利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

摘要

本文介绍了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK）细胞、肝脏组织来源的NK细胞，以及由外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）衍生的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该方案展示了利用221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞和CAR-NK细胞，并实现了扩增后NK细胞的优化纯度。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞疗法已成为治疗癌症和传染性疾病的一种新兴手段。基于自然杀伤细胞（NK）的免疫疗法，尤其是CAR-NK细胞疗法，因其无需个体化定制、可即用型（“现货型”）且不引起严重危及生命的毒性反应，被认为是最具前景的疗法之一。然而，开发成功CAR-NK疗法的瓶颈在于如何从第三方获得足够数量、非耗竭状态且长期存活的“现货型”CAR-NK细胞。在此，我们开发了一种新的CAR-NK细胞扩增方法，该方法利用表达基因修饰的膜结合型白细胞介素-21（IL-21）的EB病毒（EBV）转化B细胞系作为刺激细胞。本方案中提供了从脐血、外周血以及实体器官组织中逐步扩增NK细胞和CAR-NK细胞的详细操作步骤。本研究将显著推动CAR-NK免疫疗法的临床发展。

引言

自然杀伤（NK）细胞是一类重要的淋巴细胞亚群，表达CD56，但不表达T细胞标志物CD3^1,2。传统NK细胞被归类为先天免疫细胞，负责对病毒感染细胞和癌细胞进行免疫监视。与T细胞不同，NK细胞通过CD16或其他激活受体识别被感染或恶性转化的细胞，无需抗原肽与主要组织相容性复合体（MHC）I类分子形成复合物^3,4。近期针对复发或难治性CD19阳性癌症（非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病[CLL]）的临床研究显示，嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞具有显著的安全性优势⁵。例如，CAR-NK细胞输注与极低或可忽略的移植物抗宿主病（GVHD）、神经毒性、心脏毒性以及细胞因子释放综合征（CRS）相关^6,7,8,9,10。然而，传统的人NK细胞扩增方法往往导致细胞表型耗竭，伴随强烈的自相残杀效应和端粒缩短，这为获得足够数量的功能性NK细胞用于过继性免疫治疗带来了重大挑战¹¹。

为了克服这些挑战，已开发出一种方法，可直接从未经分选的外周血单个核细胞（PBMCs）或脐血（CB）中扩增原代自然杀伤（NK）细胞，该方法使用经辐照且经基因改造的721.221（下文简称221）细胞系，这是一种MHC I类分子表达水平较低的人B淋巴母细胞样细胞系³。先前的研究表明IL-21在NK细胞扩增中具有重要作用；因此，研究人员开发了一种基因改造的、表达膜结合型IL-21的721.221细胞系（此后称为221-mIL-21）^{11,12,13,14,15}。结果显示，由221-mIL-21饲养细胞扩增的原代NK细胞平均扩增倍数超过>40,000倍，并可在约2至3周内持续保持较高的NK细胞纯度。有关本方案应用的更多详细信息可参见Yang等人的研究¹⁶。

本方案旨在演示PBNK、CBNK、组织来源NK及CAR-NK细胞新型扩增的逐步操作流程 离体.

方案

本方案中涉及的人体组织和血液相关工作遵循罗格斯大学机构审查委员会（IRB）的指南

1. 从小鼠肝脏组织中扩增NK细胞（第0天），如 图1所示。

注意：初始细胞数量和活力与器官移除后的时间以及初始组织样本量密切相关。然而，如果将组织置于30 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，并在冰上或4 °C冰箱中过夜保存，则自然杀伤细胞（NK细胞）仍可在24小时后以高纯度和高活力进行扩增。

1. 使用无菌外科器械识别可存活的组织区域，以从中获取淋巴细胞。
2. 将组织置于 30 mL HBSS（不含钙或镁）中，并置于冰上保存，直至准备进行分离处理。
3. 在生物安全柜内，使用无菌剃刀片或剪刀和镊子将组织切成 <0.5 cm 的小块。
4. 通过将 10x 储存液用 HBSS 稀释，配制 1x 胶原酶 IV 溶液（1 mg/mL）（10x 胶原酶 IV：10 mg/mL 或约 200 U/mL）。
5. 将切碎的组织块放入组织解离管中。每管组织量不超过 4 g，并用约 10 mL 1x 胶原酶 IV 浸没组织块。
   注意：不建议使用 DNase I，因其可能轻微降低自然杀伤细胞（NK）的存活率和得率。有关所用特定组织解离管的信息，请参见材料表。
6. 将组织解离管放入组织解离仪中，在 37 °C 下充分搅拌以彻底解离组织。
   注意：肝脏组织可能需要超过 30 分钟；对于更易碎的组织，约 15 分钟即可。有关所用特定组织解离管和组织解离仪的信息，请参见材料表。
7. 取出组织解离管，用 5 mL 注射器尾端将悬液反复吹打通过 40 µm 尼龙细胞筛网。收集滤过液，并弃去未消化的大块组织碎片。
8. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
9. 将细胞沉淀重悬于 30% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅中，以去除可能污染最终淋巴细胞组分的脂肪细胞。
   1. 配制 1x PVP 包被的二氧化硅时，使用 PVP 包被的二氧化硅与 10x PBS 按 9:1 比例稀释。
      注意：有关所用特定 PVP 包被二氧化硅的信息，请参见材料表。
   2. 配制 30% PVP 包被的二氧化硅时，用 PBS/HBSS 将 1x PVP 包被的二氧化硅稀释。
10. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于 9 mL R-10 培养基中。
    注意：有关 R-10 培养基成分的信息，请参见材料表。
12. 小心地将细胞悬液叠加于 4 mL Ficoll 或淋巴细胞分离液之上，以分离淋巴细胞与红细胞及多形核细胞。
13. 在室温下以 400 x g 离心 23 分钟，加速度和刹车设为关闭或最低档位。小心倾去上层培养基，收集含有组织浸润性淋巴细胞的界面层。
14. 用 10 mL 培养基冲洗细胞，随后进行细胞计数、流式细胞术分析、细胞分装与冻存，或启动原代 NK 细胞扩增方案。

2. 从外周血单个核细胞（或脐带血或器官组织）扩增原代自然杀伤细胞（第0天），如图2所示。

1. 在37 °C水浴中解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）和冻存的经照射的饲养细胞。
2. 分别用10 mL R-10培养基将PBMC和100 Gy照射的221-mIL-21细胞在400 × g 离心5分钟进行洗涤。
3. 保留1 × 10⁶个PBMC细胞用于流式细胞术检测。
   注意：初始NK细胞纯度是计算NK细胞扩增率的重要因素。
4. 将细胞重悬于1 mL R-10培养基中，使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
5. 在特制的6孔板中（见材料表），将5 × 10⁶个PBMC细胞与10 × 10⁶个100 Gy照射的221-mIL-21细胞混合。
6. 加入30 mL R-10培养基，并添加人IL-2（200 U/mL）和人IL-15（5 ng/mL）（见材料表）。
7. 将特制6孔板置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
8. 每3–4天更换一次培养基，使用添加人IL-2（200 U/mL）和人IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基以维持NK细胞生长。
   注意：每次换液时，每孔细胞数应维持在20 × 10⁶个以下，以利于进一步扩增。为获得最佳存活率，确保每孔总细胞数不超过100 × 10⁶个。
9. 每3–4天记录总细胞数和存活率，并进行流式细胞术分析，以计算NK细胞扩增率。

3. 293T 细胞的贴壁（第 2 天），如图 2所示。

1. 将1.8 × 10⁶个293T细胞接种于每孔100 mm培养皿中，每皿加入11 mL D-10培养基。
   注意：D-10培养基的成分请参见材料表
2. 将293T细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育。

4. 逆转录病毒转染（第3天）

1. 在1.7 mL离心管中，将470 µL低血清培养基与30 µL转染试剂混合。
   注意：所用特定的低血清培养基和转染试剂请参见材料表。
2. 在另一个1.7 mL离心管中，加入2.5 µg pRDF质粒、3.75 µg Pegpam3质粒以及2.5 µg SFG载体中的CAR构建体，用低血清培养基补足至终体积500 µL。
3. 将步骤4.1和4.2中的溶液逐滴混合。
4. 室温孵育15分钟。
5. 在第1天，将步骤4.4中的混合液1 mL逐滴加入293T细胞培养板中。
6. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育48–72小时。

5. Retronectin 包被培养板（第3天）

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将retronectin蛋白稀释至终浓度为50–100 µg/mL。
2. 将500 µL稀释后的retronectin加入未经处理的24孔板的每个孔中（每种CAR构建体使用5个孔）。用封口膜密封培养板，并于4 °C过夜孵育。

6. 转导（第4天）

1. 将含retronectin的培养板在4 °C条件下以2103 × g离心30分钟，弃去上清液。
2. 用1 mL R-10培养基封闭24孔板的每个孔。
3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
4. 在封闭retronectin板的同时，将离心机预热至32 °C。
5. 使用0.45 µm滤器过滤转染后的293T细胞，收集逆转录病毒上清液。
6. 将2 mL过滤后的逆转录病毒上清液分装至每个孔中。
7. 将24孔板在32 °C条件下以2103 × g离心2小时。
8. 在培养板离心过程中，从第0天开始收集扩增的PBNK细胞，并使用台盼蓝染色计数细胞。
   注：通过添加补充有IL-2（200 U/mL）和IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基继续扩增PBNK细胞。
9. 用补充有IL-2（200 U/mL）和IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基将扩增的PBNK细胞稀释至2.5 × 10⁵–5 × 10⁵ 个细胞/mL（每孔0.5 × 10⁶–1 × 10⁶ 个细胞）。
   注：记录总细胞数、细胞活力，并保留5 × 10⁵个扩增的PBNK细胞用于流式细胞术检测，这些参数对确定NK细胞扩增速率至关重要。
10. 离心结束后，从每个孔中部分吸除逆转录病毒上清液。
    注：不要完全吸净，即每孔保留约100 µL上清液，否则会降低转导效率。
11. 将步骤6.8中稀释后的扩增PBNK细胞各2 mL分装至每个孔中。
12. 将培养板在32 °C条件下以600 × g离心10分钟，随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育48–72小时。
    ​注：不要用封口膜密封培养板。

7. CAR-NK 细胞收集（第 6 或 7 天），如图 2所示。

1. 从24孔板中轻柔收集细胞，并将细胞转移至50 mL离心管中
   注意：尽量避免产生气泡，否则会导致细胞活力下降。
2. 将离心管在400 x g 5 分钟。
3. 用1 mL R-10培养基重悬细胞沉淀，使用台盼蓝进行细胞计数。
   注意：保存 5 x 10⁵ 用于流式细胞术的细胞，以确定转导效率。
4. 将重悬的细胞转移至含有30 mL添加了IL-2（200 U/mL）和IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基的特制6孔板中。
5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育特制的6孔板₂.
6. 每隔3至4天更换一次添加了IL-2（200 U/mL）和IL-15（5 ng/mL）的R-10培养基，以维持NK细胞生长。
   注意：保持低于 20 x 10⁶ 每孔细胞数在每次传代时应控制在进一步扩增所需的范围内。为确保最佳存活率，每孔总细胞数不得超过 100 x 10⁶ 细胞
7. 每3-4天记录总细胞数、细胞活力，并进行流式细胞术检测，以计算NK细胞扩增速率。
8. 将细胞用于适当的实验 体外 或 体内 检测方法
   注意： 离体 扩增的PBNK和CAR-NK细胞可在37 °C培养箱中培养约4周。
9. 在第7天、第11天、第14天、第18天和第21天通过流式细胞术检测NK细胞数量和纯度。

结果

使用221-mIL-21饲养细胞方法进行组织浸润性NK细胞分离及PBNK细胞扩增的示意图流程如图所示 图1 和 图2每隔3至4天收集扩增的PBNK细胞，通过流式细胞术检测NK细胞纯度，使用抗人CD56和抗人CD3抗体对细胞进行染色。本实验采用两名不同供体的细胞重复进行，以验证扩增系统的可重复性。图3). 由221-mIL-21扩增的PBNK细胞扩增倍数接近5 × 10⁴ 褶皱 (图3A)此外，在21天的扩增过程中，NK细胞纯度保持在较高水平，约为85%。 (图3B)使用221-mIL-21饲养细胞扩增系统，自然杀伤细胞的纯度在不同供体间均稳定维持在85%至95%之间（数据未显示）。为验证221-mIL-21扩增系统的稳定性，扩增前对PBMCs进行抗CD56和抗CD3染色，结果显示自然杀伤细胞纯度为7.09%，T细胞比例较高图 4A)。将PBMCs与221-mIL-21共培养以扩增NK细胞；在第4天CAR-NK转导前检测NK细胞纯度（图 4A。收集CAR-NK细胞并用抗CD56、抗CD3和抗hIgG(H+L) F(ab')进行染色_2, 显示较高的NK细胞比例（第7天为86.9%）以及约70%的高CAR转导效率（图4）。使用逆转录病毒包装系统还观察到更高的转导效率（高达95%）。综上所述，这些数据表明，221-mIL-21饲养细胞能够有效扩增NK细胞并维持NK细胞纯度 离体.

图1：从人实体器官样本扩增NK细胞的示意图。简言之，获取的人肝脏样本被剪切成小块以进行机械消化。随后使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的二氧化硅和淋巴细胞分离液分离解离的细胞。进一步地，采用图2中所述的扩增方案对NK细胞进行扩增。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：从 PBMC 生成 CAR-NK 细胞的示意图流程。 简言之，在第 0 天，将 221-mIL21 饲养细胞以 100 Gy 剂量辐照后，与补充了 IL-2 和 IL-15 的 PBMC 共同培养。同时，将 293T 细胞转染逆转录病毒包装系统，以产生 CAR 逆转录病毒，随后在 IL-2 和 IL-15 存在条件下将该病毒转导至扩增中的 PBNK 细胞。在第 7 天收获初级 CAR-NK 细胞，并继续扩增 21 天。本图经 Yang 等人¹⁶ 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：外周血NK细胞的动态时间推移扩增。（A）PBNK细胞在22天时间过程中的扩增倍数。在指定时间点，细胞用抗CD56和抗CD3抗体染色后进行流式细胞术分析。NK细胞总数通过将NK细胞纯度百分比乘以细胞总数量计算得出。扩增率计算公式如下：(NK细胞数量)_Tn/(NK细胞数量)_T0，其中NK细胞数量 =（NK细胞纯度百分比）×（细胞总数），T₀表示第0天的NK细胞数量，Tn表示第n天的NK细胞数量。（B）在22天时间过程中NK细胞的纯度变化。NK细胞扩增实验使用两名不同供体样本重复进行了两次。误差线表示±标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：CAR-NK 细胞的代表性流式细胞术分析。（A）代表性散点图显示 CAR-NK 细胞在 18 天培养过程中 NK 细胞纯度的动态时间变化。通过在指定时间点用抗 CD56 和抗 CD3 抗体染色进行流式细胞术分析。第 0 天表示 PBNK 扩增前；第 4 天表示 PBNK 扩增后及 CAR-NK 细胞转导前；第 7 天表示 CAR-NK 细胞转导后。（B）使用逆转录病毒包装系统转导 CAR-NK 细胞的代表性散点图，显示转导效率。细胞经抗 CD56、抗 CD3 及抗人 IgG(H+L) F(ab')2 抗体染色后进行流式细胞术检测。（C）第 18 天时不同亚群中 CAR 表达的代表性散点图，包括 CD56⁺CD3^-、CD56^-CD3⁺、CD56⁺CD3⁺ 和 CD56^-CD3^- 亚群。细胞经抗 CD56、抗 CD3 及抗人 IgG(H+L) F(ab')2 抗体（指示 CAR 表达）染色后进行流式细胞术检测。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前临床试验中的大多数CAR-NK产品均采用NK细胞系¹⁷，例如NK-92，一种源自非霍奇金淋巴瘤患者的细胞系¹⁸，NK-92MI，白细胞介素-2非依赖性NK-92细胞系¹⁹，以及从一名大颗粒淋巴细胞患者中分离出的NKL²⁰，因为这些细胞系易于增殖，可用于生产“即用型”产品。然而，这些细胞系（例如NK-92细胞）的临床疗效有限 体内 扩增，因为它们在输注前需要进行辐照，从而限制了其增殖能力和细胞毒性 在体²¹鉴于这些原因，目前正在进行多种策略探索，以扩增来自不同来源的原代NK细胞，包括外周血、脐带血、骨髓（BM）、人胚胎干细胞（HSCs）、诱导性多能干细胞（iPSCs）以及肿瘤组织^21,22,23例如， NK细胞可以扩增 离体 使用白细胞介素（包括 IL-15、IL-18 和 IL-21）进行自然杀伤细胞扩增。此外，也可使用淋巴母细胞样细胞系（如 K562 细胞）或 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞样细胞系（如 721.221 细胞）来扩增 NK 细胞¹⁶然而，上述策略通常产生的自然杀伤细胞数量不足以用于过继性CAR-NK免疫治疗^22,24为帮助解决该问题，本研究展示了一种实验方案 离体 使用经基因修饰的EBV转化细胞系221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞

使用本方案中221-mIL-21饲养细胞的扩增方法已优化，可使自然杀伤细胞（NK细胞）的扩增倍数至少比其他白血病细胞系高出10至100倍，这些细胞系包括表达膜结合型IL-21的HL-60和OCl-AML3细胞、K562细胞以及表达OX40配体的K562-mIL21细胞。^22,24,25CAR 表达也持续评估约 2 周 离体 更重要的是，221-mIL-21 饲养细胞扩增策略可用于扩增来自多种来源的自然杀伤（NK）细胞，包括外周血单个核细胞（PBMCs）、脐带血（CB）以及肝脏等实体器官，且无需预先进行NK细胞富集步骤。尽管221-mIL-21 饲养细胞系统对供体的依赖性低于前述的饲养细胞系，但其仍不完全独立于供体。通常情况下，221-mIL-21 扩增系统可实现约90%的NK细胞纯度，并获得较高数量的NK细胞，扩增倍数约为 <扩增后第14天T细胞污染率为5%。因此，为消除T细胞污染的可能性，在对所获样本进行后续操作前，必须先分离出NK细胞 离体 扩增或使用 CD3⁺ 选择系统以在之后清除T细胞 离体 扩增

使用NK细胞扩增系统的一个批评在于，扩增后或输注前可能未能完全清除饲养细胞，这可能带来重要的监管问题；因此，在输注前彻底清除饲养细胞至关重要。然而，近期一些使用K562-mIL21-4-1BBL饲养细胞的CAR-NK临床试验 离体 CBNK细胞扩增^24,25 未发现令人担忧的并发症。此外，我们的初步数据显示，在扩增过程中，经照射的221-mIL-21细胞群体数量逐渐减少（数据未显示）。然而，该扩增方法在临床应用前仍需开展更广泛的研究。综上所述，221-mIL-21扩增系统有助于解决原代CAR-NK细胞扩增的难题，因此将在不久的将来显著推动CAR-NK细胞免疫治疗的广泛应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 表面处理无菌组织培养皿	VWR	10062-880	用于转染
293T 细胞	ATCC	CRL-3216	用于转染
6 孔 G-REX 培养板	Wilson Wolf	80240M	用于 NK 细胞扩增
AF647 标记的 AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	109-606-088	用于流式细胞术
SFG 载体中的 CAR 构建体	由 Dongfang Liu 博士实验室构建		用于转染
胶原酶 IV	Sigma	C4-22-1G	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
冻存培养基 成分：胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV	90%
冻存培养基 成分：二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2050	10%
D-10 培养基 成分：DMEM	VWR	45000-304
D-10 培养基 成分：胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV	10%
D-10 培养基 成分：青霉素-链霉素	VWR	45000-652	1%
FastFlow & 低吸附 Millipore Express PES 膜	Millex	SLHPR33RB	用于转导
Genejuice 转染试剂	VWR	80611-356	用于转染
gentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
gentleMACS Octo	Miltenyi Biotec	Quote	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
Hank's 平衡盐溶液（HBSS - 不含钙或镁）	ThermoFisher	14170120	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
人 IL-15	Peprotech	200-15	用于 NK 细胞扩增
人 IL-2	Peprotech	200-02	用于 NK 细胞扩增
辐照过的 221-mIL21 饲养细胞	由 Dongfang Liu 博士实验室制备		用冻存培养基冻存
淋巴细胞分离液	Corning	25-072-CV	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
OPTI-MEM	ThermoFisher	31895	用于转染
PE 标记抗人 CD3 单克隆抗体（克隆号 HIT3a）	Biolegend	300308	用于流式细胞术
PE/Cy7 标记抗人 CD56（NCAM）单克隆抗体（克隆号 5.1H11）	BioLegend	362509	用于流式细胞术
Pegpam3 质粒	由 Dongfang Liu 博士实验室构建		用于转染
Percoll	GE Healthcare	17089101	用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离
外周血单个核细胞（PBMCs）	纽约血液中心		从健康供体血浆中分离，用冻存培养基冻存
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV	用于转导
pRDF 质粒	由 Dongfang Liu 博士实验室构建		用于转染
R-10 培养基 成分：RPMI 1640	VWR	45000-404
R-10 培养基 成分：L-谷氨酰胺	VWR	45000-304	1%
R-10 培养基 成分：青霉素-链霉素	VWR	45000-652	1%
R-10 培养基 成分：胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV	10%
Retronectin	由 Dongfang Liu 博士实验室制备	自制	用于转导
台盼蓝	Corning	25-900-Cl	用于细胞计数
未处理 24 孔板	Fisher Scientific	13-690-071	用于转导