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离体实体瘤匀浆线粒体功能的分析测定

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DOI：

10.3791/62875

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2021年8月6日

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1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

我们开发了一种实用的实验方案和分析方法，用于评估新鲜肿瘤匀浆中线粒体的氧化磷酸化和电子传递能力。该方案可轻松调整，用于检测多种与肿瘤发生、发展及治疗反应相关的线粒体功能。

摘要

线粒体通过能量产生、活性氧调控以及大分子合成，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着关键作用。线粒体在遗传和功能上对肿瘤微环境的适应性改变，驱动了肿瘤的增殖和转移潜能。DNA和RNA测序技术的出现，消除了评估肿瘤发生相关遗传介质的关键障碍。然而迄今为止，用于评估肿瘤线粒体功能的方法学仍不完善，且需要较高的技术熟练度，限制了其可行性，最终削弱了在实验和临床环境中的诊断与预后价值。本文中，我们 介绍一种简单且快速的方法，利用高分辨率呼吸测定法，对新鲜切除的实体瘤匀浆样本中的氧化磷酸化（OXPHOS）速率和电子传递（ET）能力进行定量分析。该方案可跨物种和肿瘤类型重复应用，并可调整用于评估多种线粒体电子传递通路。通过本方案，我们证明了携带腔面B型乳腺癌的小鼠表现出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖性呼吸功能缺陷，并依赖于琥珀酸通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP）。

引言

所有细胞都因其需要产生和消耗三磷酸腺苷（ATP）——这一分子能量货币——而紧密关联。当细胞发生突变并导致肿瘤形成时，线粒体通过能量生成方式的多样化来确保细胞存活，这种代谢特征通常在表型上可与非癌组织相区分1,2,3。因此，迫切需要快速而深入地分析线粒体呼吸功能，以促进 肿瘤类型分类、癌症发生、进展及治疗反应的评估。

切除组织标本的呼吸功能无法完整评估，因为氧化磷酸化（OXPHOS）的主要底物不可穿透细胞膜。为克服这一限制，可通过线粒体分离、化学透化或机械匀浆的方法来制备线粒体。长期以来，线粒体分离被认为是评估呼吸功能的金标准。然而，该方法需要大量组织，耗时较长，得率较低，并可能对某些线粒体亚群产生选择性偏差4。透化法包括机械分离，并将组织切片或肌纤维束暴露于温和的去污剂中，以选择性降解质膜5。透化法常用于骨骼肌和心肌等横纹肌组织，因为这些组织中的单个肌纤维束易于分离。与分离法相比，透化法可获得处于天然细胞环境和物理形态下的更多线粒体5。透化法已成功应用于肿瘤6,7和胎盘8等其他组织；然而，由于解剖操作的一致性以及需克服扩散限制所带来的氧气需求，透化纤维制备的可重复性可能较差9。此外，在细胞密度高且纤维化程度高的某些肿瘤类型中，透化纤维可能不适用。组织匀浆通过机械破坏质膜而获得，在线粒体得率和完整性方面与透化纤维相似10。组织匀浆还能最大限度减少氧气扩散的限制，并可通过优化机械力广泛应用于多种组织类型11,12。

本文概述了一种简单且快速的方法，用于定量分析新鲜切除的实体瘤匀浆中氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递（ET）的速率。该方案最适合使用Oxygraph-2k（O2k）高分辨率呼吸测量仪评估新鲜组织，操作前需掌握仪器的设置与校准知识，但也可适配于任何类型的克拉克电极、Seahorse分析仪或酶标仪。该方法可在不同物种和肿瘤类型中重复应用，并可调整用于评估多种线粒体电子传递通路。

方案

所有涉及动物的实验和操作均经彭宁顿生物医学研究中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. 试剂准备。

  1. 制备EO771细胞培养基，添加10 mM HEPES、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（100 U/mL）和0.2%两性霉素B。
  2. 在1000 mL玻璃烧杯中配制1 L活检保存（BIOPS）溶液。
    1. 加入 3.180 g Na2ATP（终浓度 5.77 mM）。
    2. 加入 1.334 g MgCl₂2·6H2O（终浓度6.56 mM）
    3. 加入2.502 g 牛磺酸（终浓度20 mM）。
    4. 加入3.827 g Na2磷酸肌酸（终浓度 15 mM）。
    5. 加入1.362 g咪唑（终浓度20 mM）。
    6. 加入0.077 g二硫苏糖醇（终浓度0.5 mM）。
    7. 加入9.76 g MES水合物（终浓度50 mM）。
    8. 加入800 mL H2在30 °C下使用磁力搅拌器混合各组分。
    9. 加入72.3 mL的100 mM K2EGTA（终浓度 7.23 mM）。
      1. 将 7.608 g EGTA 和 2.3 g KOH 溶于 100 mL H2O.
      2. 用 5 M KOH 调节 pH 至 7.0，并用 H₂O 定容至 200 mL2O.
    10. 加入 27.7 mL 的 100 mM CaK2EGTA（终浓度 2.77 mM）。
      1. 将7.608 g EGTA溶于200 mL H2O并加热至80 °C（终浓度100 mM）。
      2. 溶解 2.002 g CaCO₃3 在200 mL热的100 mM EGTA溶液中。
      3. 在持续搅拌的同时，加入 2.3 g KOH，并将 pH 调至 7.0。
    11. 用 5 M KOH 将 pH 调至 23 °C 下 6.75（0 °C 下为 pH 7.1）。用 H₂O 定容至 980 mL2O，并混匀溶液。再次检测pH值，必要时进行调整，然后加水定容至1000 mL。
    12. 将BIOPS分装至锥形管（15 mL或50 mL）中，于-20 °C保存备用。使用前仅解冻一次。
  3. 在1000 mL玻璃烧杯中配制1 L线粒体呼吸介质（MiR05）。
    1. 加入0.190 g EGTA（终浓度0.5 mM）。
    2. 加入 0.610 g MgCl₂2·6H2O（终浓度 3 mM）。
    3. 加入2.502 g 牛磺酸（终浓度20 mM）。
    4. 加入1.361 g KH₂PO₄2PO4 （终浓度 10 mM）
    5. 加入4.77 g HEPES（终浓度20 mM）。
    6. 加入 37.65 g D-蔗糖（终浓度 110 mM）。
    7. 加入800 mL H2在30 °C下使用磁力搅拌器混合各组分。
    8. 加入 120 mL 的 0.5 M 葡糖二酸（终浓度为 60 mM）。
      1. 将35.83 g乳糖酸溶解于100 mL H2O.
      2. 用 5 M KOH 调节 pH 至 7.0，并用 H₂O 定容至 200 mL2O.
    9. 混合溶液，并用 5 M KOH 调节 pH 至 7.1。
    10. 称取1 g基本不含脂肪酸的BSA（终浓度为1 g/L）于50 mL锥形管中。加入40 mL步骤9中的pH 7.1溶液，轻轻倒置混匀，避免产生泡沫。将溶解后的BSA转移至步骤9中剩余的pH 7.1溶液中，轻轻持续搅拌。再次检测pH值，必要时进行调节，并用H₂O定容至终体积1000 mL。2O.
    11. 将 MiR05 介质分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存至使用。仅在使用前解冻一次。
  4. 准备底物、解偶联剂和抑制剂。
    1. 制备 0.8 M 苹果酸：将 536.4 mg L-苹果酸溶解于 4 mL H2O. 用 5 M KOH 中和至 pH 7，并用 H₂O 定容至 5 mL2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    2. 制备1 M丙酮酸盐：将550 mg丙酮酸钠溶解于4 mL H2O. 用 5 M KOH 中和至 pH 7，并用 H₂O 定容至 5 mL2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    3. 配制 0.5 M ADP（腺苷-5′-二磷酸）：将 1.068 g ADP 钠盐溶于 4 mL H₂O 中2O. 用 5 M KOH 中和至 pH 7，并用 H₂O 定容至 5 mL2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    4. 制备2 M谷氨酸：将3.7426 g一水合L-谷氨酸溶于8 mL H2O. 用5 M KOH中和至pH 7，并用H₂O定容至10 mL2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    5. 制备 4 mM 细胞色素 c：将50 mg细胞色素 c 在 1 mL 的 H2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    6. 制备 1 M 丁二酸盐：将 2.701 g 丁二酸钠六水合物溶解于 8 mL H₂O 中2O. 用1 N HCl中和至pH 7，并用H₂O定容至10 mL2O. 分装后于 -20 °C 保存。
    7. 制备1 mM FCCP（羰基氰化-4-(三氟甲氧基)苯腙）：将2.54 mg FCCP溶解于10 mL纯乙醇中，分装成若干份后于-20 °C保存。
    8. 配制150 µM 鱼藤酮：取3.94 mg鱼藤酮溶于10 mL纯乙醇中，配制成1 mM储备液，涡旋至完全溶解。取225 µL 1 mM鱼藤酮储备液，加入1.275 mL纯乙醇稀释，得到1.5 mL 150 µM鱼藤酮溶液。避光分装后，于-20 °C保存。
    9. 配制125 µM抗霉素A：将11 mg抗霉素A溶于4 mL纯乙醇中，配制成5 mM抗霉素A储备液。取25 µL 5 mM抗霉素A储备液，加入975 µL纯乙醇稀释，得到1 mL 0.125 mM（即125 µM）抗霉素A溶液。分装成小份后，于-20 °C保存。
    10. 制备 0.8 M 抗坏血酸钠溶液：将 1.584 g 抗坏血酸钠盐溶解于 8 mL H₂O 中2O. 用抗坏血酸调节pH至6，再用H2O定容至10 mL2O. 避光，分装后于 -20 °C 保存。
    11. 配制 0.2 M TMPD（四甲基对苯二胺）：将 32.85 mg TMPD 溶于 987.5 µL DMSO 中，加入 12.5 µL 0.8 M 抗坏血酸（终浓度为 10 mM 抗坏血酸）。避光保存，分装成小份，于 -20 °C 储存。
    12. 制备 4 M 叠氮化钠：将 2.6 g 叠氮化钠溶解于 10 mL H₂O 中2O. 分装后于 -20 °C 保存。

2. 肿瘤生长

  1. 在 RPMI 1640 培养基中培养 EO771 细胞，并将细胞维持于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中2.
  2. 单笼饲养的4周龄雌性C57BL/6J小鼠，置于21–22 °C、12小时光照:12小时黑暗循环环境中，为小鼠提供 随意摄取 食物和水的获取
  3. 小鼠达到10周龄后，准备细胞和小鼠以进行癌细胞移植。
    1. 用胰蛋白酶消化细胞，用生长培养基终止胰蛋白酶反应，并在500 x g条件下离心细胞 g 室温孵育5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬并合并（根据需要）于培养基中。使用台盼蓝计数活细胞，并制备1 × 10⁶个/mL的细胞稀释液。6 在总体积为60 µL的1:1:1培养基/基底膜基质/PBS溶液中重悬细胞。加入基底膜基质后，充分混匀，并将细胞悬液置于冰上。用60 µL细胞悬液填充注射器，并置于冰上。操作过程需高效，于制备后1.5小时内将细胞注射至小鼠体内。
    2. 通过异氟烷吸入麻醉小鼠（诱导浓度3%-5%，维持浓度1%-3%）。剃除右侧第4肋间区域的毛发th 和 5th 腹股沟乳腺。将EO771细胞悬液原位注射至麻醉小鼠体内。
  4. 使用电子卡尺每周两次监测并测量肿瘤生长，持续4周。在解剖时，切除肿瘤，称重，然后立即将肿瘤（或至少60 mg的肿瘤组织样本）放入10 mL预冷的BIOPS溶液中。将试管置于湿冰上保存。

3. 仪器设置与校准

  1. 将 MiR05 培养基置于 37 °C 水浴中预热。
  2. 打开 Oroboros O2k 系统，启动 DATLAB 软件，输入或选择 用户。点击 连接至 O2k。检查 O2k 配置，确保正确的仪器被标记为 Power-O2k，且每个腔室对应正确的氧传感器；点击 确定。当 O2k 控制窗口打开后，在“系统”选项卡下，将模块温度设置为 37 °C，两个腔室的搅拌速度均设为 750 rpm，数据记录间隔设为 2.0 s。勾选两个腔室的“搅拌器电源”和“腔室照明”选项。在“氧气 O2”选项卡中，将传感器增益设为 1 V/µA（较老型号仪器可能需要调整增益），极化电压设为 800 mV，然后点击 连接至 O2k。当新的实验文件打开后，命名文件并点击 保存。实验激活后，将弹出实验方案选择窗口；点击 取消 以运行自定义 SUIT（底物-解偶联剂-抑制剂滴定）方案。
  3. 在选择实验方案后，将弹出样本窗口，根据实际情况填写实验代码、样本类型、队列、样本代码、样本编号和子样本编号。将单位设为 mg，并输入每毫升肿瘤匀浆的浓度（每腔室用量将自动填充）。确保所选培养基为 MiR05，腔室体积为 2.00 mL。在底部框中按需添加备注，然后点击 确定。
  4. 取下塞子，吸除腔室中的 70% 乙醇。切勿靠近腔室内侧暴露的膜进行抽吸。用纯水冲洗四次，并向腔室中加入 2.25 mL MiR05 培养基。
  5. 传感器测试：点击 F9 暂时关闭搅拌器 30 秒。当搅拌棒重新启动后，确保每个腔室的 O2 斜率呈单指数快速上升。若腔室未通过传感器测试，检查电路连接，并在有盐结晶积累时进行清洁；重复测试。若传感器持续无法通过测试，应拔下极谱氧传感器（POS）连接器以检查膜。如发现膜有可见损伤、严重氧化或大量气泡积聚，应立即停止实验操作，并进行仪器维护。
  6. 氧气校准：执行氧气校准以获得准确的呼吸测量结果。
    1. 以旋转方式缓慢将塞子插入至其体积校准位置。通过注射毛细管吸除从塞子凹槽中挤出的多余培养基。再次以旋转方式轻轻提起塞子，刚好能牢固安装塞子-垫片工具，使液相上方留有气体空间，用于最终空气平衡（30–45 分钟）。
    2. 利用此期间达到的稳态对氧传感器进行校准，以获得准确的呼吸测量值。O2 负斜率（氧气负斜率）应为 0 ± 2 pmol/s·mL。若该值高于 2 pmol/s·mL，需清洁腔室并更换为 freshly thawed MiR05 培养基。若斜率不稳定，应进行仪器维护。
    3. 达到稳态后，选中 O2 浓度曲线，按住 Shift 键并用鼠标左键拖动，高亮曲线的稳定区域。选定区域后，点击 F5，使用下拉箭头选择“空气校准”标记，点击 校准 并复制到剪贴板。
  7. 仪器背景校准（可选）
    1. 完成空气校准后，确保液相上方无气体空间，以进行通量背景平衡（约 15 分钟），并完全关闭腔室。
      注：此期间达到的稳态速率代表仪器背景，可从最终数据中扣除以提高分析精度。O2 负斜率初始会略有上升，随后在 ± 2 至 4 pmol/s·mL 范围内达到平台期。
    2. 若该值偏高（>6 pmol/s·mL），可能存在生物污染。此时应清洁腔室并更换为 freshly thawed MiR05 培养基。待达到稳态后，选中 O2 负斜率曲线，按住 Shift 键并用鼠标左键拖动，高亮曲线的稳定区域。
    3. 选定区域后，点击 F5，勾选 基线校正框，使用下拉箭头选择“基线”标记，然后点击 确定。

4. 肿瘤匀浆制备

  1. 将一个含有 1 mL MiR05 缓冲液和紧密贴合的玻璃研杵的玻璃匀浆器置于湿冰上。
  2. 在实验进行时，将组织置于冰浴的培养皿中的 1 mL BIOPS 缓冲液中。
  3. 清洗并解剖组织以最大程度获取可溶性材料，避免坏死区域，并去除边缘肿瘤组织。在解剖显微镜下，使用手术刀和外科镊子去除毛发、坏死组织、周围结缔组织和血管组织以及邻近脂肪（如适用）。解剖过程中务必保持肿瘤组织始终浸没在冰浴的 BIOPS 缓冲液中。
  4. 将肿瘤切成小块（每块约 5–10 mg），并将剩余的肿瘤组织块放回盛有 10 mL 冰浴 BIOPS 缓冲液的容器中。如需额外制备，可后续使用该组织。
    注意：以下步骤应迅速完成，以尽量减少样本未完全浸没在 BIOPS 缓冲液中的时间。一旦样本被转移至 MiR05 缓冲液中，时间至关重要。应尽快小心地将制备好的匀浆液转移至校准过的检测室中。
  5. 用滤纸小心吸干组织片段，将其放置在已去皮重的小型塑料称量舟中，记录初始湿重。将未使用的组织片段放回盛有 10 mL BIOPS 缓冲液的锥形管中以继续保存。
  6. 将组织片段浸入含有 MiR05 缓冲液的冰浴匀浆器中，并记录称量舟上剩余的重量（如适用）。
  7. 使用玻璃研杵（间隙范围 0.09–0.16 mm），通过完成 5–7 次上下移动轻柔地破碎肿瘤组织。每次移动过程中，向下推动研杵时顺时针-逆时针旋转 3 次，向上拉回时再旋转 3 次。每次移动之间应让组织沉降至匀浆器底部，但避免将研杵完全提出液面，以防产生泡沫。
    注意：最终匀浆液应呈浑浊状，且固体组织残留极少。
  8. 将匀浆液倒入 15 mL 锥形管中，并置于冰上。
  9. 用移液器吸取 1–3 mL 新鲜的 MiR05 缓冲液冲洗研杵及匀浆器，以收集残留的匀浆液。将冲洗液倒入含有匀浆液的锥形管中。重复冲洗研杵和匀浆器 2–3 次，以确保匀浆液完全转移。注意目标浓度和所需体积，避免在冲洗过程中过度稀释样本。
  10. 为准确计算组织匀浆液浓度，需仔细检查匀浆器和匀浆液中是否存在未被匀浆的残留物（如结缔组织）。
    1. 对于无法用镊子触及的匀浆器内未匀浆材料，向匀浆器中加入 MiR05 缓冲液，用移液器吸取液体（包括组织），转移至培养皿中。
    2. 对于匀浆液中未匀浆的材料（通常以较大块状沉积在锥形管底部），用移液器吸取大块残留物，并将其置于锥形管盖内侧。
    3. 用镊子从培养皿或锥形管盖上取下组织，并在滤纸上吸干。将锥形管盖内残留的匀浆液倒回锥形管中，盖紧后轻轻颠倒混匀。
    4. 重新检查匀浆器和匀浆液中是否仍有未匀浆材料，必要时重复步骤 4.10.1–4.10.3 以彻底清除残留物。
  11. 称量并记录从匀浆器中回收的未匀浆材料的质量。检查匀浆制备过程中是否有明显完整的组织被转移。去除未匀浆的组织块，并根据需要进行称重。
  12. 从初始湿重中减去从称量舟、匀浆器及匀浆液中回收的组织重量（如需要），以计算最终样本重量。
  13. 根据最终样本重量，加入适量 MiR05 缓冲液，使匀浆液达到所需浓度（有关优化实验的详细信息，请参见步骤 5）。
  14. 匀浆液称重并制备完成后，应尽快进行检测。在转移至仪器前，样本应始终保存在湿冰上。

5. 底物、解偶联剂、抑制剂滴定方案（SUIT）

  1. 仪器校准完成且样品制备好后，以旋转动作取下塞子，并从腔室中吸出 MiR05（避免触及腔室内暴露的膜）。充分混匀匀浆液，然后向腔室中加入 2.25 mL 匀浆液。若 将一份匀浆液加入多个腔室，应一边混匀匀浆液一边每次用移液器向每个腔室加入 1 mL，以确保组织分布均匀。点击 F4 为事件命名并打上时间戳，然后点击 OK。
  2. 使用钝头 18 G 针头，从配有减压阀和气体导管的氧气瓶中抽取氧气，注入 50 mL 注射器内。将腔室过饱和充氧至约 500 µM 氧气浓度。为此，直接将氧气注入腔室中。先松松地插入塞子，待氧气浓度达到约 480 µM 时再关闭。以旋转动作缓慢旋紧塞子，使呼吸状态平衡约 15–20 分钟。如有必要，用 MiR05 填充塞子中央的毛细管。
  3. 测定 N-连接和 NS-连接的 OXPHOS 与 ET（电子传递态）能力以及 CIV（复合体 IV）活性：使用专用微量注射器将底物、解偶联剂和抑制剂注入完全封闭的腔室中。每次注射时点击 F4，为每个腔室的事件实时命名并打上时间戳。在整个实验过程中，根据需要选择 F6 调整 O2 浓度和 O2 斜率负向刻度。每次注射后，用水清洗注射器 3 次（适用于水溶性化合物）或用 70% 乙醇清洗 3 次（适用于溶于乙醇或 DMSO 的化合物）。
    注：N-连接：由特定 NADH 生成底物组合所支持的 O2 流；NS-连接：由特定 NADH 生成底物组合与琥珀酸共同作用所支持的 O2 流。
    1. 加入 5 µL 的 0.8 M 苹果酸（终浓度为 2 mM），并立即进行下一次注射。用水清洗注射器 3 次。
    2. 立即加入 5 µL 的 1 M 丙酮酸（终浓度为 2.5 mM），等待呼吸稳定。用水清洗注射器 3 次。
    3. 加入 10 µL 的 0.5 M ADP（终浓度为 2.5 mM），等待 ADP 反应稳定。用水清洗注射器 3 次。
      注：可能需要额外添加 ADP（终浓度 2.5–10 mM），以确保腺苷酸浓度不会限制呼吸通量。
    4. 加入 5 µL 的 2 M 谷氨酸（终浓度为 5 mM），等待呼吸稳定。用水清洗注射器 3 次。
    5. 加入 5 µL 的 4 mM 细胞色素 c（终浓度为 10 µM），等待呼吸稳定。用水清洗注射器 3 次。
    6. 加入 20 µL 的 1 M 琥珀酸（终浓度为 10 mM），等待呼吸稳定。用水清洗注射器 3 次。
    7. 逐次滴加 0.5–1 µL 的 1 mM FCCP（终浓度为 2–20 µM），每次注射后等待呼吸稳定，直至呼吸不再进一步增加。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    8. 加入 2 µL 的 150 µM 鱼藤酮（终浓度为 150 nM–2 µM），等待呼吸稳定。再加入 1 µL 鱼藤酮以确保无进一步抑制。若呼吸下降，则继续追加注射直至呼吸不再下降。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    9. 加入 2 µL 的 125 µM 抗霉素 A（终浓度为 125 nM–5 µM），等待呼吸稳定。再加入 1 µL 抗霉素 A 以确保无进一步抑制。若呼吸下降，则继续追加注射直至呼吸不再下降。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    10. 检查腔室中的氧浓度；若浓度低于 125 µM，应重新充入空气或轻微过饱和充氧，以确保氧气不限制呼吸通量。加入 5 µL 的 0.8 M 抗坏血酸（终浓度为 2 mM）。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    11. 立即加入 10 µL 的 0.2 M TMPD（终浓度为 1 mM），等待呼吸缓慢上升。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    12. 当抗坏血酸/TMPD 的呼吸通量达到平台期时，立即加入 25 µL 的 4 M 叠氮化钠（终浓度为 50 mM）。用 70% 乙醇清洗注射器 3 次。
    13. 结束实验——点击 文件、保存并断开连接。继续按照步骤 9.2–9.3 清洗腔室和注射器。

6. ADP 敏感性实验方案

  1. 仪器校准并准备好样品后，以旋转方式取下塞子，从腔室中吸出MiR05（避免接触腔室内侧暴露的膜）。充分混匀匀浆液，向每个腔室中加入2.25 mL匀浆液。若需将同一匀浆液加入多个腔室，应边混合匀浆液边每次移取1 mL加入各腔室，以确保组织分布均匀。点击F4为事件命名并添加时间戳，然后点击OK。
  2. 插入塞子，以旋转方式缓慢关闭腔室，使呼吸状态达到平衡（约15–20分钟）。如有需要，向塞子中央毛细管中加入MiR05。
  3. 琥珀酸盐连接的线粒体ADP敏感性分析测定：每次注射时点击F4，为各腔室的事件实时命名并添加时间戳。在整个实验过程中，根据需要选择F6调整O2浓度及O2斜率负向刻度。
    1. 加入2 µL 150 µM鱼藤酮（终浓度为150 nM）。
    2. 立即加入20 µL 1 M琥珀酸盐（终浓度为10 mM），等待呼吸速率稳定。
    3. 通过逐步添加未达饱和浓度的ADP进行滴定，直至达到最大反应速率（VMAX；终浓度为2.5–10 mM）。
      ​注意：由于ADP浓度变化较小，注射后反应速率可能出现平台期，此时应在每次平台期后提高注射浓度，并继续滴定，直至即使ADP注射浓度成倍增加，呼吸速率也不再上升为止。

7. 推荐的优化实验

  1. 确定实验方案的最佳匀浆浓度和氧气浓度。
    1. 在多种组织浓度下（例如，30 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL 和/或 0.5 mg/mL）执行 SUIT 方案（步骤 5.1–5.3）。
    2. 选择一个能够在限制复氧频率（不超过 1–2 次）的同时使呼吸通量最大化的浓度。如果需要更频繁地复氧，则降低匀浆浓度。
  2. 确定匀浆器操作的最佳冲程次数。
    1. 在不同匀浆程度下（例如，5 次冲程、10 次冲程、15 次冲程、20 次冲程）执行 SUIT 方案（步骤 5.1–5.3）。
    2. 由于目前文献中尚无足够数据来确定肿瘤匀浆制备过程中细胞色素 c 增加的阈值百分比，因此应选择细胞色素 c 反应有限但由目标底物驱动的呼吸作用充分的样品制备条件。
  3. 确定实现定量且可重复的呼吸通量所需的最佳底物、ADP、解偶联剂和抑制剂浓度。
    1. 在选定的组织浓度（步骤 7.1）下执行 SUIT 方案（步骤 5.1–5.3.9）。对每种底物、解偶联剂、抑制剂和 ADP 进行滴定，直至不再观察到进一步反应。在独立实验中使用叠氮化钠滴定抑制效果。
      1. 加入 5 µL 的 0.8 M 苹果酸（终浓度为 2 mM），并立即进行下一次加样。
      2. 以每次 1 µL 的增量加入 1 M 丙酮酸，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      3. 以每次 2 µL 的增量加入 0.5 M ADP，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      4. 以每次 1 µL 的增量加入 2 M 谷氨酸，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      5. 加入 5 µL 的 4 mM 细胞色素 c（终浓度为 10 µM），并等待呼吸稳定。
      6. 以每次 5 µL 的增量加入 1 M 琥珀酸，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      7. 以每次 5 µL 的增量加入 0.5 M ADP，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      8. 以每次 0.5 µL 的增量加入 1 mM FCCP，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步增加。
      9. 以每次 1 µL 的增量加入 150 µM 鱼藤酮，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步下降。
      10. 以每次 1 µL 的增量加入 125 µM 抗霉素 A，并在每次加样后等待呼吸稳定，持续操作直至呼吸无进一步下降。
      11. 加入 5 µL 的 0.8 M 抗坏血酸（终浓度为 2 mM）。
      12. 立即加入 5 µL 的 0.2 M TMPD（终浓度为 0.5 mM），等待呼吸上升变缓。在另一独立实验中，加入 10 µL 的 0.2 M TMPD（终浓度为 1 mM）。
      13. 在独立实验中，当抗坏血酸/TMPD 的呼吸通量达到平台期时，立即分别加入 10 µL、25 µL、50 µL 和 100 µL 的 4 M 叠氮化钠（终浓度分别为 20 mM、50 mM、100 mM 和 200 mM）。
    2. 选择在首次加样时即达到饱和的底物和抑制剂浓度，以优化实验时间进程。使用饱和或亚饱和浓度的 ADP，以便将 ADP 敏感性评估与传统 SUIT 方案结合。
    3. 使用亚最大浓度的解偶联剂，以展示剂量依赖性响应，同时避免抑制呼吸通量。

8. 数据分析

  1. SUIT分析
    1. 从每次滴定中选择稳态或峰值速率，并导出以进行数据分析。
    2. 以 pmol O 表示数据2 每毫克组织每秒（pmol/s/mg）
    3. 通过减去实现对 PM-L、PM-P、PMG-P、PMGS-P 和 PMGS-E 的分析性降低 抗霉素A不敏感速率与相应速率之差（即加入ADP后获得的稳态速率）。
      注：PM：丙酮酸 + 苹果酸；PMG：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸；PMGS：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸 + 琥珀酸；-L：泄漏态；-P：氧化磷酸化态；-E：电子传递态。
    4. 通过减去CIV-E的分析还原 叠氮化钠不敏感速率与抗坏血酸/TMPD峰值速率之差。
    5. 通过从PMGS-E速率中减去鱼藤酮不敏感速率，实现PMG-E的分析还原。
    6. 通过从鱼藤酮不敏感速率中减去抗霉素A不敏感速率，实现对S-E的分析性还原。
    7. 实现细胞色素的分析还原 c 通过以下公式计算作为外膜完整性的标志的对照效率：
      jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) × 100
      在方程中，jc 添加细胞色素后的百分比增加量 c，JCHNOc 添加细胞色素后测得的氧通量 c，以及 JCHNO 添加细胞色素之前氧气的通量 c.
  2. ADP 敏感性分析
    1. 通过分析方法确定ADP敏感性相对于琥珀酸盐+鱼藤酮的泄漏速率（而非组织匀浆的速率）的动力学。
    2. 绘制 O2 通量（Y轴）相对于ADP相对浓度（X轴）。确定最大呼吸速率（V最大值) 作为ADP滴定过程中达到的峰值速率。
    3. 使用曲线拟合软件（PRISM，版本 10.1）确定米氏动力学参数，以揭示反应速率达到最大速率一半时的 ADP 浓度MAX 达到（表观KM).

9. 仪器质量控制

  1. 进行仪器O2 在所需的氧气浓度范围（0–600 µM）和零点校准下的背景值
    1. 完成步骤 3.1 和 3.2
    2. 移除塞子，吸出小室中的70%乙醇（避免接触小室内侧暴露的膜）。用双蒸水冲洗4次2O，并向反应腔中加入2.25 mL MiR05缓冲液
    3. 将腔室中的氧气浓度超饱和至约 600 µM。
    4. 缓慢将塞子插入至完全闭合位置。通过注射毛细管虹吸掉喷出并收集在塞子孔穴中的过量培养基，并让氧气信号稳定（30–45 分钟）。
    5. 为进行氧气校准，请选择氧气浓度和斜率均稳定的区域，打开相应腔室的校准窗口，然后选择 R1 标记。
    6. 将20 mg连二亚硫酸钠溶解于0.5 mL水中，配制连二亚硫酸盐溶液。连二亚硫酸盐在氧气暴露下会随时间推移被氧化，因此应尽量减少其与空气的接触。
    7. 待氧信号稳定后，注入1 µL并观察氧浓度的下降。根据需要调整连二亚硫酸盐溶液的浓度。
    8. 分别注入足量连二亚硫酸盐溶液，使氧气浓度降至 450 µM、300 µM、225 µM、150 µM、75 µM 和 0 µM。每次注射后，待氧气浓度稳定，标记稳态斜率。当氧气浓度接近 0 µM 时，标记此时的氧气浓度。
    9. 进行仪器O2 背景校正，选择相应通道的通量/斜率窗口，选择 O2 背景校准，然后点击 校准 对于感兴趣的标记。
    10. 进行零点校准，打开相应腔室的校准窗口，然后选择 R0 连二亚硫酸盐滴定后达到的标记
  2. 仪器清洁
    1. 用纯水快速冲洗每个腔室三次。第一次清洗时，吸出匀浆液，将腔室完全注满水，然后吸出水。第二次清洗时，将腔室注入¾体积的水，插入塞子以迫使水通过注射毛细管，通过注射毛细管吸出部分水，然后拔出塞子，将清洗液完全吸出。
    2. 用70%乙醇清洗腔室5分钟。
    3. 在水槽或烧杯上方，使用纯水、70%乙醇和100%乙醇清洗密封塞，并用洗瓶将液体强制通过注射毛细管。
    4. 每个腔室用纯水快速冲洗两次。
    5. 将含有约2 mg冷冻线粒体、细胞裂解物或活成纤维细胞的2 mL PBS加入培养室，孵育15分钟。
    6. 用纯水清洗腔室，每次5分钟，重复两次。
    7. 用70%乙醇清洗腔室，每次5分钟，重复两次。
    8. 用100%乙醇清洗腔室10分钟。
    9. 用70%乙醇填充腔室。
      1. 若进行连续实验，将室置于70%乙醇中5分钟，然后继续步骤3.3。
      2. 若实验已完成，盖上塞子的盖子并关闭仪器。
  3. 每次使用后，应正确清洗注射器，并将注射器专用于特定化合物，以防止交叉污染。
    1. 将注射器插入洗涤液中，并完全浸没注射针头。
    2. 用注射器吸取洗涤液至最大体积。
    3. 将注射器从清洗容器中取出，将清洗液排入烧杯，然后用纸巾吸干注射器。
    4. 每次使用后应尽快重复步骤 9.3.1–9.3.3，共重复三次。

结果

初期研究发现，EO771 肿瘤的氧化水平较低，因此需要较高的匀浆浓度才能获得足够的 O2 通量评估。为确定本研究中组织匀浆的最佳浓度范围，进行了优化实验。肿瘤匀浆初始制备浓度为40 mg/mL，随后进行线性稀释。O2 以组织质量归一化的通量在不同浓度下保持一致（图1A-D）。观察发现，40 mg/mL 的浓度会导致氧气迅速耗尽，不适合用于实验（图1A). 在无底物或ADP存在的情况下，30 mg/mL和20 mg/mL组的耗氧速率显著减慢，但仍于短时间内迅速下降图1B，C）。10 mg/mL 浓度下获得了最佳的氧气消耗速率（图1D）以支持更长的90分钟SUIT方案。

采用 SUIT 协议评估 NADH 和琥珀酸盐连接的氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递（ET），以及复合体 IV（CIV）活性（图 2A）。在无 ADP 的条件下，将丙酮酸和苹果酸加入组织匀浆中，以驱动经 NADH 的泄漏呼吸（L）。随后加入饱和浓度的 ADP 以驱动最大 NADH 连接的 OXPHOS（P），然后加入谷氨酸。接着加入细胞色素 c 以检测外膜完整性；所有样品中呼吸速率的增加均低于 20%（图 2B）。鉴于 NADH 连接底物的反应极低，也在琥珀酸盐和鱼藤酮存在下评估细胞色素 c 的释放，结果仅观察到细胞色素 c 刺激作用微弱（图 2B）。有趣的是，在 EO771 肿瘤中，NADH 连接的 OXPHOS 几乎可忽略不计（图 2C）。随后在丙酮酸、苹果酸和谷氨酸存在下加入琥珀酸，以刺激经琥珀酸脱氢酶的电子流。然后滴定 FCCP 以驱动最大电子流（E），结果表明在 EO771 肿瘤中，呼吸受限的主要因素是磷酸化而非氧化（图 2C）。随后滴定鱼藤酮和抗霉素 A，分别抑制复合体 I 和复合体 III。然后加入抗坏血酸和 TMPD，以驱动经 CIV 的最大电子流，该过程随后被叠氮化钠抑制。表 1 展示了将原始数据（表 2）进行分析化简的方程式，用于定量 图 2C 中绘制的呼吸参数。总体而言，肿瘤匀浆的呼吸谱（图 2C）与未移植的经二癸基硫酸钠透化的 EO771 细胞相似（图 2D），但肿瘤中由 N- 和 S-连接底物支持的最大电子传递能力有所降低。

由于NADH相关的呼吸作用可忽略不计，因此通过逐步滴加亚饱和浓度的ADP，进一步评估了琥珀酸盐的呼吸动力学，直至达到最大速率（VMAX）（图3A、3B）。在琥珀酸盐 + 鱼藤酮存在条件下，ADP的半最大浓度（KM）为37.5 µM，而VMAX 约为10.5 pmol/s/mg（图3C）。因此，尽管EO771肿瘤的氧化速率相对较低，但其对ADP高度敏感，能够在相对较低的ADP浓度下维持ATP合成。

选择原始数据中适当的区域进行提取，对于实验的可重复性和准确量化至关重要。对于细胞色素c，需在注射前立即处于稳态的阶段选择一个标记点（图4A，标记1）。注射后常会出现初始的注射干扰，随后可能有一段时期（约5-10分钟），期间O2通量尚未达到稳定。细胞色素c效率的评估应在O2通量稳定后再次选择标记点进行（图4A，标记2）。在添加底物、ADP或大多数抑制剂后，其选择标记也应在注射干扰消失且O2通量稳定后进行（图4B）。用于确定最大解偶联呼吸的选择，应取在FCCP滴定过程中达到呼吸峰值的时刻，而该峰值通常并非最后一次注射所对应的时间点（图4C）。对于TMPD的测量，应在加入抗坏血酸和TMPD之后，并在呼吸速率达到峰值时进行选择（图4D，标记1）。在此峰值刚过之后，加入抑制剂叠氮化钠，其会迅速降低呼吸速率，但通常也会出现低于抑制后呼吸速率的注射干扰（图4D）。抑制剂标记点应在注射干扰结束后立即选取（图4D，标记2）。此时O2通量通常不会趋于稳定，而是持续下降。

表1：呼吸符号表示法与解析推导。请点击此处下载该表格。

表2：管腔B型乳腺肿瘤匀浆样本及呼吸特征。请点击此处下载该表格。

氧气通量随浓度变化的曲线图，分析不同浓度下随时间变化的氧气消耗。
图1：肿瘤匀浆液浓度的优化。O2 通量（红色）和 O2 浓度（蓝色）在乳腺肿瘤匀浆液中的变化，匀浆浓度分别为（A）40 mg/mL、（B）30 mg/mL、（C）20 mg/mL 和（D）10 mg/mL。Thom：组织匀浆呼吸。 请点击此处查看该图的放大版本。

氧通量分析；O₂通量/流速图；细胞色素c释放；实验比较
图2通过高分辨率呼吸测定法评估新鲜切除肿瘤匀浆中的氧化磷酸化和电子传递链能力 (A代表性曲线图，显示底物、抑制剂、解偶联剂实验过程中耗氧量（红色）与浓度（蓝色）的变化。PM：丙酮酸 + 苹果酸，D：ADP，G：谷氨酸，c：细胞色素 c，S：琥珀酸，F：FCCP，Rot：鱼藤酮，Ama：抗霉素A，Asc/TMPD：抗坏血酸/四甲基对苯二胺。B) O的百分比增加2 细胞色素添加后的通量变化 c. (C-D) 在存在ADP、FCCP以及抗坏血酸/TMPD的条件下，由苹果酸、丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸支持的呼吸作用CEO771 来源的肿瘤匀浆物以及（D非植入型EO771细胞经皂苷（digitonin）透化处理。Thom：组织匀浆呼吸；PM：丙酮酸 + 苹果酸；PMG：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸；PMGS：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸 + 琥珀酸；CIV：复合物IV；-L：泄漏态；-P：氧化磷酸化态；-E：电子传递态；N连接：O2 由特定NADH生成底物组合支持的通量；NS连接：O2 由特定NADH生成底物组合与琥珀酸盐的汇聚所提供的通量。 请点击此处以查看此图的放大版本。

线粒体呼吸图，O2通量与ADP；动力学曲线和柱状图；研究数据。
图3：EO771乳腺肿瘤表现出对ADP（腺苷5′-二磷酸）的高度敏感性。（A）S型ADP滴定实验中氧消耗（红色）和浓度（蓝色）的代表性曲线。Thom：组织匀浆呼吸；S/Rot：琥珀酸/鱼藤酮；D：ADP。（B）在鱼藤酮存在下，琥珀酸支持的呼吸作用随ADP浓度递增（0 µM ADP = S/Rot-L）。（C）在琥珀酸 + 鱼藤酮存在条件下，ADP的呼吸最大速率（VMAX）和半最大效应浓度（KM）。请点击此处查看该图的放大版本。

O₂ 流量与浓度关系图；氧气消耗研究；时间变化分析，实验数据。
图 4：代表性轨迹图，展示用于数据提取的原始 O2 流量标记选择。（A）细胞色素 c 选择：在注射细胞色素 c 之前的选择点 1，以及注射后 O2 流量稳定时的选择点 2。c：细胞色素 c。（B）底物、ADP 和抑制剂选择：在注射后（本代表性图中为琥珀酸）O2 流量稳定时的选择点 1。S：琥珀酸。（C）解偶联剂选择：在解偶联剂滴定过程中呼吸速率达到峰值时的选择点 1。在本代表性 FCCP 滴定图中，第三次注射略微降低了呼吸速率，因此不用于选择。F：FCCP。（D）TMPD 选择：在抗坏血酸和 TMPD 注射后呼吸速率达到峰值时的选择点 1。叠氮化钠选择：在急性注射伪影之后，当呼吸速率最初下降并恢复时的选择点 2。As/Tm：抗坏血酸/TMPD；Azd：叠氮化物。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前对癌症中线粒体呼吸功能的评估方法主要局限于体外模型13,14,15,16。尽管已有研究通过化学透化法成功测量了肿瘤组织中的线粒体呼吸活性6,7,17，但尚无一种统一的、可作为金标准的方法能够普遍适用于不同类型肿瘤并实现数据间的直接比较。此外，由于缺乏一致的数据分析和报告规范，限制了研究结果的普适性与可重复性。本文所述方法提供了一种简便且相对快速的技术流程，用于检测新鲜切除的实体瘤组织中分离所得线粒体的呼吸功能18。实验所用肿瘤由原位移植的鼠源Luminal B型、ERα阴性EO771乳腺癌细胞诱导生成19。

仔细谨慎地处理组织样本将显著提高耗氧速率测定的准确性和标准化水平。若样本未保持低温、未始终浸没于保存液中，或操作过度，则组织和线粒体极易受损，导致基础呼吸和氧化磷酸化（OXPHOS）速率不理想。此外，均质化组织的湿重测定极为关键，因为这是主要的标准化方法。也可考虑其他标准化方法，例如总蛋白含量或线粒体特异性标志物（如柠檬酸合酶活性）。20此外，还需解决组织异质性问题，并确定实验中应包含的肿瘤区域 先验的 坏死、纤维化及结缔组织可能难以充分匀浆和/或呼吸，应避免使用，除非有意检测这些肿瘤区域。值得注意的是，肿瘤组织可能因类型和切除部位不同而具有较强黏性，导致准确称重和转移更加困难。匀浆时应优化研磨次数，以确保线粒体充分制备，同时尽量减少对外膜的损伤。

为了提高准确性和可重复性，建议针对匀浆制备时的研磨次数、组织浓度以及底物、解偶联剂和抑制剂的浓度进行优化实验。研究可以比较不同的研磨次数，并分析其与细胞色素 c 加入后反应性之间的关系，以及与最大线粒体呼吸能力的关联21。尽管普遍认为细胞色素 c 的反应越小越好——因为加入细胞色素 c 后耗氧量增加可能提示线粒体外膜受损——但目前尚无统一的金标准来界定各类组织的阈值，需通过实验确定，以确保组织未被过度处理或准备不足。在本项肿瘤组织研究中发现，细胞色素 c 的反应低于约30%时不会损害呼吸功能。若检测结果呈阳性，则使用细胞色素 c 对准确量化呼吸能力至关重要。在此情况下，外源添加可补充内源性细胞色素 c，若其缺失，则会导致呼吸速率被低估。

可在一系列可行浓度范围内进行组织浓度滴定实验，理想情况下应使用研究中将要检测的SUITs进行。呼吸能力会因肿瘤类型和组成而异。因此，线粒体含量丰富或呼吸能力较高的肿瘤需要较低的浓度（0.5–5 mg/mL）；而线粒体较少或呼吸能力较低的肿瘤则需要较高的浓度（7–12 mg/mL）。此外，对于较长或底物消耗较多的SUITs，可能需要减少组织用量，以避免反应室重新氧合或ADP受限。某些组织的耗氧量呈线性关系，而另一些组织则在特定浓度范围内表现出更高的敏感性和最大氧化速率。所选择的组织浓度应优化至在最大限度提高氧通量的同时，减少重新氧合事件的发生次数。此外，通常更建议高估组织需求量，或以浓度范围的上限为目标。当使用较大数量的线粒体时，用于定量呼吸通量的关键抑制剂的作用将更为精确。

另一个重要的考虑因素是实验方案中所用药物的浓度。匀浆浓度的变化可能改变底物、解偶联剂和抑制剂达到最大反应所需的浓度。因此，在确定最佳浓度范围后，应进行实验以测试SUIT方案所需的剂量。可额外添加ADP，以确保腺苷酸浓度不会限制呼吸通量。化学解偶联剂（如FCCP或CCCP）在较高浓度下会抑制呼吸作用22。因此，必须以小剂量逐步滴加以揭示所达到的最大速率。抑制剂（如鱼藤酮和抗霉素A）最好在首次注射时即达到饱和。尽管最优浓度已在预实验中确定，但我们还观察到不同处理对抑制剂反应的差异，因此通常会追加一次抑制剂注射，以证明达到最大抑制效果，因为由此得到的速率是定量分析的基础。抗坏血酸/TMPD的化学抑制对于准确的分析还原至关重要，因为TMPD会发生自氧化23。我们通过添加叠氮化钠（一种公认的CIV抑制剂）来控制抗坏血酸/TMPD/细胞色素c的自氧化。在Km研究中，仅在存在琥珀酸时加入鱼藤酮，可防止草酰乙酸积累，后者在低浓度下可能抑制琥珀酸脱氢酶活性24。ADP的体积和浓度高度依赖于线粒体对当前底物组合的敏感性。对ADP高度敏感的线粒体制备物需要较低的起始浓度。此外，使用经过验证的化学品，并正确配制药物，注意pH值、是否避光（如适用）以及储存温度，是实验成功的关键。

仪器的设置和日常维护对这些实验的成功至关重要。充分且正确的腔室清洁对于实验的可重复性以及防止生物、蛋白质、抑制剂或解偶联剂污染至关重要。克拉克型电极和O2k系统采用玻璃反应腔室，相比依赖耗材的基于板的系统，具有显著的成本优势。然而，玻璃腔室必须彻底清洗，否则可能成为后续研究中抑制剂污染的来源。在清洗过程中，使用富含线粒体的样本（例如分离的心脏或肝脏线粒体）进行孵育，可降低实验污染的风险，建议在稀释和基于酒精的清洗程序之外额外采用此步骤。若连续进行多个实验，使用乙醇和线粒体进行清洗可最大程度减少抑制剂污染的可能性。建议在每次实验前对氧传感器进行校准，以获得相对于当前氧分压的准确呼吸测量值。如果无法进行多次校准，只要在清洗程序后氧浓度保持稳定且一致，则每日校准一次可能已足够。

上述方案利用Oroboros O2k仪器，在肿瘤切除后4小时内测定肿瘤组织的耗氧量，所用保存液和呼吸介质均为先前设计并优化的配方25,26,27。本实验方案中的多个参数可根据后续应用需求进行调整。仪器的设置与校准、组织制备所用的匀浆器，以及匀浆物和反应室中最佳氧浓度等条件，均可适配于其他具备氧监测功能的仪器。例如，在向反应室加入匀浆物时可略微过量填充，从而确保反应室完全封闭后毛细管内仍充满液体。这会导致反应室内部分氧气被消耗 ，但通过优化样品浓度，我们可在确定初始氧浓度时对此消耗予以校正。另一种方法是在关闭反应室前让样品在环境氧浓度下平衡，但这通常会延长实验开始前的准备时间，并延迟底物的添加。尽管本方案中使用的匀浆器易于获取，也可采用其他商业化的匀浆技术，例如组织剪切仪或自动匀浆仪28。

此外，该组织制备和仪器操作方法可结合多种不同的SUITS方案，用于研究不同耦合状态和通路控制状态下的呼吸调控29。这些SUITS方案旨在测定功能容量，因此潜在内源性底物的贡献不会影响容量测定结果。我们通过减去抗霉素A-鱼藤酮或叠氮化钠不敏感的耗氧速率，视情况对非线粒体耗氧和/或匀浆残留耗氧进行分析校正。线粒体在BIOPS或类似配制的保存液中可长时间保持活性（>24 h），具体时长取决于组织类型及其完整性30,31。可预先开展研究以确定时间储存限度，因为特定底物的氧化磷酸化（OXPHOS）可能存在不同的限制因素。若实验无法在组织切除或活检后数小时内进行，此步骤尤为关键。37°C是评估大多数哺乳动物系统呼吸功能的最优且生理相关的温度。然而，若检测温度可能干扰评估结果32，可在较宽的温度范围（25–40 °C）内开展比较研究，以确保足够的反应灵敏度。仪器限制可能会影响此类研究的实施。

上述方法的主要局限性包括：1）机械匀浆可能对线粒体造成损伤；2）匀浆制备物中存在ATP酶或其他亚细胞生化物质，可能干扰ATP或其他目标变量的同步测定，因而可能需要额外的校正方法或使用抑制剂33；3）由于一台仪器一次仅能进行两个实验，且连续实验之间需要清洗和重新设置，因此对大量样品和/或每个样品进行多个SUIT检测时较为耗时。通过优化实验条件和保持样品制备的一致性，可最大限度地减少显著的线粒体损伤，从而避免数据不一致。

与现有或替代方法相比，该方法的优势在于起始材料用量更少、线粒体分离难度更低，以及组织透化技术挑战更小，因而可行性显著提高。制备匀浆的速度更快，氧气限制因素大大减少，且相较于透化组织，实验结果受操作人员差异的影响更小。尤为重要的是，几乎所有类型的样本均适用于匀浆制备，从而允许在不同组织间进行比较分析。高分辨率呼吸测定法是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递链（ET）检测的金标准。该方法在临床前及临床癌症研究中的应用，有望将当前的体外（in vitro）研究拓展至离体（ex vivo）研究，并在临床和诊断领域展现出潜在应用价值。

披露

作者与本工作无利益冲突。

致谢

感谢Pennington生物医学研究中心比较生物学核心团队在动物护理方面提供的帮助。本研究部分得到了美国国立卫生研究院基金U54GM104940（JPK）和KL2TR003097（LAG）的支持。所有涉及动物的实验和操作程序均经Pennington生物医学研究中心机构动物护理和使用委员会批准。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物Sigma-AldrichM8250
腺苷5′′二磷酸钠盐Sigma-AldrichA2754
腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichA2383
两性霉素BGibco15290018
抗霉素ASigma-AldrichA8674
抗坏血酸Sigma-AldrichA4544
牛血清白蛋白，第五组分，热激，无脂肪酸Sigma-Aldrich3117057001罗氏
BD 50 mL 鲁尔锁注射器Fisher Scientific13-689-8
BD Vacutainer 通用采血针Fisher Scientific23-021-020
碳酸钙Sigma-AldrichC4830
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙Sigma-AldrichC2920
来自马心的细胞色素cSigma-AldrichC2506
Datlab 7.4 软件Oroboros Instruments
二甲基亚砜AmrescoN182
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
D-蔗糖Sigma-AldrichS7903
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30Dumoxel，可高压灭菌
Dumont #7 镊子Fine Science Tools11271-30Dumoxel，可高压灭菌
数显卡尺 150 mm/6 inWorld Precision Instruments501601
EO771 细胞CH3 BioSystemsSKU： 94APV1-小瓶-预混液病原体检测
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸Sigma-AldrichE4378
雌性C57BL/6J小鼠 杰克逊实验室品系编号 #000664
HEPESSigma-AldrichH4034
咪唑Sigma-Aldrich56750
KimwipesFisher Scientific34120
L-(−)-苹果酸Sigma-AldrichG1626
乳糖酸Sigma-AldrichL2398
苹果酸Sigma-AldrichM6413
基质胶矩阵康宁354248
MgCl·6H2OSigma-AldrichM2670
微量注射器Hamilton87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′，N′四甲基对苯二胺Sigma-AldrichT7394
Oxygraph-2kOroboros Instruments10023-03
Oxygraph-2k 荧光呼吸测量仪Oroboros Instruments10003-01
PBSGibco10010023
青霉素-链霉素Gibco15140122
磷酸肌酸二钠盐水合物Sigma-AldrichP7936
氢氧化钾Sigma-AldrichP1767
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5655
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
RPMI 1640Gibco21875034
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002
丙酮酸钠Sigma-AldrichP5280
琥珀酸（二钠）Sigma-AldrichW327700
牛磺酸Sigma-AldrichT0625
Whatman 滤纸，5号规格Sigma-Aldrich1005-090
Wheaton Tenbroeck 组织研磨器，7 mLDuran Wheaton Kimble357424
直头显微解剖剪RobozRS-5914SC
非安全型手术刀11号McKesson1029065
BD Precision Glide 针头 27 G × 1/2Becton, Dickinson and Company305109
BD Precision Glide 针头 18 G × 1Becton, Dickinson and Company305195
BD 1 mL 滑动接头注射器Becton, Dickinson and Company309659
Pyrex 可重复使用培养皿，60 mm赛默飞世尔科技316060
啮齿类动物极高脂肪饮食  60% 千卡来自脂肪，20% 千卡来自蛋白质，20% 千卡来自碳水化合物研究饮食D12492
Pyrex 表面皿，100 mm赛默飞世尔科技S34819

参考文献

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