使用磁悬浮定量细胞密度和抗原特性

Summary

本文描述了一种基于磁悬浮的方法，该方法可以通过量化具有固定密度的捕获微球悬浮高度的变化来特异性检测抗原的存在，无论是可溶的还是膜结合的。

Abstract

所描述的方法是基于磁悬浮原理开发的，磁悬浮原理根据其密度和磁性分离细胞和颗粒。密度是一种识别特性的细胞类型，与其代谢率、分化和活化状态直接相关。磁悬浮允许一步法成功分离，成像和表征循环血细胞，并根据密度和磁性检测贫血，镰状细胞病和循环肿瘤细胞。这种方法也适用于通过使用分别包被捕获和检测抗体的低密度和高密度微球组来检测溶液中存在的可溶性抗原。如果抗原存在于溶液中，它将桥接两组磁珠，产生新的磁珠复合物，该复合物将悬浮在抗体包被的磁珠行之间。与较低浓度的抗原相比，增加溶液中靶抗原的浓度将产生更多的珠状 - 珠状复合物，从而允许对靶抗原进行定量测量。磁悬浮比其他方法有利，因为它减少了样品制备时间并且缺乏对经典读出方法的依赖性。生成的图像可使用标准显微镜或移动设备（如智能手机或平板电脑）轻松捕获和分析。

Introduction

磁悬浮是一种技术，仅用于分离，分析和鉴定细胞类型^1，2，3，蛋白质^4，5和阿片类药物^6，仅基于其特异性密度和顺磁性。细胞密度是每种细胞类型独特的内在属性，直接关系到其代谢率和分化状态^{7、8、9、10、11、12、13、14。}量化稳态条件下和各种细胞过程中细胞密度的细微和瞬态变化，可以为人们提供对细胞生理学和病理生理学无与伦比的洞察力。细胞密度的变化与细胞分化^15、16、细胞周期进展^{9、17、18、19、}凋亡20、21、22、23和恶性转化24、25、26有关^。.因此，量化细胞密度的特定变化，可用于区分不同类型的细胞，以及区分经历各种活化过程的相同类型的细胞。这使得针对特定细胞亚群的实验成为可能，其中密度的动态变化作为细胞代谢改变的指标²⁷。由于已经确定细胞可以响应于不断变化的环境⁷而改变其密度，因此必须测量细胞的动力学与其密度的关系以充分理解它，而目前的方法可能无法提供^12。另一方面，磁悬浮允许对细胞及其性质进行动态评估²⁸。

电池是抗磁性的，这意味着它们没有永久的磁性偶极矩。然而，当暴露于外部磁场时，在电池中产生弱磁偶极矩，与外加磁场的方向相反。因此，如果细胞悬浮在顺磁性溶液中并暴露在强烈的垂直磁场中，它们将悬浮在远离磁源的位置并停止到一定高度，这主要取决于它们的个体密度。当满足以下两个标准时，可以将物体的抗磁性悬浮限制在不均匀磁场的最小值:1）粒子的磁化率必须小于周围介质的磁化率，以及2）磁力必须足够强以抵消粒子的浮力。通过将红细胞悬浮在磁性缓冲液中，并使用小的、廉价的、市售的永磁体产生强磁场梯度，可以满足这两个标准¹。磁性捕获粒子在沿重力方向的轴上的平衡位置由其密度（相对于缓冲区的密度）、磁化率（相对于缓冲区的磁化率）和所施加磁场的特征决定。由于溶液的密度和磁性在整个系统中是恒定的，因此细胞的固有密度特性将是决定细胞悬浮高度的主要因素，与密度较低的细胞相比，密度较大的细胞悬浮得更低。这种方法使用一组两个密度参考珠（1.05和1.2 g / mL），使我们能够使用精确的比例分析进行密度测量。改变磁性溶液的浓度允许人们分离不同的细胞群，例如红细胞和WBC，因为循环细胞的密度是细胞特异性的，从而无需分离方案或其他细胞操作。

生物学研究中使用的大多数检测方法依赖于将特定结合事件外推为易于量化的线性信号。这些读出方法通常很复杂，涉及专门的设备和专门的科学人员。本文描述了一种旨在检测在细胞或细胞外囊泡的质膜上发现的抗原或可溶于血浆的抗原的方法，使用一种或两种抗体包被的微球。这些珠子彼此之间以及被审问目标的密度必须不同。在任何给定的生物流体中靶抗原的存在被翻译成与检测珠结合的抗原阳性细胞悬浮高度的特定，可测量的变化。在可溶性抗原或细胞外囊泡的情况下，它们与捕获和检测微球结合，形成珠状 - 珠复合物而不是珠细胞复合物。悬浮高度的变化取决于磁珠细胞或磁珠-珠复合物的新密度。除了配合物悬浮高度的变化，这表明生物流体中存在抗原外，复合物的数量还取决于靶标的量，使得磁悬浮也成为抗原检测的定量方法^24。

Protocol

本研究中使用的实验方案已获得Beth Israel Deaconess医疗中心机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 仪器设置

注意:成像悬浮电池需要两个在z轴上磁化的稀土钕磁铁放置在彼此相对的同一极上以产生磁场。磁铁之间的距离可以根据磁场的强度和目标的密度进行定制。在这种情况下，磁体由1mm的空间隔开，足以插入50 mm长的1x1 mm方形玻璃毛细管。该设备使用AutoCAD设计进行3D打印，可根据要求提供。

1. 将显微镜放在其侧面，完全水平。
   注:由于磁体相对于聚光镜和物镜的位置，放置在标准直立位置的显微镜不能直接用于对悬浮物体进行成像。通过将显微镜侧放，完全水平，允许聚光镜将光线聚焦到毛细管中，并通过物镜对悬浮在磁体之间的细胞进行成像，同时保持科勒照明要求，从而绕过这一限制。
2. 使用 2 个或 3 个实验室插孔将支架固定在试验板上并调平。
3. 为了限制振动，请用橡胶阻尼脚支撑试验板桌。
4. 取下载物台，换上一个紧凑的实验室插孔，用于调节悬浮装置（y轴）的高度，以及两个单轴平移载物台;一个用于调整焦点（z轴），第二个用于扫描毛细管。
5. 使用两个迷你系列光学柱将磁悬浮装置连接到实验室插孔。

2. 抗体与羧基微粒/微珠的结合（由PolyAn的方案修改）

注意:只需要包被低密度微珠（1.05 g/mL）进行Rh（+）检测，但高密度和低密度微珠都涂覆用于检测细胞外囊泡。

1. 取出1mg当量的珠悬浮液，加入0.5mL活化缓冲液（50 mM MES（MW195.2，9.72mg，1 mL））pH 5.0和0.001%聚山梨醇酯-20中。
2. 在冰冷水中加入12μL新鲜制作的1.5 M EDC（MW 191.7，1 mL中0.28755g）和12μL0.3M Sulfo-NHS（MW 217.14，1 mL中的0.0651g）。
3. 将管子放在轨道振荡器上，在室温下剧烈摇动1小时，以激活磁珠上的羧基。
4. 1小时后，通过加入0.5mL偶联缓冲液（10x PBS，或0.1M磷酸pH 7-9）停止活化。
5. 通过以20，000×g离心10分钟来沉淀珠子，或者，如果珠子不能沉淀，则使用0.45μm离心管过滤器。吸出上清液或流出物。
6. 用1 mL 10x PBS洗涤珠子3次，如步骤2.5所示。
7. 计算每毫克微球25μg抗体，并将所需抗体与活化微球混合至10X PBS中的0.7-1.0mg / mL最终抗体浓度。
8. 将管子放在低速设置的管子摇臂上。在室温下轻轻滚动管过夜以进行耦合。
9. 重复步骤2.5，用1 mL 10x PBS洗涤磁珠两次。
10. 用0.5mL 1 M乙醇胺（98%储备= 16.2 M）在缓冲液pH 8.0中用0.02%聚山梨醇酯-20在室温下洗涤1小时，同时轻轻摇动。
11. 重复步骤2.5，并在1 mL DPBS中洗涤一次磁珠。微珠可以在4°C下储存在200μLDPBS中，直到需要。
    注意:协议可以在此处暂停。

3. 收集和制备用于Rh（+）检测的血液

1. 使用一键式采血装置，刺破Rh（+）供体的手指，将10μL血液收集到1mL DPBS中。
2. 用荧光质膜染色对Rh +细胞进行染色。可选地，将1μL荧光染料加入Rh +细胞的1mL悬浮液中（1:1000稀释）。
3. 用荧光染料在37°C下孵育细胞15分钟。
4. 通过以5，600×g旋转15秒来沉淀细胞，并使用1mL DPBS洗涤3次。重悬于 1 mL 含有钙和镁的 HBSS （HBSS++） 中。
5. 使用一键式采血装置，刺破Rh（-）供体的手指并收集2μL血液。
   注意:如果准备超过2种条件，请收集足够的血液以向每管中加入1μLRh（-）血液。
6. 准备必要的实验管:单独使用珠子，IgG对照，样品。
   1. 单独微球:加入 174 μL HBSS++、1 μL IgG 对照微珠、1 μL 高密度微珠 （1.2 g/mL） 和 24 μL 500 mM Gd³⁺ （60 mM）。
   2. IgG对照:加入172μL HBSS++，1μLIgG对照珠，1μL高密度微珠，1μLRh-血液，1μL染色Rh +血液悬浮液和24μL500mM Gd^{3 +。}
   3. 样品管加入172μL HBSS++，1μL抗RhD包被珠，1μL高密度微珠，1μLRh-血液，1μL染色Rh（+）血液悬浮液和24μL500mM Gd^{3 +。}
      注:将高密度微珠添加到Rh样品中以供参考。

4. PMN的分离用于细胞分离演示

1. 中性粒细胞的分离
   1. 将 40 mL 静脉血吸入含有 6 mL 柠檬酸钠/柠檬酸（0.15 M，pH 5.5）和 14 mL 6% 葡聚糖-70 的 60 mL 注射器中。
   2. 等待50分钟，让血液沉淀下来。
   3. 通过将顶部的18 mL通过血液收集管推入50 mL管中，将buffy涂层细胞缓慢分层在20 mL Ficoll-Paque的顶部，避免被沉淀的红细胞污染。建议使用新鲜采血装置，以尽量减少原始采血管中残留红细胞的污染。
   4. 通过在3，000×g下离心20分钟沉淀buffy涂层细胞。 嗜中性粒细胞和污染的红细胞将在管的底部沉淀。PBMC将在Ficoll-Paque的顶部形成一个白色层。
   5. 将嗜中性粒细胞转移到新的50 mL管中。
   6. 通过将中性粒细胞与20 mL 0.2%冷NaCl溶液孵育25秒，然后另外20 mL的1.6%NaCl来裂解任何残留的红细胞。NaCl的最终协同作用应为0.9%（等渗）。
   7. 将悬浮液在3，000×g下离心10分钟。
   8. 除去上清液并将嗜中性粒细胞重悬至所需浓度。
2. 淋巴细胞的分离
   1. 将PBMC以RPMI与5%热灭活血清一起接种在6孔培养板中。
   2. 将板在37°C下孵育1小时。 单核细胞会粘附在板块上，淋巴细胞会自由漂浮。
   3. 除去含有淋巴细胞的缓冲液，并用RPMI洗涤两次。
   4. 以所需浓度重悬淋巴细胞。
3. 标记红细胞、PMN 和淋巴细胞。
   1. 用不同的荧光染料标记每种细胞类型。确保每种染料在不同的通道中发出荧光。按照制造商对每种所选染料的说明进行操作。

5. 通过补体激活生成红细胞细胞外囊泡

1. 使用EDTA管通过静脉穿刺获得全血。
2. 将血液通过白细胞过滤器，然后以500×g离心3次，每次10分钟以分离红细胞。使用 HBSS++ 作为洗涤缓冲液。
3. 在1.5 mL管中等分试样100μL填充的红细胞，并通过添加HBSS ++将体积组成1 mL。
4. 将C5b，6加入HBSS++中的0.18μg/mL终浓度，然后涡旋。
5. 在室温下放入慢速摇摇杯15分钟。
6. 加入C7蛋白至终浓度为0.2μg/mL。轻轻倒置管子几次，搅拌均匀。不要从这一点开始漩涡。
7. 将管子放在室温下以低速设置的管式振动器上5分钟。
8. 将C8蛋白加入至终浓度为0.2μg/mL，C9蛋白加入至0.45μg/mL。通过轻轻倒置管子几次来混合。
9. 在37°C孵育30分钟。
10. 将管以10，000×g离心10分钟。
11. 将含EV的上清液收集到新管中。不要将上清液移得太靠近细胞沉淀。

6. 分析磁悬浮装置上的细胞

1. 根据制造商说明执行仪器启动。
2. 将50μL样品倒入毛细管中，直到管子充满。用毛细管密封剂密封毛细管的末端，确保没有气泡。
3. 将毛细管装入顶部和底部磁铁之间的支架中。调整舞台和焦点以获得最佳观看效果。
   注意:细胞/磁珠可能需要5-20分钟才能达到其磁平衡位置，具体取决于它们的密度和Gd^{3 +}的浓度。Gd³⁺的浓度越高，时间越短。

Results

磁悬浮根据物体的密度、其磁性特征、顺磁性溶液的浓度以及两个强大的稀土磁铁产生的磁场强度，将不同密度的物体聚焦在不同的悬浮高度。由于两块磁铁彼此叠加，因此只能使用侧翻的显微镜在保持科勒照明的同时观察悬浮样品（图1）。每种细胞类型达到的最终悬浮高度可以通过改变顺磁性溶液的浓度来轻松修改。图2说明了通过使用不同浓度的钆分离不同的循环血细胞。使用两种不同密度（1.05和1.2 g/mL）的磁珠类型来提供密度悬浮高度和尺寸参考。由于给定细胞类型的悬浮高度取决于其内在密度，因此磁悬浮提供了一种直接分离目标细胞的方法，而无需任何显着的操作²⁴。该协议的主要目的是证明磁悬浮检测循环红细胞上膜结合抗原（在这种情况下为Rh因子）的存在的能力。在该实验中，低密度微球涂有IgG对照抗体或抗RhD。然后通过以1:1000的比例将来自Rh（-）供体的血液与来自Rh（+）的血液一起喷射来制备样品。将抗RhD（+）包被的珠子或对照IgG包被的珠子加入血液样品中并孵育10分钟。

Discussion

梯度离心是目前根据其独特密度分离亚细胞组分的标准技术。然而，这种方法需要使用专门的梯度介质以及离心机设备。这里介绍的磁悬浮方法允许详细研究循环细胞的形态学和功能特性，对细胞进行最小的操作（如果有的话），提供对循环细胞 的近体内 访问。

但是，在使用磁悬浮时，有几个点值得一提。首先，用于成像的显微镜必须专用于这种方法，因为设置非常耗时，并且需要将显微镜部分拆卸，与光学元件精确对齐，与磁铁和毛细管精确对齐。其次，实验室千斤顶和用于调整毛细管玻璃运动的平移级和焦点需要在三个轴上的每个轴上进行精确定位和自由移动。整个设置中最关键的对齐可能是在平移阶段安装磁悬浮装置，以便顶部和底部磁体与重力矢量完全对齐并且完全水平。任何偏离这些要求的行为都会在磁力和重力之间产生一个角度，这将推动细胞朝向毛细管的两侧，破坏悬浮过程，并使结果不可靠。

用于悬浮细胞的钆溶液的最佳浓度需要根据细胞类型和实验目标进行调整。钆溶液浓度的变化将显着改变被分析细胞的悬浮高度，因此需要从一组实验到另一组实验保持恒定。如果浓度太低，根据靶细胞的密度，它们...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-（N-吗啉代）乙磺酸水合	物 Sigma Aldrich	M-2933	（MES）;活化缓冲液组
50x2.5x1 mm 磁铁，镀镍 （Ni-Cu-Ni），N52 级，磁化厚度为 5 mm （0.197"）	K&J Magnetics	用于	磁悬浮装置的定制磁铁
毛细管密封剂 （Critoseal）	Leica Microsystems	267620	用于盖住毛细管末端
离心管过滤器（康宁 Costar Spin-X）	Sigma Aldrich	CLS8163	用于清洗磁珠
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	用于调节磁悬浮装置
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190-144	微珠悬浮液溶液
乙醇胺	Sigma Aldrich	E9508-100ML	用于微珠洗涤步骤
荧光质膜染色剂（CellMask Green）	Invitrogen	C37608	用于 Rh+ 细胞染色
Gadoteridol 注射液	ProHance	NDC 0270-1111-03	钆 （Gd3+）;用于悬浮细胞的磁性溶液
HBSS++	Gibco	14025-092	用于样品制备的溶液
人 C5b，6 复合物	补体技术公司	A122	用于生成红细胞 Evs
人 C7 蛋白	补体技术公司	A124	用于生成红细胞 Evs
人 C8 蛋白	补体技术公司	A125	用于生成红细胞Evs
Human C9 protein	Complement Technology， Inc	A126	用于生成红细胞 Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	用于将磁悬浮装置固定到实验室千斤顶
N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	E1769-10G	（EDC）;用于抗体偶联反应
正常兔 IgG 对照	研发&D Systems	AB-105-C	作为对照条件用于包被珠
磷酸盐缓冲盐水（10X 溶液，pH 7.4）	波士顿生物制品	BM-220	偶联缓冲液组分，用于洗涤步骤
聚山梨酯 20 （吐温 20）	Sigma Aldrich	P7949-500ML	活化缓冲液组分
聚苯乙烯羧基聚合物	Bangs Laboratories	PC06004	最高密度微珠 （1.05 g/mL），用于抗体偶联
兔 RhD 多克隆抗体	Invitrogen	PA5-112694	用于包被微珠，以检测红细胞中的 Rh 因子
研究级显微镜	Olympus	Provis AX-70	显微镜用于安装磁悬浮装置和观察悬浮细胞
橡胶阻尼脚	Thorlabs	RDF1	用于支撑面包板台
方形 Boro 管	VitroTubes	8100-050	用于将样品加载到磁悬浮
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	用于抗体偶联反应
的转化阶段	Thorlabs	PT1	用于聚焦和扫描毛细管