Name: 可靠地工程和控制哺乳动物细胞中稳定的光遗传学基因回路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习利用光遗传学技术在哺乳动物细胞中构建稳定基因回路，实现基因表达的精确时空控制。该方法可降低噪声五倍以上，适用于癌症生物学、系统生物学及组织分化研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Balázsi实验室提出的评论和建议，感谢Karl P. Gerhardt博士和Jeffrey J. Tabor博士帮助我们构建了第一个LPA，感谢Wilfried Weber博士分享LOV2-降解决质粒。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）[R35 GM122561和T32 GM008444]、Laufer物理与定量生物学中心以及美国国家国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金资助。开放获取费用资助来源：NIH [R35 GM122561]。
作者贡献：M.T.G. 和 G.B. 构思了该项目。M.T.G.、D.C. 和 L.G. 进行了实验。M.T.G.、D.C.、L.G. 和 G.B. 分析了数据并撰写了手稿。G.B. 和 M.T.G. 对项目进行了监督。

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文读者可深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）的关键步骤，包括：1）基因回路的设计、构建与验证；2）细胞工程，将基因回路导入稳定细胞系（例如 Flp-FRT 重组）；3）利用基于光的平台（如 LPA）对工程化细胞进行诱导；4）通过荧光显微镜初步表征光诱导实验；以及 5）采用多种检测方法进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术、定量实时 PCR（qRT-PCR）或免疫荧光检测。
此外，上述方法对于表达目的基因的任何基因线路架构均具有高度模块化特性，主要的潜在方案修改&#160;集中在线路构建步骤以及所进行的检测方法上。在基因线路构建方面，分子克隆的灵活性允许通过轻微调整引物设计或组装方案，即可实现目的基因的替换或与荧光标记共表达。此外，尽管本文所述流程主要聚焦于负反馈（NF）基因线路设计，以实现精确（低噪声）的基因表达调控，但也可采用其他架构，例如正向调控或正反馈（PF），分别实现高倍变化或高基因表达噪声等不同特性56,57。利用多种基因线路架构（例如 ...

与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，从而利用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题1,2。在合成生物学中，基因表达调控是已构建多种控制系统的领域之一3,4。基因表达控制可同时针对蛋白质水平及其变异性（噪声或变异系数，CV = σ/µ，定义为标准差与均值之比），这两者是细胞的重要特征，因其在细胞生理与病理状态中发挥关键作用5,6,7,8。目前已开发出多种能够调控蛋白质水平和噪声的合成系统4,9,10,11,12，为在不同工具间实现方案的标准化提供了可能。
最近出现的一类可用于控制基因网络的新工具是光遗传学，它能够利用光来控制基因表达13,14,15,16,17。与化学方法类似，光遗传学基因回路可被导入从细菌到哺乳动物的任何细胞类型中，从而实现对任意下游目标基因的表达调控18,19。然而，由于新型光遗传学工具不断快速涌现，已发展出多种系统，这些系统在基因回路结构、表达机制（例如基于质粒或病毒整合）、以及光照控制设备等方面存在差异11,16,20,21,22,23,24,25。因此，光遗传学在基因回路构建与优化、系统使用方法（例如整合表达与瞬时表达）、诱导所用实验工具以及结果分析等方面，仍有待实现标准化。
为了推进哺乳动物细胞中光遗传学实验方案的标准化，本方案以将负反馈（NF）基因回路整合到HEK293细胞（人胚胎肾细胞系）中为例，描述了一套用于在哺乳动物细胞中构建光遗传学系统的实验流程。负反馈是一种理想的标准化示范系统，因其在自然界中广泛存在26,27,28，可实现蛋白水平的调节并降低噪声。简而言之，负反馈通过阻遏蛋白快速抑制自身表达，从而精确控制基因表达，限制系统偏离稳态的程度。通过添加诱导剂使阻遏蛋白失活或降解，可改变系统的稳态，从而允许产生更多蛋白，直至针对每一诱导剂浓度达到新的稳态。最近开发出一种工程化的光遗传负反馈系统，能够实现宽动态范围的基因表达响应，维持低噪声水平，并响应光刺激，因而具备实现空间特异性基因表达调控的潜力11。这类工具被称为光诱导调节器（LITers），其设计灵感来源于早期可在活细胞中实现基因表达调控的系统4,10,29,30，并已稳定整合至人类细胞系中，以确保长期的基因表达调控能力。
本文以 LITer 为例，概述了一种构建光响应基因回路的方案，利用光板装置（LPA，一种光遗传学诱导硬件）31 诱导基因表达，并分析经基因工程改造、可光控的细胞系对定制光刺激的响应。该方案使用户能够利用 LITer 工具研究任何功能基因。此外，通过整合下述方法和光遗传学设备，该方案也可适用于具有不同回路结构（例如正反馈、负调控等）的其他光遗传学系统。与其他合成生物学方案类似，此处所述的视频记录和光遗传学操作流程可应用于多个领域的单细胞研究，包括但不限于癌症生物学、胚胎发育和组织分化。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td>Eppendorf</td><td>951010006</td><td>用于进行PCR的试剂</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA 1X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MT25053CI</td><td>用于细胞解离的试剂 &amp;哺乳动物细胞的扩增与收获</td></tr><tr><td>0.5-10 &amp;mu;L 可调体积移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td>用于移液反应的工具</td></tr><tr><td>100-1000 &amp;mu;可调体积移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>用于移液反应的工具</td></tr><tr><td>20-200 &amp;mu;L 可调体积移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>用于移液反应的工具</td></tr><tr><td>2-20 &amp;mu;L 可调体积移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>用于移液反应的工具</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管配细胞滤网帽</td><td>康宁</td><td>352235</td><td>流式细胞术试剂</td></tr><tr><td>5702R 离心机，配备 4 × 100 转子、15 和 50 mL 适配器，120 V</td><td>Eppendorf</td><td>22628113</td><td>哺乳动物细胞培养实验设备</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>德文特科学</td><td>GR140-500</td><td>凝胶电泳试剂</td></tr><tr><td>适用于96孔板的铝箔封膜</td><td>VWR&amp;reg;</td><td>60941-126</td><td>用于光照诱导实验中覆盖培养皿的工具</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>用于筛选含正确质粒细菌的试剂</td></tr><tr><td>模拟旋涡混合器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>02215365PR</td><td>用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具</td></tr><tr><td>Bacto 脱水琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140010</td><td>用于培养细菌的试剂</td></tr><tr><td>BD LSRAria</td><td>BD</td><td>656700</td><td>用于将基因工程细胞系分选为单克隆群体的工具</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td>649225</td><td>用于表征基因工程细胞系的工具</td></tr><tr><td>BSA，牛血清白蛋白</td><td>政府科学来源</td><td>SIGA4919-1G</td><td>免疫荧光孵育缓冲液试剂</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板，透明，平底，带盖，聚苯乙烯，无热原，标准组织培养处理</td><td>康宁</td><td>353043</td><td>用于培养单克隆细胞的培养板</td></tr><tr><td>离心</td><td>VWR</td><td>22628113</td><td>哺乳动物细胞培养仪器</td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于进行免疫荧光反应的仪器</td></tr><tr><td>24孔平底带盖透明细胞培养板</td><td>BD</td><td>353047</td><td>用于培养单克隆细胞的培养板</td></tr><tr><td>CytoOne T25 带滤膜瓶盖组织培养瓶</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-4825</td><td>用于培养哺乳动物细胞的容器</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP231-100</td><td>用于冷冻保存基因工程哺乳动物细胞的试剂</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15-585-011</td><td>凝胶电泳试剂</td></tr><tr><td>Falcon 96 孔透明平底 TC 处理细胞培养微孔板（带盖）</td><td>康宁</td><td>353072</td><td>用于培养经分选的单克隆细胞的容器</td></tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo 软件</td><td>N/A</td><td>用于表征流式细胞术数据的软件</td></tr><tr><td>胎牛血清，常规型，USDA，500 mL</td><td>康宁</td><td>35-010-CV</td><td>哺乳动物细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Fisherbrand 带透明盖培养皿 - 带凸起环缘；100 × 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>用于培养细菌的设备</td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp;DMEM，高糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11-965-092</td><td>用于培养哺乳动物细胞的试剂</td></tr><tr><td>Hs00932330_m1 KRAS 亚型 a Taqman 基因表达检测</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR 探针</td></tr><tr><td>潮霉素B（50 mg/mL），20 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>用于筛选正确整合基因线路的细胞的试剂</td></tr><tr><td>iScript 逆转录超级混合液</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1708890</td><td>用于将RNA转为cDNA的试剂</td></tr><tr><td>实验室冰箱 -20 &amp;deg;C</td><td>VWR</td><td>76210-392</td><td>储存实验试剂的设备</td></tr><tr><td>实验室超低温冰箱 -80 &amp;deg;C</td><td>松下</td><td>MDF-U74VC</td><td>用于储存实验试剂的设备</td></tr><tr><td>实验室冰箱 +4 &amp;deg;C</td><td>VWR</td><td>76359-220</td><td>储存实验试剂的设备</td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox），1 kg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td>用于培养细菌的试剂</td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 3000</td><td>Life Technologies</td><td>L3000008</td><td>用于将基因回路转染至哺乳动物细胞的试剂</td></tr><tr><td>MATLAB 2019</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>用于分析实验数据的软件</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Acros Organics</td><td>413775000</td><td>免疫荧光反应试剂</td></tr><tr><td>微量离心管，聚丙烯材质，1.7 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>塑料器皿容器</td></tr><tr><td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman基因表达检测</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR 探针</td></tr><tr><td>MultiTherm 摇床</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>细菌转化设备</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>中国台湾-中国台湾-美国-加拿大</td><td>用于DNA/RNA浓度测定的设备</td></tr><tr><td>NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶 2x 预混液</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>基因回路片段PCR用试剂</td></tr><tr><td>NEB10-beta 感受态大肠杆菌（高效）</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>C3019H</td><td>用于扩增目标基因线路的细菌细胞</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA组装预混液</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>E2621L</td><td>用于连接基因线路片段的试剂</td></tr><tr><td>尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜配备DS-Qi2相机</td><td>尼康仪器公司</td><td>N/A</td><td>用于定量基因表达的仪器</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>尼康仪器公司</td><td>N/A</td><td>用于表征荧光显微镜数据的软件</td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>用于基因线路元件PCR的试剂</td></tr><tr><td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 系列 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 带有紫外线和H的培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 对照</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td>用于培养哺乳动物细胞的仪器</td></tr><tr><td>16% 电子显微镜级多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710-S</td><td>试剂</td></tr><tr><td>PBS，德氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1×）</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td>哺乳动物细胞培养试剂，IF孵育缓冲液试剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100倍浓缩液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>哺乳动物细胞培养试剂</td></tr><tr><td>一抗ERK抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>4370S</td><td>免疫荧光用一抗 ERK</td></tr><tr><td>一抗KRAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0003845M1</td><td>免疫荧光用一抗 KRAS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250）</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>基因回路质粒纯化试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于纯化基因线路片段的试剂盒</td></tr><tr><td>QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Eppendorf</td><td>A28137</td><td>qRT-PCR 仪器</td></tr><tr><td>相对定量分析应用程序</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N/A</td><td>用于定量RNA/cDNA扩增的软件</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>用于提取基因工程哺乳动物细胞RNA的试剂盒</td></tr><tr><td>二抗ERK抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>8889S</td><td>免疫荧光用二抗ERK抗体</td></tr><tr><td>二抗KRAS抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>免疫荧光用二抗KRAS抗体</td></tr><tr><td>5.0 mL 血清移液管</td><td>奥林巴斯塑料</td><td>12-102</td><td>用于建立多种化学反应的试剂</td></tr><tr><td>SmartView Pro 成像系统</td><td>主要科学</td><td>UVCI-1200</td><td>用于成像正确PCR条带的工具</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer（免费）或 SnapGene</td><td>SnapGene</td><td>N/A</td><td>软件DNA序列设计与分析</td></tr><tr><td>台式培养箱</td><td>东海日立</td><td>INU-TIZ</td><td>用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4444557</td><td>基因回路片段PCR用试剂</td></tr><tr><td>TaqMan 人 GAPD（GAPDH）内参对照（VIC/MGB 探针），引物限量，2500 次反应</td><td>Life Technologies</td><td>4326317E</td><td>qPCR 探针</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1851148</td><td>用于进行PCR、转化或凝胶回收反应的工具</td></tr><tr><td>VisiPlate-24 黑色，黑色24孔微孔板，透明底，无菌且经组织培养处理</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-605</td><td>用于光诱导实验的培养板</td></tr><tr><td>VWR 一次性巴斯德吸管，玻璃制，硼硅酸盐玻璃吸管，短尖端，容量 = 2 mL，总长度 = 14.6 cm</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>哺乳动物细胞培养试剂</td></tr><tr><td>VWR Mini Horizontal 电泳系统，Mini10 凝胶系统</td><td>VWR</td><td>89032-290</td><td>DNA凝胶电泳设备</td></tr><tr><td>Flp-In 293</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R75007</td><td>带有FRT位点的工程化细胞系</td></tr></tbody></table>

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

在哺乳动物细胞中实现可靠的基因表达调控需要具备高倍数变化、低噪声以及明确输入-输出传递函数的工具，而不论所采用的具体方法如何。为此，光遗传学基因表达系统在过去十年中受到广泛关注，因其能够对哺乳动物细胞中的蛋白质水平实现时空精确控制。然而，目前大多数控制光诱导基因表达的现有回路在结构上各不相同，通常由质粒表达，并使用各异的光遗传设备，因此有必要在稳定细胞系中探索光遗传组件的表征与标准化。本文提供了一套用于构建、整合和表征哺乳动物细胞中光诱导基因表达回路的实验流程，并以负反馈光遗传回路作为实例进行说明。该实验方案还展示了如何通过标准化光遗传设备和光照条件，可靠地揭示基因回路的特性，例如基因表达噪声和蛋白质表达水平。最后，本研究可能对尚未熟悉光遗传学技术但希望引入该技术的实验室具有参考价值。此处描述的实验流程可推广至其他哺乳动物细胞中的光遗传回路，有助于在转录组、蛋白质组乃至最终的表型水平上，实现对基因表达更可靠、更精细的表征与控制。

本文中的基因回路组装和稳定细胞系的构建基于商业化的、经过修饰的HEK-293细胞，这些细胞含有一个转录活性的、单拷贝稳定FRT位点（图1）。基因回路被构建到含有FRT位点的载体中，从而可通过Flp-FRT系统整合至HEK-293细胞基因组中。该方法不仅限于Flp-In细胞，还可利用CRISPR/Cas950等DNA编辑技术，将FRT位点插入任何目标细胞系基因组中的任意位置。
在构建并验证细胞系的正确插入后，选择LPA和IRIS软件作为光诱导基因表达的标准操作流程31,51。LPA系统可对24孔板进行编程，以在多种实验条件下根据光照强度、脉冲持续时间和占空比对哺乳动物细胞进行诱导（图2）。本文中优先采用空间上均匀的光照强度、脉冲持续时间和占空比。然而，研究人员可利用IRIS软件和LPA系统对时间光波模式...

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。

在哺乳动物细胞中实现可靠的基因表达调控需要具备高倍数变化、低噪声以及明确输入-输出传递函数的工具，……

标准化的光遗传学实验方案旨在为希望利用光刺激来调控工程化哺乳动物细胞系统中细胞特性的实验室提供指导。该方案易于实施，即使对光遗传学技术不熟悉的实验室也可采用，并提供了对工程化生物系统进行精确时空控制的方法。此方法在需要关注时空信息的特定研究领域具有广泛的应用前景，包括癌症生物学、系统生物学以及组织分化研究。首先，选择要组合成单个基因回路或质粒的遗传元件。例如，哺乳动物DNA整合位点、光响应元件或功能基因。在组装并检查所有必要元件（如起始密码子、调控序列或翻译序列）后，使用任意基因工程与分子克隆软件对DNA序列进行注释，并将其储存以供后续使用和作为参考。通过内置的分子克隆软件功能（例如序列比对）对质粒构建所用引物进行计算机验证。为了生成稳定的细胞系，使用包含基因回路DNA和适当重组酶的脂质体混合物，将设计的基因回路转染至目标细胞中。当细胞融合度达到80%至100%时，用含有45%旧培养基、45%新鲜培养基和10%DMSO的混合液将细胞冻存。将剩余的细胞转移至无菌离心管中，并进行单细胞分选，将单克隆细胞分离至96孔板中。单克隆分选后约两到三周，96孔板中的孔内应出现细胞克隆灶。当细胞融合度达到50%至60%时，将细胞传代至12孔板中。使用微控制器编程器将固件添加到组装好的 LPA 电路中。接下来，使用安装板、电路板、LED 间隔器、板适配器、24 孔板、板盖、安装螺栓、翼型螺母以及堆叠组件，将 3D 打印部件与组装好的电路板结合在一起。要开始光遗传学实验，请使用 Tabor 实验室网站上提供的 Iris 软件为 LPA 编程 SD 卡，并探索合适的光照条件。接下来，根据所需的实验设计，输入具有技术重复的强度值。在24孔黑色培养板中，每孔加入约75,000个细胞，总体积为500 µL，然后将细胞置于含5%二氧化碳的湿润培养箱中，静置2至6小时，使其贴壁。在培养结束后，将细胞转移至组织培养超净台，取下塑料盖，于板的顶部加贴一条粘性铝箔，以尽量减少孔与孔之间的光传递，使光只能通过位于孔底部的LED进入。将培养板放入LPA的定制3D部件中，然后用3D打印的LPA盖子盖住培养板，盖子应与设备每个角落的螺丝相匹配。将设备连接至电源，并按下LPA设备上的复位按钮，以确保更新后的LPA实验设置已生效，随后孵育细胞。孵育结束后，在组织培养超净台内，从培养板上移除铝箔条，并让培养板静置一到两分钟，以防止塑料盖上产生冷凝水。接下来，将原始的塑料盖重新盖回培养板上，使用相应的相差显微镜或荧光显微镜对细胞进行成像。诱导后24至72小时，经胰酶消化后，将每孔约500微升的全部内容物转移至配有细胞筛网的已标记离心管中。然后使用适当的流式细胞仪分析软件，设置前向散射和侧向散射门，以筛选出大小和颗粒度合适的单个细胞，排除碎片和细胞团块。设定门控后，使用适当的门控捕获约 10,000 个细胞，并根据所需细胞数据量调整细胞数量，随后在每管中重复捕获实验细胞。诱导和胰酶消化后，将每孔约 500 微升的全部内容物转移至已标记的试管中。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液后，将样品转移至化学通风橱中。将细胞重悬于750至1,000 µL用PBS稀释的4% PFA中，上下吹打数次以打散细胞团块。室温孵育15分钟后，加入750至1,000 µL PBS，再次上下吹打数次，然后在室温下以400 × g离心5分钟使细胞成团。弃去上清液后，将样品转移至化学通风橱中，并如图所示将细胞重悬于750至1,000 µL预冷甲醇中，随后置于-20 °C冰箱中静置30分钟。孵育结束后，加入 750 至 1,000 微升 PBS，并用移液器上下吹打数次。然后在 400 × g 条件下离心细胞 5 分钟，弃去上清液，将样品转移至化学通风橱中。用 100 微升或其他合适稀释浓度的标记一抗重悬细胞，上下吹打 6 至 8 次，室温孵育 1 小时。接着，加入 750 至 1,000 微升孵育缓冲液，用移液器反复吹打数次，然后在 400 × g 条件下离心细胞 5 分钟。随后，将细胞重悬于 500 微升 PBS 中，并通过反复吹打分散细胞团块。将每根试管中的全部内容物转移至带有细胞筛网的已标记试管中。将细胞送至配备合适激光波长的流式细胞仪进行检测。对设备进行了光学校准。利用获取的图像，计算了LED的补偿值，扣除了背景信号，并推导出像素强度。96个孔之间的变异系数最小。校准软件展示了LED光源因位置不同而产生的差异，并创建了灰度调节，使每个LED的强度均一化至相同水平。通过荧光显微镜观察，在LPA上以不同光脉冲持续时间诱导工程化光敏细胞的基因表达，并对细胞进行明场和GFP表达成像。利用流式细胞术，在不同脉冲长度下诱导细胞，结果显示在群体水平上基因表达呈剂量依赖性响应，相较于未诱导状态，表达量变化超过四倍。通过比较较弱系统在不同光照强度下的表现与Vivid或光照开启状态，发现负反馈实现了五倍以上的基因表达噪声降低。qPCR分析显示，经改造的lighter细胞以剂量响应方式表达RNA水平，相较于未诱导状态，诱导水平超过十倍，与流式细胞术定量结果一致。经改造的lighter基因回路在蓝光强度增加时，导致KRAS蛋白水平和磷酸化ERK水平随之升高。可进行多种功能检测，包括生长、细胞运动、伤口愈合、增殖或侵袭实验。这些方法可为癌症生物学、组织分化或药物耐受机制提供特定的见解。

reliably-engineering-controlling-stable-optogenetic-gene-circuits

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

可靠地工程和控制哺乳动物细胞中稳定的光遗传学基因回路

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in...

光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

光遗传学已成为行为神经科学研究中的一种强大工具。本方案提供了激光系统设计与搭建的逐步指南，并给出了进行多重且同步实验操作的完整方案 体内...

in vivo 光遗传学刺激啮齿类动物中枢神经系统

本方案描述了成功实施光遗传功能磁共振成像（ofMRI）所需的步骤及数据分析方法。ofMRI 是一种新型技术，结合了高场强 fMRI...

光遗传功能磁共振成像

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。...

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

本文介绍了两种易于操作的逐步实验方案，用于在小鼠中利用光遗传学进行位置偏好范式的实验。通过这两种不同的实验设置，可以在同一装置内以高空间和时间选择性，简便且可靠地评估偏好和回避行为。...

利用光遗传学技术在小鼠腹侧被盖区进行两种不同的实时位置偏好实验范式

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。...

光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。...

通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。...

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

学习利用光遗传学技术在哺乳动物细胞中构建稳定基因回路，实现基因表达的精确时空控制。该方法可降低噪声五倍以上，适用于癌症生物学、系统生物学及组织分化研究。

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

探索更多视频