采用CLARITY组织透明化方法对整体视网膜进行免疫染色

摘要

本文介绍了一种将CLARITY方法应用于全层视网膜组织的实验方案，旨在提升视网膜神经元及其亚细胞结构的标准免疫组织化学染色质量和高分辨率成像效果。

摘要

组织水凝胶脱脂法（CLARITY）最初由Deisseroth实验室开发，现已经过改进，并被广泛用于厚脑组织样本的免疫染色与成像。然而，这一先进技术尚未应用于整体视网膜样本。尽管视网膜具有部分透明性，但其厚度约为200 µm（小鼠），仍会限制抗体向深层组织的渗透，并降低高分辨率成像时的光线穿透能力。在此，我们针对整体小鼠视网膜样本改进了CLARITY方法：通过丙烯酰胺单体对视网膜进行聚合，形成纳米多孔水凝胶，随后使用十二烷基硫酸钠进行透明处理，以最大限度减少蛋白质损失并避免组织损伤。经CLARITY处理的视网膜使用针对视网膜神经元、胶质细胞及突触蛋白的抗体进行免疫染色，置于折射率匹配溶液中封片后进行成像。我们的数据表明，CLARITY 可显著提升整体视网膜样本中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫组织化学染色与成像质量。例如，CLARITY显著改善了多巴胺能无长突细胞的细小轴突样和树突样结构的三维分辨率。与未经处理的整体视网膜相比，CLARITY能够更清晰地显示突触后密度蛋白95等突触蛋白的免疫染色信号。我们的结果表明，CLARITY通过去除脂质使视网膜光学透明性增强，同时保留了视网膜神经元及其蛋白的精细结构，因此可常规用于整体视网膜样本中视网膜神经元及其亚细胞结构的高分辨率成像。

引言

脊椎动物的视网膜可能是中枢神经系统（CNS）中最易于接近的部分，是研究脑发育、结构和功能的极佳模型。视网膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个网状层分隔。外核层（ONL）包含经典的感光细胞（视杆细胞和视锥细胞），可将光转化为电信号。这些电信号由内核层（INL）中的神经元（包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞）进行处理，然后传递至节细胞层（GCL）中的视网膜神经节细胞（RGCs）。RGCs 是视网膜的输出神经元，其轴突投射至大脑，参与形成图像和非图像相关的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（Muller 细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境有害变化的影响。

一类特化的无长突细胞亚群能够合成并释放多巴胺，这种物质是中枢神经系统中一种重要的神经调质，可在光适应过程中重构视网膜神经环路^1,2。多巴胺能无长突细胞（DACs）具有独特的形态学特征：其胞体位于内核层（INL）近端，树突在内丛状层（IPL）最远端区域分支。DACs的轴突样突起无髓鞘、纤细且较长，分支稀疏，并带有突触小泡结构（即多巴胺释放位点）。这些突起在IPL中与树突形成致密的神经丛，包括围绕AII型无长突细胞胞体的环状结构。此外，这些轴突还穿过INL延伸至外丛状层（OPL），在视网膜内形成离心通路³。我们已证实，DAC的....

方案

小鼠的饲养和所有实验操作均按照美国国立卫生研究院关于实验动物的指南进行，并经奥克兰大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：18071）。

注意：溶液名称及其成分列于表1中。

1. 组织制备

1. 使用过量 CO₂ 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
2. 用弯头镊子摘除眼球，并将其转移至含有 0.1 M PBS 的小型培养皿中（表 1）。在解剖显微镜下，用针头在角膜-巩膜交界处刺一个小孔。随后将眼球转移至 4% 多聚甲醛（PFA）中固定 1 小时。
3. 将眼球重新放回含有 PBS 的培养皿中。在解剖显微镜下，使用解剖剪沿角膜-巩膜交界处完整环切，移除角膜和晶状体。在视神经根部剪断，并用镊子小心剥离巩膜，以分离出视网膜。
4. 在视网膜周围均匀做四个小切口，用蘸有 PBS 的细头刷子将视网膜展平（神经节细胞层朝下），呈三叶草状贴附于硝酸纤维素滤膜裁成的小方片上，以固定视网膜。
5. 用镊子夹住硝酸纤维素膜的边缘（避免接触已固定的视网膜），将视网膜转移至 48 孔板中的 4% PFA 溶液中，4 °C 固定 1 小时。
6. 将滤膜与视网膜转移至含有 PBS 的孔中，洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）。
7. 转移至 A4P0 溶液（<....

结果

经改良CLARITY处理的视网膜组织具有光学透明性。
为了建立一种适用于视网膜组织且兼容免疫组织化学应用的透明化方法，同时实现充分的去脂化并保持细胞蛋白的结构完整性，我们对CLARITY组织透明化方法进行了优化，并应用于小鼠视网膜全层铺片。我们对该方案进行了简化，并针对视网膜全层铺片进行了调整（见实验方案）。在完成组织杂交、透明化及折射率匹配后，与未经处理的对照组视网膜相比，采用此改良CLARITY方案处理的视网膜在整个视网膜厚度方向上几乎完全透明（图1A），而未处理的对照组视网膜则不透明（图1B）。该结果表明，本改良CLARITY方案可实现充分透明化的视网膜全层铺片组织。

改良CLARITY处理后视网膜中神经元的三维成像优化
为评估该改良型 CLARITY 方法所提供的免疫组织化学染色的质量与实用性，我们对经 CLARITY 处理的视网膜使用多种一抗进行染色（

讨论

针对整体视网膜的CLARITY方案改良。
我们对CLARITY方案进行了简化，使其在无需使用真空脱气或干燥装置的情况下即可实现充分的聚合，而此前大多数研究均依赖此类设备^7,9,11。由于氧气会抑制聚合过程，因此在聚合步骤中必须将样本与空气隔离。然而，我们发现无需采用氮气脱气，仅通过在样本上覆盖油层即可有效隔绝空气，使聚合顺利进行；在充分冲洗后，该方法不会对后续实验步骤产生不利影响，这一点已有文献报道¹²。我们进一步采用被动透明化方法对方案进行了简化，以降低电泳透明化过程中组织褐变及组织结构损伤的风险¹¹。通过温和振荡和提高温度，可加速被动透明化进程，仅需两天即可完成组织透明化。在此期间，脂质去除已足够充分，可获得光学透明的组织，同时最大程度减少对细胞结构及免疫组织化学染色至关重要的蛋白质和其他生物分子的损失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	固定剂
丙烯酰胺	Fisher Biotech	BP170	水凝胶单体
Axio Imager.Z2	Zeiss		荧光显微镜
BSA	Fisher Scientific	BP1600	封闭剂
Eclipse Ti	Nikon Instruments		扫描共聚焦显微镜
KCl	VWR	BDH0258	缓冲液组分
KH2PO4	Sigma	P5655	缓冲液组分
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	缓冲液组分
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	缓冲液组分
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	缓冲液组分
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	抑菌防腐剂
NDS	Aurion	900.122	封闭剂
NIS Elements AR	Nikon		图像分析软件
SDS	BioRad	1610301	脱脂剂
山梨醇	Sigma Aldrich	51876	缓冲液组分
吐温-100	Sigma	T8787	表面活性剂
吐温-20	Fisher Scientific	BP337	表面活性剂
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	热引发剂