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方法文章

源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

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DOI：

10.3791/62130

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2021年2月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leicester Cancer Research Center, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于生成、药物处理及分析患者来源的离体组织的方法，以在活体、与患者相关且具有临床前意义的模型系统中评估肿瘤对药物的反应。

摘要

要理解药物耐药性并开发使高度耐药癌症重新敏感的新策略，依赖于能够准确预测患者反应的合适临床前模型。现有临床前模型的一个缺点是无法在情境上保留人类肿瘤微环境（TME），也无法准确反映肿瘤内的异质性，从而限制了数据的临床转化。相比之下，患者来源的肿瘤组织外植体（PDE）平台通过培养人类肿瘤的活体组织碎片，能够在三维（3D）环境中检测药物反应，尽可能真实地模拟原始肿瘤的病理特征和组织结构。先前关于PDE的研究已证实该平台能够区分化疗敏感与耐药的肿瘤，并且这种区分可预测患者对相同化疗方案的临床反应。同时，PDE还提供了研究预测药物反应的分子、遗传和组织学特征的机会，从而有助于识别用于患者分层的生物标志物，以及开发使耐药肿瘤重新敏感的新型干预策略。本文详细报告了从患者样本采集到终点分析的PDE技术方法，全面描述了外植体的制备与培养流程，并在适当时强调了针对特定肿瘤的定制化培养条件。在终点分析方面，重点介绍了多重免疫荧光与多光谱成像技术，用于在肿瘤区域和间质区域中对关键生物标志物进行空间分布分析。通过整合这些方法，可以获得与多种临床病理参数相关联的定性和定量药物反应数据，进而有望用于生物标志物的识别。

引言

开发有效且安全的抗癌药物需要合适的临床前模型，这些模型还应能够揭示作用机制，从而有助于识别预测性和药效动力学生物标志物。已知肿瘤间和肿瘤内异质性1,2,3,4,5以及肿瘤微环境（TME）6,7,8,9,10,11,12会影响抗癌药物的反应，而许多现有的临床前癌症模型（如细胞系、类器官和小鼠模型）无法充分涵盖这些关键特征。一种"理想"的模型应能够重现肿瘤内恶性细胞与非恶性细胞之间复杂的空间相互作用，并反映肿瘤内部的区域差异。本文重点介绍PDEs作为一种新兴平台，能够满足其中许多要求13。

人类PDE（也称为组织培养）的首次应用可追溯到20世纪80年代末，当时Hoffman等人制备了新鲜切除的人类肿瘤组织切片，并将其在胶原基质中进行培养14,15。该方法建立了一种三维培养系统，能够保持组织结构，确保肿瘤微环境（TME）中的基质成分及细胞间相互作用得以维持。Hoffman等人16在不破坏原始肿瘤结构的前提下，开创了一种转化医学研究的新途径。自此以后，许多研究团队不断优化不同的组织外植培养方法，旨在保持组织完整性并获得准确的药物反应数据17,18,19,20,21,22,23,24，尽管不同实验方案之间存在一些差异。Butler等人将外植组织培养在明胶海绵中，以促进营养物质和药物在样本中的扩散20,21,25；而Majumder等人则通过将外植组织培养在由肿瘤和基质蛋白组成的基质上，并添加来自同一患者的自体血清，构建了一个肿瘤生态系统22,23。

最近，我们课题组建立了一种方案，通过将肿瘤组织切割成2 - 3 mm3大小的碎片，制备出组织块，随后将其不添加其他成分直接置于培养系统气液界面的可渗透膜上24。综上所述， 大量研究已证明，PDE技术能够实现对完整、存活的人类肿瘤组织碎片的培养，且这些组织碎片可保留原始肿瘤的空间结构和区域异质性。在早期实验中，通常在药物处理后将组织块或组织培养物进行匀浆，随后对匀浆样品应用多种活力检测方法，例如组织培养药物反应检测20,21、MTT（3-(6)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）检测、乳酸脱氢酶检测或基于刃天青的检测26,27,28。近年来终点分析技术尤其是数字病理学的进步，已显著拓展了可用于组织块的终点检测和分析方法29,30。为了应用这些新技术，不再采用匀浆处理，而是将组织块用福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE），然后利用免疫染色技术进行分析，从而实现空间层面的分子谱型分析。该方法已在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、结直肠癌和间皮瘤的组织块研究中得到应用，通过针对增殖标志物Ki67和凋亡标志物裂解型多聚ADP核糖聚合酶（cPARP）的免疫组织化学染色，监测细胞增殖和细胞死亡的变化情况24,31,32,33,34。

多重免疫荧光技术特别适用于对离体组织样本在实验终点进行药物反应的空间分析35例如，可以在药物处理后测量肿瘤微环境中特定类型免疫细胞（如巨噬细胞或T细胞）的重定位和空间分布13,36,37,38，并研究治疗剂是否能够促进从 "冷肿瘤" 到 "热肿瘤"39近年来，该研究团队致力于从不同肿瘤类型（非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤）中分离患者来源的类器官（PDEs），并测试多种抗癌药物，包括化疗药物、小分子抑制剂以及免疫检查点抑制剂（ICIs）。终点分析方法已优化，纳入了多重免疫荧光技术，以实现对细胞活性相关生物标志物及肿瘤微环境（TME）中不同组分生物标志物的空间分布特征分析。

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方案

1. 组织采集

  1. 手术后，将新鲜切除的人类肿瘤标本转移至含有 25 mL 新鲜培养基（DMEM 高糖培养基，添加 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺 + 1% (v/v) 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素）的离心管中，并置于冰上保存。在手术后 2 小时内于无菌 II 级生物安全柜中处理组织块。

2. 外植体准备

  1. 使用70%工业变性酒精（IMS）溶液清洁所有手术器械（植皮刀片/牙科蜡表面/镊子）。
  2. 在10 cm培养皿（参见材料表）中加入约25 mL新鲜培养基，并将其置于冰床上。
  3. 用镊子将样本转移至牙科蜡表面（参见材料表），并使用两把植皮刀片将组织切成约2–3 mm3大小的碎片。
    注意：为获得最佳效果，应先将组织切成2–3 mm厚的单条，再沿长度方向切割该条带以获得最终的组织块。重复此过程，直至整个样本被切碎。
  4. 立即将组织块转移至10 cm培养皿中的冰冻培养基中。取部分组织块（6–9块），放入含有10%非缓冲福尔马林溶液的1 mL离心管中，在室温（RT）下放置24小时。
    注意：这些组织块将作为“未培养”条件下的对照组织块。
  5. 在6孔板的每个孔中加入1.5 mL新鲜培养基，并在每个孔中放置一个组织培养插入式圆盘（参见材料表），使其漂浮在培养基表面，注意避免培养基与插入物界面处产生气泡。
  6. 随机选取组织块，逐个放置在插入式圆盘表面。为与“未培养”条件保持一致，每孔使用6–9个组织块。将多孔板置于37 °C、5% CO2的CO2培养箱中，使组织块恢复培养16小时。
    注意：为避免压碎组织，强烈建议轻柔操作镊子。

3. 药物处理

  1. 16 小时后，取新的 6 孔板，向每孔加入 1.5 mL 新鲜培养基，按所需浓度加入相应的药物，并设置一个溶剂对照孔。使用镊子将含有外植体的每个插入物转移至已加入药物的 newly prepared 6 孔板中。将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的 CO2 培养箱中培养 24–48 小时。
  2. 将先前用甲醛固定的未培养外植体转移至组织学包埋盒中（见下文第 4 节），并保存于 70% IMS 中直至实验结束。

4. 组织学处理

  1. 组织固定
    1. 药物处理后，将含有外植体的插入圆盘转移至新的6孔板中，孔板内含10%福尔马林，并在外植体表面滴加数滴10%福尔马林，以确保外植体完全被固定液覆盖。
      注意：福尔马林具有危害性。避免与皮肤接触，并在通风橱内操作以防止吸入。
    2. 让外植体在10%福尔马林中静置过夜（20–24小时）。
    3. 次日，将适量的小型组织学海绵浸入70%工业甲基化酒精（IMS）中，然后放入组织学包埋盒内。将来自同一药物处理条件下的所有外植体轻柔地转移至同一块海绵上（保持外植体的方向，使与插入圆盘接触的一侧，即药物处理区域，与海绵接触）。在外植体上方再放置一块预先浸泡过的海绵，并将包埋盒封好（每个孔/处理条件使用一个包埋盒）。
    4. 将包埋盒浸入70% IMS中，在室温下放置24小时。
  2. 石蜡包埋与组织切片
    1. 次日，将含有外植体的组织学包埋盒转移至组织处理机（见材料表）的样品篮中，并盖紧盖子。将样品篮放入消解罐中并轻轻关闭。选择所需程序，启动组织处理机。排空消解罐，打开后取出样品篮，然后将样品篮转移至包埋中心的石蜡浴中。
    2. 完成包埋后，将金属包埋盒盖放回样品篮中，再将样品篮放回组织处理机的消解罐内，运行清洗程序。用干燥的纸巾擦拭传感器，清除消解罐盖上的多余石蜡，然后执行清洗程序。
    3. 将石蜡块置于旋转式切片机上，先切去数片4 µm厚的切片，然后将石蜡块放回冰上。重新调整石蜡块位置，继续切取更多4 µm厚的切片。使用小号画笔和镊子将切片转移至水浴中，以去除皱褶和气泡。
    4. 将切片居中放置于载玻片上，静置数分钟以沥干液体，随后将载玻片放入玻片架中，在37 °C孵育箱内干燥过夜。切片干燥后，将其存放于室温下的玻片夹或玻片盒中，以防灰尘污染。

5. 苏木精-伊红（H&E）染色

  1. 将染色机（参见材料表）加入试剂，并设置H&E染色所需程序：苏木精染色时间：5 min；伊红染色时间：3 min。
  2. 将载玻片架固定在载体上，放入第一个盛有二甲苯的容器中，启动程序。将载玻片载体从架上取下，连同载玻片架一起转移至封片区域。
  3. 在通风橱内使用邻苯二甲酸二丁酯二甲苯（DPX）进行封片。在每张盖玻片上滴加DPX，将组织面朝下将载玻片缓慢置于盖玻片上，使DPX均匀铺展。
    注意：DPX具有危害性，避免接触皮肤，并在指定通风橱内操作。

6. 免疫染色

注意：除非另有说明，以下步骤均在室温下进行。

  1. 脱蜡与复水
    1. 将切片放入切片架中，在65 °C下加热10分钟，然后用二甲苯脱蜡3分钟（2次）。尽量减少溶液的残留量。
      注意：二甲苯易燃、有害且具有刺激性。应在通风橱内操作，并佩戴双层手套。避免接触皮肤和眼睛。废液应置于密闭容器中妥善处理。
    2. 按照以下酒精梯度对切片进行复水：99% IMS 溶液中孵育 1 分钟（两次），随后在 95% IMS 溶液中孵育 1 分钟。尽量减少溶液的残留量。
      注意：IMS 高度易燃、易挥发且具有刺激性。应在通风橱内操作，避免接触皮肤和眼睛。
    3. 将载玻片架完全浸入超纯水（UP水）中5分钟。
  2. 抗原修复
    1. 根据所用特定抗体的制造商指南配制抗原修复缓冲液。
      注意：0.2 M 柠檬酸盐缓冲液，pH 6，或 tris(hydroxymethyl)氨基甲烷（Tris）-乙二胺四乙酸（EDTA）0.1 M，pH 9，分别为酸性和碱性条件下常用的缓冲液。柠檬酸一水合物和Tris具有刺激性。所有储备液均应在通风橱中配制。避免接触皮肤和眼睛。
    2. 将放置载玻片的支架浸入抗原修复缓冲液中，并进行微波处理（参见 材料表以最大功率（800 W）处理 20 分钟。
      注意：整个过程中需保持载玻片完全浸没在缓冲液中。为避免缓冲液体积过度减少，请在所用容器上方加盖。
  3. 多重免疫荧光（mIF）
    注：此过程需要1–2天。
    1. 用洁净容器加入250 mL超纯水，将载玻片架完全浸入水中2分钟（重复一次）。随后将每张载玻片装入载玻片盖板中（参见 材料表).
      1. 将载玻片装配到盖板上时，准备一个盛水的玻璃槽。将盖板和载玻片均浸入水中，并使组织切片面朝向盖板。
      2. 将载玻片底边置于盖板底部的凸起之上，最后对齐载玻片与盖板，使水充满两者之间的间隙且无气泡残留。手持盖板与载玻片，将其放入盖板架中。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）填充盖板，等待缓冲液在重力作用下流过载玻片以进行洗涤（2次）。用移液器加入110 μL封闭缓冲液（参见 材料表将每块盖玻片放入孵育10分钟。
    3. 根据制造商的建议，用 PBS 或封闭缓冲液配制所需浓度的一抗。每张切片加入 110 μL 一抗，孵育 30 分钟。按照 6.3.2 步骤，用 5 mL PBS 洗涤切片 2 次。
    4. 将切片与110 μL辣根过氧化物酶聚合物在室温下孵育30分钟。按照6.3.2步骤，用5 mL PBS洗涤切片2次。
    5. 在扩增稀释液中按1:100（v/v）稀释荧光染料，将切片与荧光染料（每张切片110 μL）孵育10分钟。按照6.3.2节所述，用5 mL PBS洗涤切片2次。
      注意：使用荧光染料780时，请遵循制造商的使用说明。若将切片置于PBS最终洗涤液中，并于4 °C过夜保存，则实验可在此处暂停。
    6. 取下盖板上的载玻片，返回抗原修复步骤，开始使用另一种抗体进行染色。重复染色步骤，直至完成所有待检测抗体的染色。
    7. 按照第6.3.5步对最后一个使用的荧光染料进行操作，将切片保留在载玻片上，用超纯水配制6 μM的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）双乳酸盐溶液，每张切片加入110 μL，避光孵育5 min进行复染。用超纯水洗涤切片（2次），通过吸干切片边缘去除多余水分。使用封片剂将盖玻片封固于切片上，避光室温保存。

7. 扫描

注意：切片扫描使用多光谱自动成像系统进行（参见材料表）。

  1. 将切片组装到载片架中，并按所需顺序装入扫描仪。
    注意：建议包含一个对照切片，在免疫组织化学染色过程中不使用任何荧光染料或 DAPI。该切片将用作组织自身荧光（自发荧光，AF）的对照。
  2. 启动切片扫描软件后，从首页选择编辑方案。创建一个新方案，填写名称、成像模式、要执行的多光谱扫描类型（4–7 个通道）以及研究项目（目录）。
    注意：如需修改分析波段的默认设置，可使用选择扫描波段功能来选中或取消选中所需的滤光片。
  3. 继续进行扫描曝光和加载载片架操作，最后为方案设置选择相应的载片架。点击获取概览图像以检测切片上的组织。在载片架上选择一个切片，并使用红色光标选择组织的特定区域，使其在屏幕左侧窗口中显示实时图像。
  4. 选择DAPI 滤光片，点击自动对焦或手动调节载物台高度滑块，以聚焦目标区域。点击自动曝光，使系统为该滤光片/波段找到最佳曝光参数。
    注意：每个滤光片的曝光时间初始设定为 12 ms。在系统自动曝光后，可进一步优化曝光时间。也可通过在高亮单元格中手动输入数值来覆盖自动曝光值。
  5. 对方案中所有滤光片重复上述步骤。如有必要，更换位置和/或切片，以找到设置曝光的最佳信号。
    注意：如果在实时视图中组织区域呈现红色，则表示当前分析滤光片的荧光信号已饱和，必须重新执行自动曝光。
  6. 确定曝光参数后，点击返回按钮并保存方案。从软件首页（参见材料表）选择扫描切片。
  7. 将所有待扫描的载片架堆叠放入切片载架存放舱，并记录切片顺序，以便在系统中分配其编号。
    注意：在软件界面上，每个载片架对应一个包含 4 张切片的插槽。
  8. 若要为多个切片配置相同参数，请点击配置任务，并选择一个或多个插槽，勾选选项对相同切片使用相同规则。当编辑切片界面打开后，配置任务、研究项目和方案，然后点击确定。
  9. 通过点击插槽图标为每张切片标注标签，并在切片编号单元格中输入名称。点击扫描以开始扫描。
    注意：当插槽图标变为蓝色且切片旁出现蓝色箭头时，表示载片架已具备所有规则，可进行扫描。可通过点击保存设置按钮，保存切片编号、研究项目、方案和任务信息。

8. 分析

注意：以下方案说明了表型分析的方法。

  1. 图像准备
    1. 为准备图像进行分析，请打开查看软件（参见材料表），并选择加载切片。在屏幕右侧选择训练项目所需的扫描图像。
    2. 对于每个扫描图像，点击标记，并在选择用途： 框中选择项目。在图像区域中定义一个尺寸为 1 × 1 的标记，稍后将用作训练分析的模板。注意，此标记将以红色方框标示。
      注：用于项目的标记注释数量无固定要求。建议为自发荧光扫描图像生成一个标记，并额外添加几个能代表组织内信号分布的标记。
    3. 最后，打开实验中的所有扫描图像。对每张图像，点击标记，此次在选择用途： 框中选择批量选项。放置一个包围每个外植体的标记。
      注：此次标记将以绿色方框标示，并在启动批量分析时被调用。请根据需要选择合适的标记尺寸（1 × 1、2 × 2、3 × 3），并避免标记重叠，否则导出文件中将产生重复数据。
  2. 训练分析
  3. 启动分析软件（参见材料表），创建一个新项目：选择 文件 | 新建 | 项目。
  4. 在项目名称框中输入名称，并配置项目类型。
    注：本实验采用以下设置：可训练的组织分割；自适应细胞分割；表型分析。
  5. 加载包含训练标记的扫描图像：文件 | 打开 | 图像。在单图模式视图中浏览图像，选择具有自发荧光的扫描图像。
  6. 点击自发荧光（AF）按钮，使用自发荧光选取工具在未染色的组织区域上绘制。点击准备图像，使软件从所有用于训练的图像中减去自发荧光强度。
  7. 点击编辑标记与颜色按钮，在对应荧光染料的框中输入标记名称。点击屏幕顶部的组织分割步骤，打开组织分割训练窗口。
  8. 在组织类别窗口中，输入要将图像分割成的组织类别名称（例如：肿瘤、间质、背景、坏死）。
  9. 在组织分割训练窗口中，点击绘制按钮，在细胞群周围绘制区域以定义感兴趣的组织类别。例如，为定义肿瘤区域，可在一群肿瘤细胞周围绘制区域。切换至下一类别并重复绘制过程。
    注：建议在大多数用于训练的图像中绘制区域。也可通过调整模式尺度和分割分辨率来优化训练，具体细节请参阅用户手册。
  10. 完成训练区域定义后，继续执行训练组织分割器。
    注：训练过程中，软件将显示组织分割的准确率百分比。为获得最佳结果，建议组织分割准确率至少达到90%。当分割器结果稳定后，点击完成按钮。
  11. 要查看所有图像上的组织类别掩膜，请点击全部分割按钮。
  12. 在验证组织分割质量后，对分类错误的区域重新绘制训练区域，并重新训练组织分割器，直至达到满意效果。
  13. 点击窗口顶部步骤栏中的细胞分割步骤，继续分析。
  14. 选择要分割的细胞区室：细胞核、细胞质和/或细胞膜。
    注：由于自适应细胞分割仅能检测具有核信号的细胞，因此请勿取消选择细胞核。尽管也可分割细胞质和/或细胞膜，但建议优先选择信号最强、最丰富的核组分（例如 DAPI）。
  15. 使用典型强度滑块配置核组分，以调整用于检测核像素的阈值。注意观察打开的预览窗口，其会随着阈值调整提供实时反馈。
    注：该阈值为自适应，相对于周围背景进行测量。若检测到过多背景信号，应提高该值；若微弱的细胞核未被检测到，则应降低该值。使用显示/隐藏区域按钮可切换分割掩膜的显示，检查核像素是否被正确识别。
  16. 为分割成簇的核像素，请使用核组分分割面板。选择最能描述细胞核染色质量的按钮，然后使用滑块调整分割灵敏度，注意较低的值会导致更多分割。
  17. 点击全部分割按钮以对所有图像进行分割。若结果不准确，请修改设置并重新训练软件，直至获得满意的分割效果。
  18. 进入分析的最后一步：表型分析。在表型面板中，添加要检测的表型列表，并在相应的文本框中输入名称。点击编辑表型按钮，选择特定细胞以弹出下拉菜单，并选择对应的表型。
    注：每种表型至少需要五个细胞用于训练分类器。关闭细胞核的可视化可更清晰地观察需分配的细胞表型。
  19. 完成训练选择后，点击训练分类器按钮。
    注：软件将对图像中的每个细胞进行分类，若出现分类错误，可编辑细胞表型并重复训练分类器。在进行批量分析前请保存项目，并点击屏幕顶部工具栏中的导出。
  20. 在左侧菜单中选择批量分析选项卡，在批量算法或项目框中加载项目。
  21. 点击导出选项，为每张图像创建独立目录，并使用浏览按钮选择数据导出位置。勾选图像和表格中的所有选项以进行导出。
  22. 在屏幕右侧点击添加切片，加载所有包含先前准备的批量标记的图像（步骤 7.3）。点击运行按钮以启动批量分析，逐个处理每个标记并导出相应数据。

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结果

对多重免疫荧光染色的组织切片进行多光谱成像，可实现对移植物肿瘤微环境（TME）中单个细胞群体的鉴定与表型分析，以及肿瘤和间质成分的识别（图2）。多光谱成像在分析具有高本底自发荧光的组织（如富含胶原的组织）时尤为有用，因为它能够将自发荧光信号与其他信号分离，并在后续分析中将其排除。随后通过计算机进行的组织与细胞分割，可实现对药物反应的定量分析，输出参数多样，包括但不限于细胞总数（例如，阳性百分比）、信号强度、细胞大小、组织面积以及单个细胞的空间位置。

因此，组织和细胞分割对于药物治疗效果的定量分析以及肿瘤特异性和基质特异性反应的识别极为有用。例如，同时对Ki67和cPARP以及肿瘤标志物进行染色，可分别对离体组织中外植体的增殖和细胞死亡水平进行定量（图3）。在本示例中，针对抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）免疫检查点抑制剂（ICI）纳武利尤单抗处理下的PDE，分别对基质区和肿瘤区的Ki67和cPARP水平进行了定量。此外，从染色切片中提取空间信息的能力，使得可以计算...

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讨论

本文描述了PDEs的生成、药物处理和分析方法，并强调了该平台作为临床前模型系统的优势。对新鲜切除的肿瘤进行离体 培养，无需破坏其结构，可保留肿瘤的组织架构13,24，从而维持肿瘤微环境（TME）中细胞组分的空间相互作用以及瘤内异质性。本方法展示了如何利用肿瘤特异性标志物，区分肿瘤组织区域与间质区域，进而分别评估这些区域对药物的反应（图3）。此外，还可同时分析多种生物标志物，以评估免疫细胞在肿瘤微环境内的靶向迁移等效应（图4）。

先前的一项研究报道了该PDE平台在非小细胞肺癌（NSCLC）PDE中用于标准护理化疗药物顺铂的分层应用，表明可以将化疗耐药与化疗敏感的群体区分开来24。这些与PDE相关的发现与患者的临床反应相一致。通过采用本文所述的方法，可以对其他肿瘤类型以及不同类型的药物（无论是化...

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披露

无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢莱斯特大学医院NHS信托基金的外科医生和病理学家提供手术切除的肿瘤组织。我们还感谢核心生物技术服务中心的组织学设施在FFPE组织块的处理和切片方面提供的帮助，以及Kees Straatman在使用Vectra Polaris系统方面的支持。本研究由Explant联盟资助并提供资金支持，该联盟包括四个合作单位：莱斯特大学、医学研究理事会毒理学部门、英国癌症研究会治疗发现实验室以及LifeArc。此外，研究还获得了英国癌症研究中心-英国国家健康研究所莱斯特实验癌症医学中心（C10604/A25151）的支持。GM、CD和NA的研究经费由Breast Cancer Now的Catalyst计划（2017NOVPCC1066）提供，该计划获得了辉瑞公司的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma320099染色试剂
抗体稀释液/封闭液，1xPerkin ElmerARD1001EA抗体稀释/封闭缓冲液
Barnstead NANOpure DiamondBarnstead超纯水（UP）H2O制备仪
柠檬酸一水合物Sigma-AldrichC7129柠檬酸缓冲液用试剂
Costar 多孔细胞培养板Corning Incorporated35166 孔板
DAPI 二盐酸盐Life TechnologiesD3571
100 x 17 mm 培养皿，Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350组织培养用 100 mm 直径培养皿
DMEM (1x) 改良杜尔贝科培养基 + 4.5 g/L D-葡萄糖 + 110 mg/mL 丙酮酸钠Gibco (Life Technologies)10569-010组织培养基（500 mL）
DPX 封片剂VWR360294H封片介质
DPX 封片剂Merck6522封片介质
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-Aldrich3609TE 缓冲液用试剂
伊红CellPathRBC-0100-00A染色试剂
胎牛血清Gibco10500-064用于组织培养基
37% 甲醛Fisher (Acros)11969001010% 福尔马林
iGenix 微波炉 IG2095iGenixIG2095用于抗原修复的微波炉
工业变性酒精（IMS）Genta Medical19905099% 工业变性酒精（IDA）
InForm 高级图像分析软件Akoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 组织处理仪Leica Biosystems全自动真空组织处理仪
Leica Arcadia H 和 CLeica Biosystems包埋蜡浴
Leica RM2125RTLeica Biosystems轮转式切片机
Leica ST4040 线性染色机Leica Biosystems苏木精-伊红（H&E）染色机
Mayer 苏木精SigmaGHS132-1L染色试剂
Millicell 细胞培养插件，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 µmMerck MiliporePICMORG50类器官培养插件圆盘
Novolink 聚合物检测系统Leica BiosystemsRE7150-KDAB 染色试剂盒
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG 试剂Akoya BiosciencesFP1501001KT含二甲基亚砜（DMSO）稀释液和 TSA-DIG 试剂的荧光染料
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb，1xPerkin ElmerARH1001EAHRP 聚合物
青霉素/链霉素溶液Fisher Scientific11548876用于组织培养基
PhenoChart 全片上下文查看器Akoya BiosciencesPhenoChart扫描图像查看软件
磷酸盐缓冲液片剂Thermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus 放大稀释液Perkin ElmerFP1498荧光染料稀释液
Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36961封片介质
载玻片架Perkin Elmer用于将载玻片装入 Vectra Polaris 扫描仪的载玻片架中
氯化钠Fisher ScientificS/3160/6310% 福尔马林
氢氧化钠颗粒Fisher ScientificS/4920/53柠檬酸缓冲液用试剂
Tenatex 加强型蜡 - 粉红色（500 g）KEMDENT1-601牙科蜡表面
Thermo Scientific Shandon Sequenza 免疫染色中心载玻片架 Fisher Scientific10098889载玻片及夹具支架
Thermo Scientific Shandon 塑料盖板Fisher Scientific11927774载玻片夹
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）Sigma-Aldrich252859TE 缓冲液用试剂
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10封片介质
Vectra Polaris 载玻片扫描仪Perkin ElmerVectra Polaris载玻片扫描仪
二甲苯Genta MedicalXYL050脱蜡剂

参考文献

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