使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色

脊椎动物直膜也许是中枢神经系统（CNS）中最容易接近的部分，是研究大脑发育、结构和功能的极好模型。网状膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个丛状层隔开。外核层（ONL）由将光转换成电信号的经典光感受器（棒和圆锥体）组成。电信号由内核层 （INL） 中的神经元处理，包括双极、水平和阿马林细胞，然后传输到结节细胞层 （GCL） 中的视网膜结节细胞 （RGCs）。RGC 是视网膜的输出神经元，轴突投射到大脑中，有助于图像形成和非图像形成的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（穆勒细胞、天文胶质和微胶质）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境的有害变化。

一种特殊的亚种群的阿马克莱细胞产生和释放多巴胺，在CNS中的重要神经调节器，重新配置视网膜神经回路在光适应^1，2。多巴胺胺性腺素细胞 （DACs） 具有形态特征的独特特征。他们的索玛塔位于近侧的 INL 中，树突在内丛状层 （IPL） 的最荒凉部分进行撞击。DAC 的Axon 样过程是未细化、薄而长、枝条稀疏且具有差异（多巴胺释放的部位）。它们与 IPL 中的树突形成密集的丛状物，包括围绕 AII amacrine 细胞的索马塔周围的环状结构。轴突也穿过 INL 向 OPL 运行，形成一条穿过视网膜³的离心通道。我们已经证明，DAC处理表达受体，以回应谷氨酸释放从前突性神经元，包括双极细胞和内在感光视网膜结节细胞（ipRGCs）4，5，6。然而，目前还不清楚谷氨酸受体是否表达在轴突上，树突上，或两者，因为它们被切断在垂直视网膜部分，不能区分彼此^5，6。需要在整个安装视网膜中进行免疫染色，以揭示 DAC 的三维分支和亚细胞隔间中谷氨酸受体的存在。虽然视网膜相对透明，但小鼠全坐骑视网膜的厚度约为 200 μm，这限制了抗体渗透到深层组织，并减少了组织光散射导致的高分辨率成像光渗透。为了克服这些限制，我们调整了免疫染色相容组织水凝胶脱脂方法（CLARITY）最近开发的厚脑部分到全安装小鼠视网膜^7。

CLARITY方法最初是由戴塞罗斯实验室开发的，用于免疫和成像厚脑样本^7。它使用强洗涤剂、硫酸钠 （SDS） 和电磷酸盐去除脂质成分（导致组织光散射），使蛋白质和核酸就位。去除的脂质被一个透明的脚手架所取代，该脚手架由丙烯酰胺等水凝胶单体组成，以支持剩余的蛋白质结构。清除的组织可以通过免疫化学进行标记，并通过组织（组织表面以下几毫米）显著增加光渗透深度进行成像。此后，由^8、9、10几个研究小组对CLARITY方法进行了优化和简化。修改后的CLARITY协议使用被动清除技术，以避免电泳可能产生的组织损伤，用于清除全脑和其他完整的器官^11。然而，这种方法尚未应用于全山视网膜。在这里，我们为全山视网膜采用了被动的CLARITY技术，使其在免疫化学和成像方面更加透明。我们发现，在免疫造血过程中，大多数被测试的视网膜蛋白都保存下来。使用折射指数匹配解决方案，我们能够在全山视网膜中从 ONL 到 GCL 的大约 200μm 厚度上对视网膜神经元进行成像。

老鼠护理和所有实验程序都是根据国家卫生研究院关于实验室动物的指南进行的，并得到了奥克兰大学动物护理和使用机构委员会的批准（第18071号议定书）。

注:解决方案的名称及其组成列在 表1中。

1. 组织准备

1. 用过量_{的二氧化碳}对小鼠进行安乐死，然后是颈椎脱位。
2. 用弯曲的钳子使眼睛受洗，并将其转移到带有0.1 M PBS（表1）的小培养皿中。在解剖显微镜下，用针头在角膜-硬膜交界处戳一个小洞。转移到4%的甲醛（PFA）1小时。
3. 将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在角膜-硬膜交界处一路切割。取出角膜和镜片。切开视神经底部，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。
4. 在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷将其平整（GCL 侧向下），形成三叶草状形状，从硝基纤维素滤纸上切开一个小方块，以稳定视网膜。
5. 使用钳子转移网膜，以保持硝基纤维素纸的一角（不接触安装的网膜），并将其放置在48井板与4%PFA 1小时。
6. 将滤纸和网膜转移到带 PBS 的井中，然后洗涤（每次 3 次，每次 5 分钟）。
7. 转移到A4P0（表1），并在4°C的温和搅拌下在一夜之间孵化。
8. 派佩特植物油进入井中，完全覆盖A4P0溶液。在40°C的水浴中孵育3小时，无摇晃。
9. 在 PBS 中清洗（每次 3 次 5 分钟），确保所有油均被冲洗掉。如有必要，请使用管道在最后一次冲洗之前小心地从油井顶部取出剩余的油。
10. 在 40 °C 的 10% SDS 中孵化两天，轻轻摇晃。在第二天用新的解决方案替换 SDS。
11. 将滤纸和视网膜与 Triton-X-100 （PBST， 表 1）一起转移到 PBS 中，然后洗涤（每次 5 倍，每张 1.5 小时）。
12. 在PBST中储存4°C，含0.01%的钠（NaN_3），或直接移动到免疫染色。

2. 免疫染色和折射指数匹配

1. 用PBST中的细尖刷轻轻剥落，从滤纸中取出网膜。
2. 在阻塞溶液（表 1）中稀释的主要抗体 （表 2）中孵化 2 天，在 40 °C 下轻轻摇晃。
3. 在PBST中清洗（5倍，每个1.5小时）。
4. 在 40 °C 的阻塞溶液中用适当的二次抗体（表 3）稀释 2 天，轻轻摇晃，并通过剩余过程免受光线的照射。
5. 在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中清洗 （5 倍，每个 1.5 小时）（见表 1）。
6. 在基于沙比妥的折射指数匹配解决方案 （sRIMS，参见 表 1）中孵化，在 40 °C 过夜，轻轻摇晃。

3. 安装

1. 勾勒出 18 mm x 18 mm x 1.5 mm 玻璃盖片，并带有细尖永久标记，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。
2. 翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界，在一个角落留下一个小缝隙，以便多余的安装溶液逸出。
3. 将网膜转移到边界区域的中心，并安排用细尖刷，使其平躺在照片受体侧对玻璃滑梯。
4. Pipette 大约 60μL 的 SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角，注意网状网膜保持平整和到位。
5. 将盖片从角落与 SRIMS 一起涂抹，慢慢降低，直到它触及四面的油脂，避免形成气泡。
6. 将一叠 3 个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖子，使坐骑是平的，均匀的。
7. 在成像前，将幻灯片平放到 4 °C。

4. 成像

1. 传统荧光显微镜或共聚焦显微镜（材料表）上的图像样本。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。
   注意:如果使用倒置的客观显微镜，请将幻灯片倒置在舞台上，首先确保滑梯的暴露区域远离所有硅胶油脂和安装溶液。
2. 要获取共同标记样品的 z 堆叠图像，请首先单独关注每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。
3. 通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后指定中点周围的范围，为 z 栈设置范围。
4. 根据需要调整步幅大小或切片数量。
5. 捕获图像并保存原始文件，并导出它作为 TIFF 文件或其他所需的格式。

5. 图像分析

1. 使用所选图像分析软件（材料表）调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 z-stack 的三维渲染中实现最佳清晰度。
   注意:如果选定的步幅足够小，也可以执行 3D 下放以增强信号。

经过修改的CLARE处理视网膜是光学透明组织。
为了制定一种与视网膜免疫生化应用相容的组织清除方法，同时提供足够的去皮化和保持细胞蛋白的结构完整性，我们采用了CLARITY组织清除方法，以全安装小鼠视网膜。我们能够简化协议并修改它为全安装视网膜（见协议）。在完成组织杂交、清除和折射索引匹配后，与非加工控制视网膜（图 1B）相比，使用此修改的 CLARITY 协议处理的视网膜在整个视网膜厚度（图1A）中显示出几乎完全的光学透明度。这一结果表明，对CLEARCLE协议的修改提供了充分清除的全安装网膜组织。

改进了经过修改的 CLARITY 处理视网膜中神经元的 3D 成像。
为了评估这种改良的CLARITY方法提供的免疫化学染色的质量和实用性，我们用各种主要抗体（表2）染色了CLARITY处理视网膜。这些抗体标记了网状网膜中的每种主要细胞类型:锥形光感受器、杆双极细胞、阿麦格林细胞、RGCs 和胶质细胞，以及针对亚细胞突触蛋白的抗体。除细胞活性标记磷-S6（pS6）外，所有测试的抗体都证明与CLARITY兼容。典型的例子用图2来说明。我们对锥形凝血素、酪氨酸羟基酶 （TH） 和具有多拼接 （RBPMS） 的 RNA 结合蛋白进行了三重标记。我们从 ONL 到 GCL 拍摄了一系列z堆栈共焦显微镜图像.个别图像显示，在 ONL（图 2A）、INL（图 2B）中标有 TH 标签的 DAC 和在 GCL （图2C）中标记 RBPMS 标记的 RGC 中的逮捕素锥体。叠加图像揭示了这些神经元在整个视网膜厚度的相对位置（图2D）。这些结果表明，CLARITY可以提高许多标准免疫化学染色的质量，并清楚地揭示整个安装制剂中视网膜整个厚度的神经元的3D结构。

改性CLARITY可提高视网膜神经元和突触蛋白精细过程的3D分辨率。
我们进一步分析了CLARIT处理的全安装视网膜（图3A，B）中的TH染色，并将其与从标准全安装制备（图3C，D）获得的成像进行比较。对焦图像显示，在CLEAL处理的直膜（图3A）中，与标准的直膜（图3C）相比，DAC的树突和轴突状过程暴露得更加清晰。特别是，与标准视网膜相比，DAC 的轴状过程在 CLARITY 视网膜中表现出更完整的环状结构（见图 3A中的插入）（见图 3C中的插入物）。值得注意的是，使用荧光显微镜（图3B）拍摄的CLARITY网状网状结构与使用共焦（图3A）观察到的结构几乎相同。此外，类似轴龙的过程也向外视网膜运行，在 X-Z 定向图像（图 4A）中观察到。这些数据表明，即使使用传统的荧光显微镜，仍可用于识别全山视网膜中类似轴龙的 DAC 过程。

当AMPA受体亚单位GluA2和后突触密度蛋白95（PSD-95）在标准全山视网膜中检查时，两者都没有被发现，可能是由于抗体对这些突触蛋白渗透到深视网膜中。为了确定CLARITY处理的视网膜是否允许这些抗体免疫性突触蛋白，我们用亚单位GluA2和PSD-95对TH进行了三重标记。对GluA2和PSD-95的免疫学显示，分别显示单独的含有GluA2的AMPA受体（图4B）和假定后抗菌位点（图4C）。叠加图像显示 DAC 进程 （图 4D）上的一些标点符号明显。我们用所有三个污渍对假定共定位点进行了成像，并将其呈现在 3D 视图中（图 5）。从所有三种观点，TH 与 GluA2 和 PSD-95（图 5 A-C）明确共存。这些3D视角的结果来自全安装视网膜验证我们以前的报告，即在垂直视网膜切片5，6的DAC过程中，含GluA2的AMPA受体的突触表达。

图1。CLARITY 提供光学透明组织。 全安装鼠标视网膜使用修改后的 CLARITY 方法（参见协议）进行处理，整个视网膜使用解剖显微镜成像，覆盖在 0.67 厘米的方格上以显示比例。 答: 清晰处理的全安装视网膜，网格线通过透明组织清晰可见。箭头描绘直膜的位置。 B: 非清晰处理控制性网状管，在 PFA 中固定 1 小时，并在 PBS 中孵育。网格线被组织的相对不透明性所掩盖。比例栏:约2毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2。改进了在 CLARITY 处理视网膜中视网膜厚度的神经元的三维成像。 全山的CLARITY视网膜被免疫，并带有针对锥体逮捕素、TH和RBPMS的抗体。图像表示在 X-Z 方向中查看的 z 堆叠共焦图像的 3D 卷渲染。 答: 锥色光感受器（箭头），由锥体逮捕（蓝色）标记。内视网膜（箭头）中可见轻微斑点，可能是由于背景染色。 B: DAC索马和树突（箭头）由TH标记（红色）。箭头指示内视网膜中的视网膜血管，由于多标签免疫染色而可见。 C: RBPMS（绿色）标记的RGC索马塔（箭头）。箭头表示由于血管的自流和非特异性染色而可见视网膜血管。 D: 三层标记染色的合并图像，揭示了这些神经元在视网膜厚度的相对位置，锥形光感受器位于外核层，DAC位于内部核层，RGC位于结核细胞层。卷视图的缩放以 20μm 的增量标记。 请单击此处查看此图的更大版本。

图3。清晰揭示了DAC形态的精细结构。 TH免疫染色是在CLARITY处理（A 和 B）和标准（C 和 D）视网膜中进行的。Z 堆叠图像使用共焦（A 和 C）和荧光显微镜（B 和 D）拍摄。从每个图像中单个光学平面插入突出显示可能由轴突式过程形成的环状结构。箭头指示 DAC 索马塔，许多环状结构可见（示例由箭头指示），在 CLARITY 处理视网膜（A 和 B）中显示的树突和轴突状过程的密集丛中。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4。改性CLARITY可提高细树突状结构和突触蛋白的3D分辨率。 在CLARITY处理的全山视网膜中进行了三次免疫染色，抗体针对TH、GluA2和PSD-95。从 z 堆叠共焦成像中重建了卷渲染，并以角度 X-Z 方向呈现。 答: 内核层和过程（黄色箭头）在解剖内部丛状层（红色）分层的TH标记DAC索马塔（箭头）。白色箭头表示向外视网膜延伸的离心过程。 B: 在内丛状层（绿色）上，GluA2 含 AMPA 受体的密集穿刺表达。箭头表示视网膜血管的自流。 C: 蓬克塔揭示由PSD-95标记在内部丛状层（蓝色）的突触后站点。箭头表示血管，明显由于使用小鼠单克隆抗体对抗PSD-95。 D: 覆盖图像显示 TH 标记的 DAC 进程与 GluA2 和 PSD-95 的表达方式重叠。卷视图的缩放以 20μm 的增量标记。 请单击此处查看此图的更大版本。

图5。在 DAC 上含有 GluA2 的 AMPA 受体的突触表达。 在 图 4 中显示的 TH、GluA2 和 PSD-95 的假定三重同位素化点以 3D 中选择并进行了调查。A1 表示 X-Z 方向 （A5） 中的 DAC 过程（红色）的一段。A2 和 A3 分别显示一个 GluA2 标点（绿色）和 PSD-95 点点（蓝色），方向相同。合并后的图像 （A4） 显示了 TH、GluA2 和 PSD-95（箭头）的三重共定位。B1-B4 在 Y-Z 方向 （B5） 中显示同一位置（箭头）。C1-C4 显示 X-Y 平面 （C5） 中同一点 （箭头） 的同一点 （箭头） 的同一位置化。三重同位素化在每个方向上都很明显。比例栏: 2μm. 请单击此处查看此图的更大版本。

表1。解决方案的组成。

表2。 测试的主要抗体摘要。 IHC传说:+3=一致，高度特定的染色;+2=一贯良好的染色，最小的背景:+1=良好的染色，一些背景:0=与清晰度不兼容。

表3。二次抗体测试摘要。

作者声明没有相互竞争的经济利益。