本文介绍了一种用于生成、药物处理及分析患者来源的离体组织的方法，以在活体、与患者相关且具有临床前意义的模型系统中评估肿瘤对药物的反应。
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本文内容
摘要
摘要
要理解药物耐药性并开发使高度耐药癌症重新敏感的新策略，依赖于能够准确预测患者反应的合适临床前模型。现有临床前模型的一个缺点是无法在情境上保留人类肿瘤微环境（TME），也无法准确反映肿瘤内的异质性，从而限制了数据的临床转化。相比之下，患者来源的肿瘤组织外植体（PDE）平台通过培养人类肿瘤的活体组织碎片，能够在三维（3D）环境中检测药物反应，尽可能真实地模拟原始肿瘤的病理特征和组织结构。先前关于PDE的研究已证实该平台能够区分化疗敏感与耐药的肿瘤，并且这种区分可预测患者对相同化疗方案的临床反应。同时，PDE还提供了研究预测药物反应的分子、遗传和组织学特征的机会，从而有助于识别用于患者分层的生物标志物，以及开发使耐药肿瘤重新敏感的新型干预策略。本文详细报告了从患者样本采集到终点分析的PDE技术方法，全面描述了外植体的制备与培养流程，并在适当时强调了针对特定肿瘤的定制化培养条件。在终点分析方面，重点介绍了多重免疫荧光与多光谱成像技术，用于在肿瘤区域和间质区域中对关键生物标志物进行空间分布分析。通过整合这些方法，可以获得与多种临床病理参数相关联的定性和定量药物反应数据，进而有望用于生物标志物的识别。
引言
开发有效且安全的抗癌药物需要合适的临床前模型，这些模型还应能够揭示作用机制，从而有助于识别预测性和药效动力学生物标志物。已知肿瘤间和肿瘤内异质性1,2,3,4,5以及肿瘤微环境（TME）6,7,8,9,10,11,12会影响抗癌药物的反应，而许多现有的临床前癌症模型（如细胞系、类器官和小鼠模型）无法充分涵盖这些关键特征。一种"理想"的模型应能够重现肿瘤内恶性细胞与非恶性细胞之间复杂的空间相互作用，并反映肿瘤内部的区域差异。本文重点介绍PDEs作为一种新兴平台，能够满足其中许多要求13。<....
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方案
1. 组织采集
- 手术后，将新鲜切除的人类肿瘤标本转移至含有 25 mL 新鲜培养基（DMEM 高糖培养基，添加 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺 + 1% (v/v) 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素）的离心管中，并置于冰上保存。在手术后 2 小时内于无菌 II 级生物安全柜中处理组织块。
2. 外植体准备
- 使用70%工业变性酒精（IMS）溶液清洁所有手术器械（植皮刀片/牙科蜡表面/镊子）。
- 在10 cm培养皿（参见材料表）中加入约25 mL新鲜培养基，并将其置于冰床上。
- 用镊子将样本转移至牙科蜡表面（参见材料表），并使用两把植皮刀片将组织切成约2–3 mm3大小的碎片。
注意：为获得最佳效果，应先将组织切成2–3 mm厚的单条，再沿长度方向切割该条带以获得最终的组织块。重复此过程，直至整个样本被切碎。 - 立即将组织块转移至10 cm培养皿中的冰冻培养基中。取部分组织块（6–9块），放入含有10%非缓冲福尔马林溶液的1 mL离心管中，在室温（RT）下放置24小时。
注意：这些组织块将作为“未培养”条件下的对照组织块。 - 在6孔板的每个孔中加....
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结果
对多重免疫荧光染色的组织切片进行多光谱成像，可实现对移植物肿瘤微环境（TME）中单个细胞群体的鉴定与表型分析，以及肿瘤和间质成分的识别（图2）。多光谱成像在分析具有高本底自发荧光的组织（如富含胶原的组织）时尤为有用，因为它能够将自发荧光信号与其他信号分离，并在后续分析中将其排除。随后通过计算机进行的组织与细胞分割，可实现对药物反应的定量分析，输出参数多样，包括但不限于细胞总数（例如，阳性百分比）、信号强度、细胞大小、组织面积以及单个细胞的空间位置。
因此，组织和细胞分割对于药物治疗效果的定量分析以及肿瘤特异性和基质特异性反应的识别极为有用。例如，同时对Ki67和cPARP以及肿瘤标志物进行染色，可分别对离体组织中外植体的增殖和细胞死亡水平进行定量（图3）。在本示例中，针对抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）免疫检查点抑制剂（ICI）纳武利尤单抗处理下的PDE，分别对基质区和肿瘤区的Ki67和cPARP水平进行了定量。此外，从染色切片中提取空间信息的能力，使得可以计算.......
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讨论
本文描述了PDEs的生成、药物处理和分析方法，并强调了该平台作为临床前模型系统的优势。对新鲜切除的肿瘤进行离体 培养，无需破坏其结构，可保留肿瘤的组织架构13,24，从而维持肿瘤微环境（TME）中细胞组分的空间相互作用以及瘤内异质性。本方法展示了如何利用肿瘤特异性标志物，区分肿瘤组织区域与间质区域，进而分别评估这些区域对药物的反应（图3）。此外，还可同时分析多种生物标志物，以评估免疫细胞在肿瘤微环境内的靶向迁移等效应（图4）。
先前的一项研究报道了该PDE平台在非小细胞肺癌（NSCLC）PDE中用于标准护理化疗药物顺铂的分层应用，表明可以将化疗耐药与化疗敏感的群体区分开来24。这些与PDE相关的发现与患者的临床反应相一致。通过采用本文所述的方法，可以对其他肿瘤类型以及不同类型的药物（无论是化.......
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披露
无任何利益冲突需要披露
致谢
我们感谢莱斯特大学医院NHS信托基金的外科医生和病理学家提供手术切除的肿瘤组织。我们还感谢核心生物技术服务中心的组织学设施在FFPE组织块的处理和切片方面提供的帮助，以及Kees Straatman在使用Vectra Polaris系统方面的支持。本研究由Explant联盟资助并提供资金支持，该联盟包括四个合作单位：莱斯特大学、医学研究理事会毒理学部门、英国癌症研究会治疗发现实验室以及LifeArc。此外，研究还获得了英国癌症研究中心-英国国家健康研究所莱斯特实验癌症医学中心（C10604/A25151）的支持。GM、CD和NA的研究经费由Breast Cancer Now的Catalyst计划（2017NOVPCC1066）提供，该计划获得了辉瑞公司的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma | 320099 | 染色试剂 |
| 抗体稀释液/封闭液，1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | 抗体稀释/封闭缓冲液 |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | 超纯水（UP）H2O制备仪 | |
| 柠檬酸一水合物 | Sigma-Aldrich | C7129 | 柠檬酸缓冲液用试剂 |
| Costar 多孔细胞培养板 | Corning Incorporated | 3516 | 6 孔板 |
| DAPI 二盐酸盐 | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm 培养皿，Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 组织培养用 100 mm 直径培养皿 |
| DMEM (1x) 改良杜尔贝科培养基 + 4.5 g/L D-葡萄糖 + 110 mg/mL 丙酮酸钠 | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | 组织培养基（500 mL） |
| DPX 封片剂 | VWR | 360294H | 封片介质 |
| DPX 封片剂 | Merck | 6522 | 封片介质 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | 3609 | TE 缓冲液用试剂 |
| 伊红 | CellPath | RBC-0100-00A | 染色试剂 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10500-064 | 用于组织培养基 |
| 37% 甲醛 | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% 福尔马林 |
| iGenix 微波炉 IG2095 | iGenix | IG2095 | 用于抗原修复的微波炉 |
| 工业变性酒精（IMS） | Genta Medical | 199050 | 99% 工业变性酒精（IDA） |
| InForm 高级图像分析软件 | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 组织处理仪 | Leica Biosystems | 全自动真空组织处理仪 | |
| Leica Arcadia H 和 C | Leica Biosystems | 包埋蜡浴 | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | 轮转式切片机 | |
| Leica ST4040 线性染色机 | Leica Biosystems | 苏木精-伊红（H&E）染色机 | |
| Mayer 苏木精 | Sigma | GHS132-1L | 染色试剂 |
| Millicell 细胞培养插件，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | 类器官培养插件圆盘 |
| Novolink 聚合物检测系统 | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB 染色试剂盒 |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料 |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG 试剂 | Akoya Biosciences | FP1501001KT | 含二甲基亚砜（DMSO）稀释液和 TSA-DIG 试剂的荧光染料 |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb，1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP 聚合物 |
| 青霉素/链霉素溶液 | Fisher Scientific | 11548876 | 用于组织培养基 |
| PhenoChart 全片上下文查看器 | Akoya Biosciences | PhenoChart | 扫描图像查看软件 |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus 放大稀释液 | Perkin Elmer | FP1498 | 荧光染料稀释液 |
| Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36961 | 封片介质 |
| 载玻片架 | Perkin Elmer | 用于将载玻片装入 Vectra Polaris 扫描仪的载玻片架中 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% 福尔马林 |
| 氢氧化钠颗粒 | Fisher Scientific | S/4920/53 | 柠檬酸缓冲液用试剂 |
| Tenatex 加强型蜡 - 粉红色（500 g） | KEMDENT | 1-601 | 牙科蜡表面 |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza 免疫染色中心载玻片架 | Fisher Scientific | 10098889 | 载玻片及夹具支架 |
| Thermo Scientific Shandon 塑料盖板 | Fisher Scientific | 11927774 | 载玻片夹 |
| 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris） | Sigma-Aldrich | 252859 | TE 缓冲液用试剂 |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | 封片介质 |
| Vectra Polaris 载玻片扫描仪 | Perkin Elmer | Vectra Polaris | 载玻片扫描仪 |
| 二甲苯 | Genta Medical | XYL050 | 脱蜡剂 |
参考文献
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution o....
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