Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir biyokimyasal ve hücresel tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik retikül (ER) membranlar üzerinde birlikte bir araya getirilerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyondan sorumludur. Burada, Zika virüsü (ZIKV) replikasyonunun inhibitörleri için büyük bileşik kütüphaneleri test etmek için replikon tabanlı taramalarda ve enzymatic tahlillerde kullanılan protokolleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir. Replikon bazlı taramalar, Renilla luciferaz'ı muhabir geni olarak ifade eden bhk-21 ZIKV replikon hücre hattı kullanılarak gerçekleştirildi. Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RdRp için in-vitro floresan bazlı tahliller kurduk. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, florojenik peptit substratı Bz-nKRR-AMC kullanılarak ölçüldü, NS5 RdRp uzama aktivitesi, sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablon 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') kullanılarak, RNA uzaması sırasında SYBR Green I'in floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edildi.

Introduction

Zika virüsü (ZIKV), halk sağlığı için sürekli tehditler oluşturan, yakından ilişkili Dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV) ve Sarı Humma virüsünü (YFV) içeren Flaviviruscinsinin gelişmekte olan eklembacaklı kaynaklı bir virüs üyesidir1. Amerika'daki 2015-16 ZIKV salgını, Brezilya'da yenidoğanlarda2,3 ve yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu gibi konjenital ZIKV ilişkili mikrosefali gibi ağır nörolojik bozukluklarla ilişkisi nedeniyle ortaya çıkmasının ardından küresel ilgi gördü4. Enfeksiyon vakalarının sayısı önümüzdeki iki yıl boyunca azalsa da, ZIKV'nin otokton sivrisinek kaynaklı bulaşları 2019'da 87 ülke ve bölgede doğrulandı, bu nedenle virüsün bir salgın olarak yeniden ortaya çıkma potansiyeli tahliye edildi5. Bugüne kadar ZIKV enfeksiyonuna karşı onaylanmış aşı veya etkili ilaç bulunmamaktadır.

Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, ZIKV1inhibitörleri için küçük moleküllü bileşikleri test etmek için iki değerli stratejidir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik reticulum (ER) membranları üzerinde birlikte bir araya getirerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir6. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyon6.

Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir7. Burada, ZIKV replikasyonunun inhibitörlerinin taranırlığında kullanılan protokolleri 96 kuyu plaka biçiminde açıklıyoruz. Replicon tabanlı tahliller bhk-21 ZIKV Rluc replicon hücre hattı kullanılarakgerçekleştirildiyakın zamanda geliştirdiğimiz 8 . Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, florojenik peptit substratını kullanarak rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, Bz-nKRR-AMC, NS5 RdRp için sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablonun uzamasını ölçtük 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), intercalating boya SYBR Green I kullanarak.

Glisin zengini bir bağlayıcı [G 4 SG 4 ]) tarafından NS3 proteaz etki alanının 1-177 kalıntılarına bağlı ZIKV proteaz(45-96NS2B kofaktör kalıntısı) elde edildi, YFV9için açıklandığı gibi, polimeraz (RdRp etki alanının 276-898 kalıntısı) klonlandı ve10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade edildi. Her iki enzim dizisi de GenBank ALU33341.1'den türetilmiştir. Primer antiviral taramalar olarak bileşikler 10 μM'de test edilir ve aktiviteleri %80'≥ gösterenler doza bağımlı bir şekilde değerlendirilir ve bu da etkili/inhibisyon (EC50 veyaIC 50)ve sitotoksik (CC50)konsantrasyonları ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar bağlamında, NITD008'in EC50 ve CC50 değerleri, bilinen bir flavivirüs inhibitörü11, replikon bazlı taramalardan gösterilmiştir. Enzmatik tahliller için, antibakteriyel, antifungal ve antiviral aktiviteli 400 molekülden oluşan bir kütüphane olan MMV/DNDi Pandemi Müdahale Kutusu'ndan iki bileşiğin IC50 değerleri gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan protokoller, diğer ilgili flavivirüslerin inhibitörlerini taramak için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Luciferase aktivitesi tahlili

NOT: Hücre kültürünü içeren tüm prosedürlerin sertifikalı biyogüvenlik başlıklarında yürütüldüğünden emin olun (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Dulbecco'nun %10 FBS ve 500 μg/mL G418 ile desteklenmiş Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) oluşan büyüme ortamı hazırlayın.
  2. %100 DMSO'da test edilmiş bileşiklerin 10 mM stok çözeltisini hazırlayın ve ardından%100 DMSO'da 1 mM'ye seyreltin.
  3. Kültür ZIKV Rluc replikon hücreleri büyüme ortamlarında 37 °C'de 75 cm2 kültür şişesinde CO2nemlendirilmiş inkübatörde (bkz. Malzeme Tablosu)%70-90 izdiah edene kadar.
  4. Ortamı atın. Mataraya 5 ila 10 dakika boyunca 5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve ardından hücreleri 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı atın, hücreleri 5 mL DMEM% 10 FBS'de yeniden biriktirin ve hemositometrede 10 μL yeniden kullanılmış hücreleri sayın.
  6. Hücreleri DMEM'de 2 x10 4 hücre/kuyuya% 10 FBS ve 96 kuyu hücreli bir hücre kültür plakasında kuyu başına 100 μL hücre tohumuna ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  7. Plakayı 37 °C'de 16 saat boyunca CO2nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Ardından, ortamı çok kanallı bir mikropipette ile atın ve plakaya 100 μL / kuyu DMEM% 2 FBS ekleyin.
  9. Test ortamında 10 μM% 1 DMSO nihai konsantrasyona neden olmak için kuyu başına 1 μL bileşik ekleyin. İlk sütunda, inhibisyon kontrolü yok olarak yalnızca%1 DMSO ve son sütuna NITD008'i pozitif kontrol (%100 inhibisyon) olarak ekleyin.
  10. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca CO2nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu).
  11. Renilla luciferase Tahlil Sistemi kitini oda sıcaklığında çözün, üreticinin talimatlarına göre 1x Renilla luciferaz Liziz Tampon çalışma çözeltisi ve uygun miktarda Renilla Luciferaz reaktifi (Test tamponu + substrat; kuyu başına 100 μL) hazırlayın.
  12. Süpernatantı çok kanallı bir mikropipette ile hücrelerden atın ve kuyu başına 25 μL 1x Renilla luciferaz Lizis Tamponu ekleyin.
  13. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından çok kanallı bir mikropipette ile 20 μL hücre lysates'i 100 μL / kuyu Renilla luciferase Assay Reaktif içeren beyaz bir opak 96 kuyu plakasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
  14. Işıklı işaretleri bir ışıkölçerde veya lüminesansı okuma seçeneği olan herhangi bir ekipmanda okuyun (bkz. Malzeme Tablosu).
  15. Her plaka için, Z faktör değerini hesaplayın 12, aşağıdaki gibi: Z′ = 1 - ((3SD numune + 3SD kontrol)/│Ekek- Kontrol ortalaması│); SD - standart sapma. 0.5 ile 1.0 arasında bir Z faktörü, kaliteli bir test anlamına gelir 12.
  16. Bileşiklerin EC50 değerlerini belirlemek için, 1,3 ila 1,8 adımlarında açıklandığı gibi ilerleyin ve ardından negatif (%1 DMSO) ve pozitif (NITD008 at 10 μM) kontrollerle birlikte hücrelere seri olarak seyreltilmiş bileşikleri ekleyin. Tahlili iki kez yinelenen olarak gerçekleştirin.
  17. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve EC50 değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

2. Hücre çoğalmasına dayalı MTT tahlili

  1. Madde 1 adım 1.1 ila 1.8'de açıklandığı gibi devam edin.
  2. Bileşikleri başlangıçta 10 μM'de ve kontrol% 1 DMSO'yu hücrelere ekleyin.
  3. Fosfat tamponlu salin (PBS - 137 mM NaCl), 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromür) çözeltisi hazırlayın 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; pH 7.4) ve MTT'nin tam çözünmesine kadar girdap.
  4. MTT çözeltisini kuyu hacminin onda birinde hücrelere ekleyin (10 μL/kuyu).
  5. Plakayı 3-4 saat boyunca CO2nemlendirilmiş bir inkübatörde (bkz. Malzeme Tablosu) 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Süpernatantı çok kanallı bir mikropipette ile atın ve her kuyuya 100 μL DMSO (%100) ekleyin.
  7. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak formazan kristallerini çözün ve ardından bir spektrofotometrede 570 nm'de emiciyi okuyun (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Bileşiklerin CC50 değerlerini belirlemek için, madde 1 adım 1.1 ila 1.8'de açıklandığı gibi devam edin ve ardından negatif (%1 DMSO) denetimi birlikte hücrelere seri olarak seyreltilmiş bileşikleri ekleyin. Tahlili iki kez yinelenen olarak gerçekleştirin.
  9. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve CC50 değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

3. NS2B-NS3 proteaz aktivitesi testi

  1. Buzda bir protein aliquot çözün.
  2. Plaka okuyucuyu (bkz. Malzeme Tablosu)sıcaklığı 37°C olarak ayarlayın.
  3. 80 nM'ye (5 μL/kuyu) seyreltilmiş uygun miktarda protein hazırlayın. Son protein konsantrasyonu 4 nM'dir.
  4. Uygun miktarda Bz-nKRR-AMC substratını buz üzerinde çözün (300 μM stok çözeltisi test tamponunda seyreltilmiş, 10 μL / kuyu).
  5. 96 kuyulu beyaz bir plakada (bkz. Malzeme Tablosu),her kuyuya 84 μL test tamponu (20 mM Tris pH 8.5, % 5 gliserol ve% 0.01 Triton X-100) dağıtın.
  6. Pozitif kontrol reaksiyonunu yapmak için, son sütunun her kuyusuna 1 μM'lik son konsantrasyonu elde etmek için 1 μL Aprotinin dağıtın (su ile seyreltilmiş stok çözeltisi 100 μM)
  7. Negatif kontrol reaksiyonunu yapmak için, ilk sütuna 1 μL DMSO dağıtın (son konsantrasyon% 1).
  8. Bileşik taramayı gerçekleştirmek için, pozitif ve negatif kontrol kuyuları hariç 10 μM (1 mM stok konsantrasyonu) nihai konsantrasyonu elde etmek için her bileşiğin 1 μL'sini dağıtın.
  9. Proteaz çözeltisinin 5 μL'lik kısmını dağıtın.
  10. Plakayı 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. Reaksiyonu başlatmak için 10 μL Bz-nKRR-AMC stok çözeltisi (30 μM'lik son konsantrasyon) dağıtın.
  12. Heyecan dalga boyunu 380 nm ve emisyonu 460 nm olarak ayarlayın ve bir mikro plaka okuyucuda her 1 dakikada bir 30 dakika floresan okuyun (bkz. Malzeme Tablosu). Deneyin tamamını 37 °C'de gerçekleştirin.
  13. Pozitif ve negatif kontrol reaksiyonları için floresan ortalama değerlerini hesaplayın. Proteaz aktivitesinin % 100'ü olarak ayarlayın pozitif kontrolün ortalama değerinin çıkarılan negatif kontrol reaksiyonları için floresan ortalama değeri ve her bileşik için aktivite yüzdelerini hesaplayın.
  14. Her plaka için, adım 1.15'te açıklandığı gibi Z faktörü değerini hesaplayın.
  15. %80'den yüksek bir inhibisyon oranı sergileyen bileşikler için IC50 tayini ile devam edin.
  16. 3.1-3.13 adımlarında açıklandığı gibi, bileşiğin seri seyreltilmesini kullanarak üç taraflı test gerçekleştirin.
  17. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve IC50 değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

4. NS5 RdRp uzama tahlili

NOT: Bu testte kullanılan tüm malzemeler RNase, DNase ve pirogenaz içermeyen sertifikalıdır.

  1. Hem test tamponunu (50 mM Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl2, %0.01 Triton X-100) hem de %0.1 dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış su ile 200 mM ATP stok solüsyonunu hazırlayın.
  2. PCR arıtılmış suda 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') 5 μL aliquot bir termosikler içinde 55 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırarak arıtılmış su.
  3. NS5 RdRp, 200 mM ATP ve x10.000 SYBR Green I stok çözeltisini buz üzerinde çözün.
  4. Proteini 3 mL test tamponunda 250 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.
  5. ATP, 3'UTR-U 30 ve SYBR Green I stok çözeltilerinisırasıyla 1 mM, 300 nM ve 1X'lik son konsantrasyona kadar 3 mL test tamponunda seyrelterek substrat çözeltisi hazırlayın.
  6. 96 kuyulu bir PCR plakasında (bkz. Malzeme Tablosu),her satırın 1 ila 11 numaralı sütunlarına 24,5 μL seyreltilmiş protein ekleyin. Kalan kuyulara aynı miktarda test arabelleği ekleyin.
  7. Kontrol ve boş reaksiyon için, sütun 1 ve 12'ye 0,5 μL DMSO ekleyin. DMSO'da seyreltilmiş 0,5 μL bileşik, 10 μM 1m stok çözeltisinin son konsantrasyonuna ekleyin).
  8. Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. Reaksiyona 25 μL substrat çözeltisi ekleyerek başlayın ve plakayı tekrar kapatın.
  10. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde 30 °C'de kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu)ve floresanları 1 saat boyunca izleyin, fam filtresi ile her 30 sn floresan ölçülebilir (Emisyon:494 nm/Excitation:521 nm).
  11. Her plaka için, adım 1.15'te açıklandığı gibi Z faktörü değerini hesaplayın.
  12. Adım3.15'te açıklandığı gibi% 80'den daha yüksek bir inhibisyon oranı sergileyen bileşikler için IC 50 belirlemesine devam edin.
  13. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve IC50 değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan tüm protokoller 96 kuyu plakalarında bıçaklanmıştır ve plakaların ilk ve son sütununa yerleştirilen negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere tek bir konsantrasyonun birincil taramasında plaka başına 80 bileşiğin değerlendirilmesine izin verir. Replikon tabanlı taramalar, BHK-21-RepZIKV_IRES-Neohücre hattını elde etmek için geliştirilen RNA yapısı ( Şekil1A), tahlil şematik gösterimi ( Şekil1B) ve NITD008'in doz-yanıt eğrilerini (EC50 / 0.28 μM, CC50 > 10 μM) ( Şekil1C). Ec50 ve CC50 hit bileşikleri, Rluc aktivitesinin% 50'sini inhibe etmek ve sırasıyla% 50 sitotoksikliğe neden olmak için gereken konsantrasyonlar olarak belirlenir. Luciferaz tahliline göre, DMSO% 1 inhibitör kontrolü (% 0 inhibisyon) olarak kullanılır ve NITD008 daha önce açıklandığı gibi pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) olarak kullanılır8.

NS2B-NS3 proteaz aktivitesi, proteazın proteolitik aktivitesi nedeniyle salınan AMC'nin floresan izlenmesi ile ölçülür (Şekil 2A). Tripin inhibitörü görevi görür ve zaten flavivirüs proteazları13 , 14,15inhibitörü olarak tanımlanan bir protein olan Aprotinin, bu testte deneysel bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (0.13'ün IC50'si ± 0.02 μM, veriler gösterilmez). Şekil 2B, proteaz aktivitesini hedefleyen bir molekülün doz-yanıt inhibisyon eğrisini göstermektedir, bileşik MMV1634402 (IC50 / 0.36 ± 0.08 μM). NS5 RdRp'nin uzama aktivitesi, sentezlenen dsRNA (Şekil 2C)ile birlikte ölçeklendiğinde SYBR Green I'in floresan yoğunluğundaki artışla gerçek zamanlı olarak ölçülür. ZIKV RdRp'yi hedefleyen bir isabet molekülünün doz-tepki inhibisyon eğrisi, MMV1782220 bileşiği(1,9 ± 0,8 μM'nin IC 50'si), Şekil 2D'degösterilmiştir. NITD008 gibi nükleozid analog inhibitörler enzmatik tahliller için uygun olmadığından, fosfatların molekül16'yahücre içi olarak dahil edilmesi gerektiğinden, NS5 RdRp uzama tahlilleri için herhangi bir pozitif kontrol kullanmadık. Bununla birlikte, yakın zamanda viral polimeraz8'ininhibitörü olarak tanımladığımız ticari bir antibiyotik olan Clofazimine, bir sonraki tahlillerde deneysel bir kontrol olarak kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: Replicon tabanlı gösterimler. A)BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo hücre hattı 8'ielde etmek için geliştirdiğimiz 5' UTR terminusta bir Rluc dizisi ve 3' UTR terminusta bir Neo geni içeren ZIKV replikon yapının şematik gösterimi . B)ZIKV replikasyonunun inhibitörlerini taramak için gerçekleştirilen luciferaz aktivitesi testinin şematik gösterimi ve hücre çoğalmasına dayalı MTT testi. C) NITD008'in doz-yanıt eğrileri (EC 50 ve CC50). Test kopya olarak yapıldı. Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Viral enzim bazlı tahliller. A) NS2B-NS3 proteaz aktivitesi testinin şematik gösterimi. B) MMV1634402 bileşiğin doz-yanıt inhibisyon eğrisi(IC 50). C) NS5 RdRp RNA polimeraz aktivitesi testinin şematik gösterimi. D) MMV1782220 bileşiğin doz-yanıt inhibisyon eğrisi(IC 50). Tahliller üç taraflı olarak yapıldı. Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokoller, 384 veya 1536 kuyu formatlarındaki gösterimler için kolayca uyarlanabilir. HTS formatında gerçekleştirilen biyokimyasal ve/veya hücre bazlı taramalar için, istatistiksel bir parametre olan Z faktörü değeri, bu tahlillerin hassasiyetini, tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sağlamak için her plaka için hesaplanır12. Replikon tabanlı taramalar için 0,5 ve üzeri bir Z' faktör değeri beklenirken, NS3 ve NS5 etkinlik tahlilleri için 0,7 ve üzeri bir değer beklenmektedir. Replicon tabanlı HTS için, BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo hücrelerini, 5' UTR bölgesinde renilla luciferaz(Rluc)dizisi içeren çoğaltıcı bir ZIKV replikon içeren kararlı bir hücre hattı ve 3'UTR'deki bir iç ribozomal giriş bölgesi (IRES) tarafından yönlendirilen bir neomisin fosfotransferaz (Neo) geni geliştirdik. Hücre pasajları arasında karşılaştırılabilir replikasyon seviyelerini ve ilaç duyarlılığını korumak için RNA çevirisinin doğru başlatılması için gerekli olan 38 kapsid kalıntısı ve 30 sarma gen kalıntısı tuttuk8. Yapısal genlerin eksikliği nedeniyle, repliconlar progeny virionları üretmez, böylece laboratuvarda edinilmiş viral enfeksiyon riskini ortadan kaldırır17.

ZIKV replikon hücrelerini kullanan antiviral tahliller luciferaz aktivitesi ve paralel olarak gerçekleştirilen hücre çoğalma bazlı MTT (sitotoksiklik) testlerinden oluşur. Bu, doğrudan muhabir protein ekspresyon ve / veya aktivitesine müdahale eden moleküllerden ve hücre sağlığını olumsuz etkileyen moleküllerden oluşan yanlış-pozitif vuruşları dışlamak için gereklidir7. Replicon sistemleri, RNA replikasyonunu engelleyen ancak viral giriş ve virion montajı/ salınımı için gerekli olanları inhibe etmeyen moleküllerin keşfine izin verir. Alternatif olarak, repliconlar trans17'dekiyapısal proteinleri sağlayarak virüs replikon parçacıkları (VRP' ler) üretmek için paketlenebilir. Elde eden tek turlu enfeksiyöz parçacıklar (SRIP'ler) bulaşıcıdır, ancak paket genom yapısal genlerden yoksun olduğu için soy virüsü yayılamaz. Bu nedenle, VRP'ler muhabir proteininin seviyelerini ölçerek viral giriş / replikasyon inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir7.

Replikon tabanlı taramalara ek olarak, burada rekombinant NS3 proteaz ve NS5 RdRp için viral enzim bazlı testlerde kullanılan protokolleri de ayrıntılı olarak açıkladık. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, 7-amin-4-metilcoumarin (AMC) floresan etiketi ile birleştiğinde ZIKV proteaz tanıma ve bölünme dizisini içeren florojenik peptit substratı Bz-nKRR-AMC kullanılarak ölçüldü. Proteaz aktivitesi nedeniyle, floresan etiketi serbest bırakılır ve bir spektrofotometre18,19'dakifloresan izlenerek reaksiyon oranı doğrudan ölçülür. Bu tahlil son derece mantıklı, nispeten ucuz, hızlı ve büyük bileşik kütüphanelerin taranı için uygundur20,21. En büyük dezavantajı, test edilen bileşikler ile yanlış-pozitif vuruşlara yol açabilecek florofor arasındaki olası söndürmedir. Ancak, bu sorun AMC varlığında ek bir floresan ölçümü ile giderilebilir. Ayrıca, floroforun aynı dalga boyunda emisyon veya emilim gösteren bileşikler bu yöntemle değerlendirilemez18,20.

NS5 RdRp ile ilgili olarak, uzama aktivitesi, kendinden emişli bir 3'UTR-U30 şablonunun uzaması sırasında SYBR Green I'in floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edilir. Protokol, pico green ve SYTO 9 gibi farklı viral polimerazlar22 , 23 , 24 , 25,26için bileşikleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan intercalating boyaları ile testlerden uyarlanmıştır. Testte kendi kendine emişli biyotinilasyonlu bir şablon27 kullanmış olsak da, poliU gibi diğer şablonlar da kullanılabilir25. Bu yöntemin ana dezavantajı, floresan ile müdahale ederek veya dsRNA intercalation28'iazaltarak boya ile etkileşime giren yüksek sayıda yanlış-pozitif isabettir. Bu nedenle, isabet bileşiklerinin biyofizik yöntemleri gibi karşı testlerle veya dsRNA'daki SYBR™ Yeşil I floresanını bileşik29ile ve olmadan karşılaştırarak doğrulandırılması gerekir. Bununla birlikte, kolay uygulama, doğrudan ölçüm ve uygun fiyatlılık, orta / büyük ölçekli kampanyalarda uygulanması zor olan radyo etiketli veya bağlantılı tahlillere kıyasla, floresan tabanlı yöntemlerin HTS platformları olarak kullanılmasına kilit noktalardır27,30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanlar.

Acknowledgments

Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID hibesi 2013/07600-3 tarafından desteklendi. RSF'ye 2018/05130-3 ve ASG'ye 2016/19712-9 ve ASG'ye Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (hibe 88887.516153/2020-00) vermek. Sıtma Girişimleri için İlaç (MMV, www.mmv.org) ve İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimine (DNDi, www.dndi.org) destekleri, Pandemi Müdahale Kutusu'nun tasarımı ve bileşikleri tedarik ettikleri için minnettar bir şekilde teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 176
Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, R. S., Noske, G. D.,… More

Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter