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方法文章

采用CLARITY组织透明化方法对整体视网膜进行免疫染色

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DOI：

10.3791/62178

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2021年3月6日

 , 
1Eye Research Institute, Oakland University

本文内容

摘要

本文介绍了一种将CLARITY方法应用于全层视网膜组织的实验方案，旨在提升视网膜神经元及其亚细胞结构的标准免疫组织化学染色质量和高分辨率成像效果。

摘要

组织水凝胶脱脂法（CLARITY）最初由Deisseroth实验室开发，现已经过改进，并被广泛用于厚脑组织样本的免疫染色与成像。然而，这一先进技术尚未应用于整体视网膜样本。尽管视网膜具有部分透明性，但其厚度约为200 µm（小鼠），仍会限制抗体向深层组织的渗透，并降低高分辨率成像时的光线穿透能力。在此，我们针对整体小鼠视网膜样本改进了CLARITY方法：通过丙烯酰胺单体对视网膜进行聚合，形成纳米多孔水凝胶，随后使用十二烷基硫酸钠进行透明处理，以最大限度减少蛋白质损失并避免组织损伤。经CLARITY处理的视网膜使用针对视网膜神经元、胶质细胞及突触蛋白的抗体进行免疫染色，置于折射率匹配溶液中封片后进行成像。我们的数据表明，CLARITY 可显著提升整体视网膜样本中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫组织化学染色与成像质量。例如，CLARITY显著改善了多巴胺能无长突细胞的细小轴突样和树突样结构的三维分辨率。与未经处理的整体视网膜相比，CLARITY能够更清晰地显示突触后密度蛋白95等突触蛋白的免疫染色信号。我们的结果表明，CLARITY通过去除脂质使视网膜光学透明性增强，同时保留了视网膜神经元及其蛋白的精细结构，因此可常规用于整体视网膜样本中视网膜神经元及其亚细胞结构的高分辨率成像。

引言

脊椎动物的视网膜可能是中枢神经系统（CNS）中最易于接近的部分，是研究脑发育、结构和功能的极佳模型。视网膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个网状层分隔。外核层（ONL）包含经典的感光细胞（视杆细胞和视锥细胞），可将光转化为电信号。这些电信号由内核层（INL）中的神经元（包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞）进行处理，然后传递至节细胞层（GCL）中的视网膜神经节细胞（RGCs）。RGCs 是视网膜的输出神经元，其轴突投射至大脑，参与形成图像和非图像相关的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（Muller 细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境有害变化的影响。

一类特化的无长突细胞亚群能够合成并释放多巴胺，这种物质是中枢神经系统中一种重要的神经调质，可在光适应过程中重构视网膜神经环路1,2。多巴胺能无长突细胞（DACs）具有独特的形态学特征：其胞体位于内核层（INL）近端，树突在内丛状层（IPL）最远端区域分支。DACs的轴突样突起无髓鞘、纤细且较长，分支稀疏，并带有突触小泡结构（即多巴胺释放位点）。这些突起在IPL中与树突形成致密的神经丛，包括围绕AII型无长突细胞胞体的环状结构。此外，这些轴突还穿过INL延伸至外丛状层（OPL），在视网膜内形成离心通路3。我们已证实，DAC的突起表达多种谷氨酸受体，可响应来自突触前神经元（包括双极细胞和内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs））释放的谷氨酸4,5,6。然而，目前尚不清楚这些谷氨酸受体是表达于轴突、树突，还是两者皆有，因为在垂直视网膜切片中这些结构被切断，彼此之间难以区分5,6。因此，需要在视网膜全层铺片上进行免疫染色，以揭示DACs的三维分支结构及其亚细胞区室上谷氨酸受体的分布情况。尽管视网膜本身具有相对透明的特性，但小鼠全层铺片视网膜的厚度约为200 µm，这限制了抗体向深层组织的渗透，同时也因组织的光散射效应而影响高分辨率成像的光照穿透。为克服这些限制，我们采用了近期为厚脑切片开发的、适用于免疫染色的组织水凝胶去脂技术（CLARITY），并将其优化应用于小鼠视网膜全层铺片7。

CLARITY 方法最初由 Deisseroth 实验室开发，用于厚脑组织样本的免疫染色与成像7。该方法利用强效去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）结合电泳技术去除导致组织光散射的脂质成分，同时保留蛋白质和核酸的原有结构。被清除的脂质由丙烯酰胺等水凝胶单体形成的透明支架替代，以支撑剩余的蛋白质结构。经透明化处理的组织可通过免疫组织化学进行标记，并实现显著增强的光穿透深度（可深入组织表面下数毫米）进行成像。此后，多个研究团队对该 CLARITY 方法进行了优化与简化8,9,10。一种改进的 CLARITY 方案采用被动透明化技术，避免了电泳过程可能对全脑及其他完整器官造成的组织损伤11。然而，该方法尚未应用于整体视网膜样本。本文中，我们对被动 CLARITY 技术进行了适应性改进，使其适用于整体视网膜，以提高其透明度，便于免疫组织化学染色与成像。我们发现，在该处理过程中，大多数检测的视网膜蛋白均得以保留，可用于免疫组织化学分析。通过使用折射率匹配溶液，我们实现了对整体视网膜中从外核层（ONL）到神经节细胞层（GCL）约 200 µm 厚度范围内视网膜神经元的完整成像。

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方案

小鼠的饲养和所有实验操作均按照美国国立卫生研究院关于实验动物的指南进行，并经奥克兰大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：18071）。

注意：溶液名称及其成分列于表1中。

1. 组织制备

  1. 使用过量 CO2 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
  2. 用弯头镊子摘除眼球，并将其转移至含有 0.1 M PBS 的小型培养皿中（表 1）。在解剖显微镜下，用针头在角膜-巩膜交界处刺一个小孔。随后将眼球转移至 4% 多聚甲醛（PFA）中固定 1 小时。
  3. 将眼球重新放回含有 PBS 的培养皿中。在解剖显微镜下，使用解剖剪沿角膜-巩膜交界处完整环切，移除角膜和晶状体。在视神经根部剪断，并用镊子小心剥离巩膜，以分离出视网膜。
  4. 在视网膜周围均匀做四个小切口，用蘸有 PBS 的细头刷子将视网膜展平（神经节细胞层朝下），呈三叶草状贴附于硝酸纤维素滤膜裁成的小方片上，以固定视网膜。
  5. 用镊子夹住硝酸纤维素膜的边缘（避免接触已固定的视网膜），将视网膜转移至 48 孔板中的 4% PFA 溶液中，4 °C 固定 1 小时。
  6. 将滤膜与视网膜转移至含有 PBS 的孔中，洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）。
  7. 转移至 A4P0 溶液（表 1）中，4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
  8. 用移液器将植物油加入孔中，完全覆盖 A4P0 溶液。在 40 °C 水浴中孵育 3 小时，期间不振荡。
  9. 用 PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次），确保彻底去除所有油相。如有必要，在最后一次洗涤前，可用移液器小心吸除孔表面残留的油滴。
  10. 在 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）中 40 °C 孵育两天，轻柔振荡。第二天更换为新鲜 SDS 溶液。
  11. 将滤膜与视网膜转移至含 Triton-X-100 的 PBS（PBST，表 1）中，洗涤（每次 1.5 小时，共 5 次）。
  12. 可在含 0.01% 叠氮化钠（NaN3）的 PBST 中 4 °C 保存，或直接进行免疫染色。

2. 免疫染色与折射率匹配

  1. 在PBST中用细头刷轻轻将视网膜从滤纸上剥离下来。
  2. 将视网膜在封闭液（见表1）中稀释的一抗溶液（见表2）中孵育，40 °C条件下轻柔振荡孵育2天。
  3. 用PBST洗涤（每次1.5小时，共5次）。
  4. 在封闭液中稀释相应的二抗（见表3），40 °C条件下轻柔振荡孵育2天，并在后续所有步骤中避光操作。
  5. 用0.02 M磷酸盐缓冲液（见表1）洗涤（每次1.5小时，共5次）。
  6. 在基于山梨醇的折射率匹配溶液（sRIMS，见表1）中，40 °C条件下轻柔振荡孵育过夜。

3. 封片

  1. 用细头永久性记号笔在玻璃盖玻片（18 mm x 18 mm x 1.5 mm）背面划出轮廓，标记出玻璃载玻片背面的方形边界。
  2. 将载玻片翻转，在正面使用注射器沿该边界涂抹一圈薄薄的硅脂，留出一个角落的小缝隙，以便过量的封片液排出。
  3. 将视网膜转移至划定区域的中央，用细头刷轻轻调整，使其平铺，并确保感光细胞侧紧贴载玻片。
  4. 用移液器滴加约 60 µL 的 sRIMS 溶液，覆盖已展平的视网膜并延伸至封闭区域的一个角落，注意保持视网膜平整且位置固定。
  5. 从含有 sRIMS 的角落开始盖上盖玻片，缓慢放下，直至其四周均接触硅脂，避免产生气泡。
  6. 在封片后的视网膜两侧各放置三片堆叠的盖玻片作为间隔物，用另一块载玻片的长边轻轻按压盖玻片，使封片平整均匀。
  7. 将载玻片平放于 4 °C 保存，直至成像。

4. 成像

  1. 在常规荧光显微镜或共聚焦显微镜上观察样品图像（材料表）。首先将载玻片放置于显微镜载物台上，并定位样品。
    注意：若使用倒置物镜显微镜，请先确保载玻片暴露区域无任何硅脂和封片液残留，然后将载玻片倒置放置于载物台上。
  2. 为获得共标记样品的z轴层扫图像，需首先分别对各通道信号进行单独对焦，并根据荧光显微镜或共聚焦显微镜的类型，设置相应的曝光时间或扫描速度。
  3. 通过手动设定所需范围顶部和底部的焦平面，或设定中心焦平面后再指定围绕该中心的扫描范围，来确定z轴层扫的范围。
  4. 根据需要调整步进大小或切片层数。
  5. 采集图像，并保存原始文件，同时导出为TIFF文件或其他所需格式。

5. 图像分析

  1. 使用选定的图像分析软件（材料表）调整每个通道的亮度和对比度，直至单个图像以及z轴堆栈的三维重建图像均达到最佳清晰度。
    注意：如果所选步长足够小，也可进行三维去卷积以增强信号。

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结果

经改良CLARITY处理的视网膜组织具有光学透明性。
为了建立一种适用于视网膜组织且兼容免疫组织化学应用的透明化方法，同时实现充分的去脂化并保持细胞蛋白的结构完整性，我们对CLARITY组织透明化方法进行了优化，并应用于小鼠视网膜全层铺片。我们对该方案进行了简化，并针对视网膜全层铺片进行了调整（见实验方案）。在完成组织杂交、透明化及折射率匹配后，与未经处理的对照组视网膜相比，采用此改良CLARITY方案处理的视网膜在整个视网膜厚度方向上几乎完全透明（图1A），而未处理的对照组视网膜则不透明（图1B）。该结果表明，本改良CLARITY方案可实现充分透明化的视网膜全层铺片组织。

改良CLARITY处理后视网膜中神经元的三维成像优化
为评估该改良型 CLARITY 方法所提供的免疫组织化学染色的质量与实用性，我们对经 CLARITY 处理的视网膜使用多种一抗进行染色（

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讨论

针对整体视网膜的CLARITY方案改良。
我们对CLARITY方案进行了简化，使其在无需使用真空脱气或干燥装置的情况下即可实现充分的聚合，而此前大多数研究均依赖此类设备7,9,11。由于氧气会抑制聚合过程，因此在聚合步骤中必须将样本与空气隔离。然而，我们发现无需采用氮气脱气，仅通过在样本上覆盖油层即可有效隔绝空气，使聚合顺利进行；在充分冲洗后，该方法不会对后续实验步骤产生不利影响，这一点已有文献报道12。我们进一步采用被动透明化方法对方案进行了简化，以降低电泳透明化过程中组织褐变及组织结构损伤的风险11。通过温和振荡和提高温度，可加速被动透明化进程，仅需两天即可完成组织透明化。在此期间，脂质去除已足够充分，可获得光学透明的组织，同时最大程度减少对细胞结构及免疫组织化学染色至关重要的蛋白质和其他生物分子的损失。

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢 Bing Ye、Nathan Spix 和 Hao Liu 提供的技术支持。本工作由美国国立卫生研究院基金项目 EY022640（D.-Q.Z.）和奥克兰大学教务长本科生研究奖（E.J.A.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710固定剂
丙烯酰胺Fisher BiotechBP170水凝胶单体
Axio Imager.Z2Zeiss荧光显微镜
BSAFisher ScientificBP1600封闭剂
Eclipse TiNikon Instruments扫描共聚焦显微镜
KClVWRBDH0258缓冲液组分
KH2PO4SigmaP5655缓冲液组分
Na2HPO4Sigma AldrichS9763缓冲液组分
NaClSigma AldrichS7653缓冲液组分
NaH2PO4Sigma AldrichS0751缓冲液组分
NaN3Sigma AldrichS2002抑菌防腐剂
NDSAurion900.122封闭剂
NIS Elements ARNikon图像分析软件
SDSBioRad1610301脱脂剂
山梨醇Sigma Aldrich51876缓冲液组分
吐温-100SigmaT8787表面活性剂
吐温-20Fisher ScientificBP337表面活性剂
VA-044Wako Chemicals011-19365热引发剂

参考文献

  1. Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
  2. McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
  3. Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
  4. Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647(2012).
  5. Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
  6. Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).
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  9. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  10. Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).
  11. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  12. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
  13. Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).

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