数据的软件
寡核苷酸	IDT	N/A	用于基因线路元件PCR的试剂
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 系列 CO2 带有紫外线和H的培养箱2O2 对照	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	用于培养哺乳动物细胞的仪器
16% 电子显微镜级多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15710-S	试剂
PBS，德氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1×）	Invitrogen	14190144	哺乳动物细胞培养试剂，IF孵育缓冲液试剂
青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100倍浓缩液	Fisher Scientific	15140-122	哺乳动物细胞培养试剂
一抗ERK抗体	细胞信号技术公司	4370S	免疫荧光用一抗 ERK
一抗KRAS	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	免疫荧光用一抗 KRAS
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250）	Qiagen	27106	基因回路质粒纯化试剂盒
QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）	Qiagen	28704	用于纯化基因线路片段的试剂盒
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统	Eppendorf	A28137	qRT-PCR 仪器
相对定量分析应用程序	赛默飞世尔科技	N/A	用于定量RNA/cDNA扩增的软件
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	用于提取基因工程哺乳动物细胞RNA的试剂盒
二抗ERK抗体	细胞信号技术公司	8889S	免疫荧光用二抗ERK抗体
二抗KRAS抗体	Invitrogen	A11005	免疫荧光用二抗KRAS抗体
5.0 mL 血清移液管	奥林巴斯塑料	12-102	用于建立多种化学反应的试剂
SmartView Pro 成像系统	主要科学	UVCI-1200	用于成像正确PCR条带的工具
SnapGene Viewer（免费）或 SnapGene	SnapGene	N/A	软件DNA序列设计与分析
台式培养箱	东海日立	INU-TIZ	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
TaqMan Fast Advanced Master Mix	赛默飞世尔科技	4444557	基因回路片段PCR用试剂
TaqMan 人 GAPD（GAPDH）内参对照（VIC/MGB 探针），引物限量，2500 次反应	Life Technologies	4326317E	qPCR 探针
PCR仪	伯乐（Bio-Rad）	1851148	用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具
VisiPlate-24 黑色，黑色24孔微孔板，透明底，无菌且经组织培养处理	PerkinElmer	1450-605	用于光诱导实验的培养板
VWR 一次性巴斯德吸管，玻璃制，硼硅酸盐玻璃吸管，短尖端，容量 = 2 mL，总长度 = 14.6 cm	VWR	14673-010	哺乳动物细胞培养试剂
VWR Mini Horizontal 电泳系统，Mini10 凝胶系统	VWR	89032-290	DNA凝胶电泳设备
Flp-In 293	赛默飞世尔科技	R75007	带有FRT位点的工程化细胞系