利用磁力悬浮法对细胞密度和抗原特性进行定量分析

摘要

本文介绍了一种基于磁悬浮的方法，通过量化具有固定密度的捕获微珠悬浮高度的变化，特异性检测可溶性或膜结合抗原的存在。

摘要

所描述的方法基于磁力悬浮原理，可根据细胞和颗粒的密度及磁性特性实现分离。密度是识别细胞类型的重要特征，与其代谢速率、分化状态及活化状态直接相关。磁力悬浮技术可一步完成循环血细胞的分离、成像与表征，并基于其密度和磁性特性检测贫血、镰状细胞病以及循环肿瘤细胞。该方法还可通过使用分别包被捕获抗体和检测抗体的低密度与高密度微珠，用于检测溶液中存在的可溶性抗原。若溶液中存在目标抗原，其将连接这两类微珠 磁珠会形成新的珠-珠复合物，该复合物将在抗体包被的磁珠阵列之间悬浮。当溶液中目标抗原浓度升高时，形成的珠-珠复合物数量较抗原浓度较低时更多，从而实现对目标抗原的定量检测。与其他方法相比，磁悬浮技术具有样本预处理时间短、无需依赖传统读出方法的优势。所生成的图像可使用标准显微镜或移动设备（如智能手机或平板电脑）轻松捕获并进行分析。

引言

磁悬浮是一种仅基于细胞 类型^1,2,3、蛋白质^4,5和阿片类物质⁶的特定密度及顺磁特性对其进行分离、分析和鉴别的技术。细胞密度是每种细胞类型的独特内在属性，与其代谢速率和分化状态直接相关^{7,8,9,10,11,12,13,14}。在稳态条件下以及多种细胞过程中，对细胞密度的细微且短暂变化进行定量，可为研究细胞生理学和病理生理学提供无与伦比的洞察。细胞密度的变化与细胞分化^15,

方案

本研究中使用的实验方案已获得贝斯以色列女执事医疗中心机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 仪器设置

注意：成像悬浮细胞需要两个沿 z 轴磁化的稀土钕磁铁，将相同磁极相对放置以产生磁场。磁铁之间的距离可根据磁场强度和目标物密度进行调整。本实验中，磁铁之间留有 1 mm 的间隙，足以插入一根长 50 mm、横截面为 1×1 mm² 的方形玻璃毛细管。该装置采用 AutoCAD 设计并进行 3D 打印，设计文件可应要求提供。

1. 将显微镜侧放，确保完全水平。
   ​注意：由于磁体相对于聚光镜和物镜的位置关系，处于标准直立位置的显微镜无法直接用于成像悬浮物体。通过将显微镜侧放并保持完全水平，可克服这一限制，使聚光镜能够将光线聚焦到毛细管中，物镜能够对悬浮于磁体之间的细胞进行成像，同时满足科勒照明的要求。
2. 使用2至3个实验室升降台将显微镜支架支撑并调平于光学平台之上。
3. 为减少振动，使用橡胶减震脚垫支撑光学平台。
4. 移除原有载物台，替换为一个用于调节磁悬浮装置高度（y轴）的小型升降台，以及两个单轴平移台；其中一个用于调节焦距（z轴），另一个用于扫描毛细管。
5. 使用两个微型光学支柱将磁悬浮装置固定在实验室升降台上。

结果

磁悬浮技术根据物体的密度、磁特性、顺磁性溶液的浓度以及由两块强稀土磁铁产生的磁场强度，使不同密度的物体在不同的悬浮高度上聚焦。当两块磁铁上下堆叠放置时，只能通过将显微镜侧置的方式观察悬浮样品，同时保持科勒照明（图1）。通过调节顺磁性溶液的浓度，可轻松改变每种细胞类型的最终悬浮高度。图2展示了利用不同浓度的钆对比剂实现不同类型循环血细胞的分离。实验中使用了两种不同密度（1.05 和 1.2 g/mL）的微珠，以提供密度悬浮高度和尺寸参考。由于特定细胞类型的悬浮高度取决于其内在密度，磁悬浮技术提供了一种无需显著操作即可直接分离目标细胞的方法²⁴。本实验方案的主要目的是展示磁悬浮技术检测循环红细胞表面膜结合抗原（在此为Rh因子）存在的能力。在该实验中，低密度微珠分别包被IgG同型对照抗体或抗RhD抗体。随后，将Rh阴性供体血液与Rh阳性血液按1:1000的比例混合制备样品，并向血液样本中加入包被抗RhD抗体的微珠或包被IgG对照抗体的微珠，孵育10分钟。

讨论

密度梯度离心法目前是根据亚细胞组分的独特密度来分离它们的标准技术。然而，该方法需要使用专门的梯度介质以及离心设备。本文介绍的磁悬浮方法 能够在对细胞进行最少甚至无任何操作的情况下，对循环细胞的形态和功能特性进行详细研究，从而近乎实现对循环细胞的活体（in vivo）水平观察与分析。

然而，在使用磁悬浮技术时，有几个要点需要注意。首先，用于成像的显微镜必须专用于该方法，因为装置搭建过程耗时较长，需要对显微镜进行部分拆卸，并将其精确地调整至完全水平状态，同时确保光学系统与磁铁及毛细管精确对齐。其次，用于调节毛细玻璃管位置和焦距的实验室升降台（lab jack）以及平移平台，必须能够在三个轴向上实现精确的定位和自由移动。整个装置中最关键的对准步骤，是将磁悬浮装置安装在平移平台上，使得上下磁铁与重力矢量完全对齐，并且自身完全水平。任何偏离这些要求的情况 都会导致磁力与重力之间形成夹角，从而将细胞推向毛细管的某一侧，破坏悬浮过程，导致结果不可靠。

用于悬浮细胞的钆溶液的最佳浓度需根据细胞类型和实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物	Sigma Aldrich	M-2933	(MES)；活化缓冲液的组分
50×2.5×1 mm 磁铁，镍（Ni-Cu-Ni）镀层，N52 级，磁化方向沿 5 mm（0.197"）厚度	K&J Magnetics	定制	用于磁悬浮装置的磁铁
毛细管密封剂（Critoseal）	Leica Microsystems	267620	用于封闭毛细管两端
离心管滤器（Corning Costar Spin-X）	Sigma Aldrich	CLS8163	用于洗涤微珠
紧凑型实验室升降台	Thorlabs	LJ750	用于调节磁悬浮装置
不含钙、镁的 DPBS	Gibco	14190-144	用于微珠悬浮液的溶液
乙醇胺	Sigma Aldrich	E9508-100ML	微珠洗涤步骤中使用
荧光质膜染料（CellMask Green）	Invitrogen	C37608	用于染色 Rh+ 细胞
钆特醇注射液	ProHance	NDC 0270-1111-03	钆（Gd3+）；用于悬浮细胞的磁性溶液
HBSS++	Gibco	14025-092	用于样品制备的溶液
人 C5b,6 复合物	Complement Technology, Inc	A122	用于生成红细胞微囊泡（RBC EVs）
人 C7 蛋白	Complement Technology, Inc	A124	用于生成红细胞微囊泡（RBC EVs）
人 C8 蛋白	Complement Technology, Inc	A125	用于生成红细胞微囊泡（RBC EVs）
人 C9 蛋白	Complement Technology, Inc	A126	用于生成红细胞微囊泡（RBC EVs）
迷你系列立柱固定环	Thorlabs	MSR2	用于将磁悬浮装置固定在实验升降台上
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC)；用于抗体偶联反应
正常兔 IgG 对照	R&D Systems	AB-105-C	用作对照条件以包被微珠
磷酸盐缓冲液（10X 溶液，pH 7.4）	Boston Bioproducts	BM-220	偶联缓冲液组分，用于洗涤步骤
聚山梨酯 20（Tween 20）	Sigma Aldrich	P7949-500ML	活化缓冲液组分
聚苯乙烯羧基聚合物	Bangs Laboratories	PC06004	高密度微珠（1.05 g/mL），用于抗体偶联
兔抗 RhD 多克隆抗体	Invitrogen	PA5-112694	用于包被微珠以检测红细胞中的 Rh 因子
科研级显微镜	Olympus	Provis AX-70	用于安装磁悬浮装置并观察悬浮细胞
橡胶减震脚垫	Thorlabs	RDF1	用于支撑面包板平台
方形硼硅玻璃管	VitroTubes	8100-050	用于将样品加载至磁悬浮装置的毛细管
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	用于抗体偶联反应
平移台	Thorlabs	PT1	用于聚焦及扫描毛细管