本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体 生理学相关的急性脑切片，并提供用户友好的分析流程。
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摘要
摘要
在神经元发育过程中，轴突在皮层环境中穿行，以到达其最终目标位置并建立突触连接。这一过程由位于发育中轴突远端的感知结构——生长锥——来执行。研究生长锥的结构与动态对于理解轴突发育及其与周围中枢神经系统（CNS）的相互作用至关重要，这些相互作用使神经元能够形成神经回路。在基础研究和临床前研究中，若需设计方法使损伤后的轴突重新整合入神经回路，此类研究尤为关键。迄今为止，对生长锥动态的普遍认知主要基于在二维（2D）培养条件下培养的神经元研究。尽管2D培养研究无疑为当前关于生长锥结构动态及其对刺激反应的知识奠定了基础，但其无法真实再现完整中枢神经系统组织中生长锥所处的生理三维（3D）环境。近年来，研究人员采用胶原凝胶以部分克服这些局限性，实现了在3D环境中对神经元发育的探究。然而，无论是合成的2D还是3D培养环境，均缺乏中枢神经系统组织内引导发育中轴突延伸与路径选择的信号分子。本实验方案提供了一种利用脑组织切片研究轴突与生长锥的方法，在该模型中，发育中的轴突可接触到生理相关的物理与化学信号。通过精细调控 在子宫内 和 子宫外 通过电穿孔技术稀疏递送荧光报告分子，并结合超分辨率显微镜，本方案提供了一种用于可视化轴突及生长锥动态的方法学流程 原位此外，还包括对长期和活细胞成像数据进行分析的详细工具包说明。
引言
神经元是高度极化的细胞，构成了神经系统的基本计算单元。它们接收和传递信息，这一过程依赖于输入和输出区域的区室化：分别为树突和轴突1。在发育过程中，轴突在延伸的同时需穿越极为复杂的环境以到达其目标位置。轴突的导航由生长锥引导，生长锥是位于发育中轴突末端的一种感觉结构。生长锥能够感知外界环境信号，并将其转化为细胞骨架的动态空间重组2,3。由此产生的形态-力学反应指示生长锥朝向或远离刺激信号延伸或回缩，从而引导轴突执行特定的运动行为。
目前对轴突延伸和生长锥动态的理解主要源于在二维（2D）基底上评估轴突生长的研究2,4,5,6,7这些开创性研究揭示了生长锥与生长基质之间复杂的相互作用，并发现这种相互作用会因基质特性（如黏附性和刚度）的不同而表现出显著差异。8,9基于这些发现，研究人员认为细胞外环境信号可决定轴突生长，而生长锥细胞骨架则执行这一生长过程。2,10,11,12值得注意的是，神经元可以在非黏附性基质（如多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸）上延伸轴突。13此外，基质刚度可独立于细胞黏附复合物影响轴突生长速率8因此，仅在二维基质上研究生长锥动态无法准确模拟轴突生长锥与生理相关的三维（3D）环境相互作用时所产生的力的平衡，例如在体内所存在的那些环境 体内.
为了克服二维检测方法的局限性，已有研究在三维基质中探讨轴突生长及生长锥动态8,9。这些基质提供了更接近生理状态的环境，同时仍允许研究轴突生长的细胞内在机制。该方法能够在多种条件下以单细胞方式观察生长锥，并适用于药理学干预9。在此类三维环境中，轴突表现出独特的细胞骨架动态，并且生长速度较二维培养的神经元更快9。这些精巧的研究揭示了额外空间维度对生长锥细胞骨架重排及其行为的影响。
尽管三维基质在支持类似天然的神经元发育和轴突生长方面相较于二维表面具有明显优势，但其仍是一种简化的合成支架，无法反映中枢神经系统（CNS）组织中所观察到的动态复杂性。此处通过递送报告质粒 子宫外 和 在子宫内 电穿孔与脑组织器官型切片培养相结合，并 原位 活细胞超分辨率成像以在生理环境下分析生长锥动态。该方法可在轴突发育过程中呈现其三维结构特征的可视化效果。 体内 环境及其理化组成的复杂性。最后，介绍了使用常见授权且公开可获取的软件来测量轴突生长和生长锥动态的用户友好型操作流程。
方案
动物实验必须遵守相关的机构和联邦法规。本方案中使用了妊娠15.5天和12.5天（E15.5和E12.5）的C57BL/6JRj雌性小鼠。实验操作遵循北莱茵-威斯特法伦州环境署（Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)）的《动物福利法》进行。
1. 注射用质粒的制备
- 根据制造商提供的方案，使用无内毒素的大量质粒提取试剂盒（参见材料表）提取DNA。
- 将选定的DNA与10%的快绿溶液（参见材料表）按所需浓度混合（表1），以便在向脑室递送DNA混合物时进行可视化观察。
注意：本实验中使用的特定质粒分别用于皮层神经元的稀疏标记（图1A）、生长锥中丝状肌动蛋白（F-actin）结构的标记（图1B），以及在同一皮层内对生长锥进行双标标记（图1C）。本方案中使用的所有质粒（表1）均已存入Addgene（参见材料表）。 - 使用毛细管电极拉制仪，并按照以下程序设置参数：气压：500，加热：800，拉力：30，速度：40，制备玻璃毛细管。
- 使用微量移液器吸头将15 µL DNA/快绿混合液装入每根玻璃毛细管中。
注意：确保不产生气泡。 - 将装有DNA的毛细管储存在直径为10 cm的培养皿中，培养皿内横放一块造型黏土用于固定毛细管。毛细管可在实验前一天装载并置于4 °C保存。用柔性封膜密封毛细管尾端，防止干燥。
2. 溶液的配制
- 制备含葡萄糖的汉克斯平衡盐溶液（HBSS-G）。
- 向一瓶1× HBSS中加入0.5%的20%葡萄糖储备液。充分混匀后，于4 °C保存，最多可保存2周。在胚胎提取前，使用通气石将HBSS-G溶液短暂通入碳氧混合气体（95% O2 和 5% CO2）进行饱和。
- 切片培养基溶液
- 在无菌条件下，配制新鲜的切片培养基，包含Neurobasal 1×、5%马血清、5%胎牛血清、B27添加剂1:50、L-谷氨酰胺添加剂1:400、青霉素-链霉素1:200，以及Neuropan-2添加剂1:100（pH = 7.3）（见材料表）。
- 将3 cm培养皿每皿加入1 mL切片培养基。实验前至少1小时将其置于35 °C、5% CO2的培养箱中，以通过气体交换平衡培养基的pH。
注意：培养基 pH的平衡是由于培养箱中的CO2使培养基酸化所致。切片培养基可在4 °C保存最多1周。
- 低熔点琼脂糖溶液（3%）
- 称取所需量的低熔点琼脂糖粉末，溶于适量1× HBSS-G中，使用玻璃瓶配制。每个脑组织约需7 mL琼脂糖溶液。
- 将瓶子放入微波炉加热2–3分钟，瓶盖松开，每10–20秒摇动一次。
- 待粉末完全溶解后，将瓶子置于设定为37 °C的水浴或金属浴中，实验前至少预热1小时，使琼脂糖冷却。
注意：建议将琼脂糖加热两次，每次超过15分钟，以确保粉末完全溶解。这对于琼脂糖与脑组织之间的良好粘附至关重要。在包埋脑组织时应使用温度计测量琼脂糖溶液的温度，确保其保持在37–40 °C之间。不同年龄动物的脑组织硬度不同，建议测试一系列琼脂糖浓度，以获得组织与琼脂糖之间的一致性。 - 配制含0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS-T）。
- 配制含0.2%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS-NaN3）。
注意： 步骤2.4–2.5中所述溶液用于后续免疫组织化学步骤。
3. 手术台的准备
- 用70%-96%乙醇清洁手术台，并在台面放置手术垫单。
- 用70%-96%乙醇冲洗手术器械进行消毒，随后在热珠灭菌器中进行干热灭菌。
- 在将铂金镊电极（见材料表）连接至脉冲发生器前，先用70%-96%乙醇清洁。
- 将装有DNA/快绿溶液的玻璃毛细管插入毛细管固定架中。使用前立即用精细剪刀轻轻剪断毛细管尖端，并在装有预热生理盐水或水的1.5 mL微量离心管中测试溶液流出情况。
注：图2A、B展示了ex utero电穿孔（EUE）和in utero电穿孔（IUE）所用的手术台设置及工具。 - 进行IUE时，将生理盐水在水浴中预热至37 °C。
4. 胚胎提取
- 将怀孕小鼠置于含5%异氟烷的麻醉诱导室中，直至小鼠深度麻醉。通过脚趾回缩反射消失确认麻醉状态。
- 将小鼠转移至手术垫上，并通过鼻罩以1.5%–2%异氟烷维持麻醉。
- 涂抹眼膏以防止双眼角膜干燥。
- 剃除小鼠腹部的毛发，然后用70%-96%乙醇浸湿的纱布去除剃下的毛发。用聚维酮碘清洁该区域。
- 使用无菌的小型手术剪，沿腹部中线做一条2 cm的皮肤切口，随后做一条1.5 cm的肌肉切口。
注意：切口大小取决于胚胎的大小。实际上，较大的胚胎需要更大的切口以便取出。 - 在纱布中央剪一个足够大的孔（直径约2 cm），以容纳皮肤切口，用温盐水浸湿后置于腹部切口周围。
- 用浸有温盐水的棉签或镊子轻轻拉出两侧子宫角，小心夹住胚胎之间的间隙将其取出。将胚胎置于湿润的纱布上（图2C).
注意：即使对子宫角周围血管和毛细血管造成轻微损伤，也可能导致大量出血。因此，应始终避免直接接触这些富含血管的区域。 - 切开子宫囊，取出每个胚胎（图 2D).
- 取出后立即处死每只胚胎 通过 一条斜向下的切口，确保脊髓完全横断（图2E).
- 将胚胎置于含有 HBSS-G 的 10 cm 培养皿中，并置于冰上。
注意：避免斩首胚胎，以防止脑组织中的DNA/快绿混合物泄漏，并便于胚胎在固定装置中轻松定位（参见 子宫外 电穿孔，步骤5。 - 在取出胚胎后，立即通过颈椎脱位法处死母鼠。
注意：根据北莱茵-威斯特法伦州环境署（LANUV）动物福利法批准的方案，此处对母鼠实施麻醉后安乐死，以避免其在术后经历任何疼痛或痛苦。
5. 子宫外 电穿孔（EUE）
- 拿起一个胚胎并将其放入固定器中。
注意：使用连接在细胞刮铲末端的剪切1 mL移液枪头作为胚胎固定器。操作过程中必须确保胚胎的肢体保持在枪头外部，以防止其滑入枪头内（图2F-I）。移液枪头的直径可根据不同大小的胚胎进行调整。另取一个枪头，在其直径与胚胎大小匹配的位置剪断，并将其作为适配器插入上述固定器中。 - 将装有DNA/快绿的玻璃毛细管小心地穿过胚胎颅骨，插入侧脑室，并向每个脑室注射2–3 µL的DNA质粒混合物（图1A、B；表1）（图2F）。
注意：以人字缝和矢状缝作为DNA注射位置的定位参考。人字缝和矢状缝是连接颅骨骨板的纤维性关节。前者连接顶骨与枕骨，后者连接两侧顶骨。 - 使用铂金镊电极以适当角度夹住胚胎头部，以靶向目标脑区（本实验中为60°角），并将阴极朝向预期进行DNA转移的区域（图2G-H）。
- 使用方波脉冲发生器施加5次脉冲，每次30 mV，间隔1 s，持续时间为50 ms。
注意：需注意，与宫内电穿孔（IUE）相比，宫外电穿孔（EUE）中的脑组织会经历更有效的电场作用。因此，在相同DNA浓度下，EUE的DNA转染效率高于IUE，需相应调整DNA浓度。 - 若需进行双侧电穿孔，则重复步骤5.3–5.4，将阴极和阳极位置相对于之前对称翻转，以靶向对侧皮层。
注意：由于两侧脑室均已注射DNA，因此双侧半球的皮层均被靶向。 - 将完成电穿孔的胚胎置于含有冰浴HBSS-G的6 cm培养皿中。对所有需要处理的胚胎重复步骤5.1–5.6。
6. 在子宫内 电穿孔（IUE）
- 在手术前20分钟，对怀孕小鼠皮下注射50 µL的镇痛剂布托啡诺（0.1 mg/kg）（参见材料表）。
- 执行胚胎提取部分的步骤4.1–4.8。
注意：为避免胚胎不必要的暴露，应用无菌纱布覆盖胚胎，纱布需用温热的生理盐水浸湿。 - 用手指轻轻在子宫内旋转胚胎，直至定位到人字缝和矢状缝（图2J）。将装有DNA/快绿的玻璃毛细管小心穿过子宫壁和胚胎颅骨，插入侧脑室，并向一个或两个侧脑室注射2–3 µL的DNA质粒混合物（图1A、C）（根据需要选择）（图2K–L）。
注意：对子宫角施加过大的手指压力可能导致羊膜囊塌陷。 - 用铂金镊电极在适当角度夹住胚胎头部，以靶向目标脑区（本实验中为60°角），并将阴极朝向DNA转移的目标区域。避免挤压子宫，以免导致羊膜囊塌陷（图2M）。
- 使用方波脉冲发生器施加5次脉冲，每次35 mV，脉冲间隔600 ms，持续时间为50 ms。
- 若已对两个侧脑室均进行注射，则重复步骤6.5–6.6，将阴极和阳极位置相对于之前对称翻转，以靶向对侧皮层。
- 对所有需要处理的胚胎重复步骤6.3–6.6。
- 完成所有目标胚胎的电穿孔后，使用浸有生理盐水的棉签，轻柔地将子宫角放回腹腔内。
注意：向腹膜腔内加入生理盐水有助于子宫角顺利复位。 - 使用5-0缝合线缝合肌肉和皮肤切口。使用缝合夹固定伤口，并用碘伏喷雾对缝合部位进行消毒（图2N–P）。
- 对小鼠皮下注射200 µL的5%葡萄糖溶液。
- 对小鼠皮下注射抗生素；注射50 µL的恩诺沙星（5 mg/kg）（参见材料表）。
- 将小鼠放回恢复笼中，并在术后至少20分钟内使用远红外加热灯或加热垫维持其体温（图2Q）。
- 每日监测小鼠状态，并根据机构和联邦指南，在术后注射美洛昔康以缓解疼痛。
- 在手术后第2天（即E17.5）按照步骤4提取胚胎。
7. 大脑组织的提取及在琼脂糖中的包埋
注意：建议在解剖显微镜下进行以下步骤，以获得更高的精确度。避免损伤脑组织对于实验成功至关重要。
- 在解剖罩下的无菌工作环境中设置提取工具（图3A）。
- 使用解剖剪将胚胎的头部与身体其余部分分离。
- 如图3C所示固定头部，然后从头部基部向鼻部沿中线剪开，去除皮肤和颅骨（图3D）。
- 向两侧剥离皮肤和颅骨，形成足够大的开口（约1 cm），以便切除脑组织。
- 为取出脑组织，将无菌解剖剪的闭合尖端从嗅球下方插入，朝脑干方向推进（图3E）。
- 切断脑干，并修剪脑组织周围松散的脑膜（图3F）。
注意：松散的脑膜常导致切片后组织仍附着在琼脂糖块上，从而在收集切片时造成组织从琼脂糖上脱落。 - 对所有胚胎重复步骤7.1–7.6，并将脑组织置于冰上保存（理想情况下不超过30分钟），直至包埋步骤。
注意：以下步骤7.7.1–7.7.4特指E12.5胚胎脑组织的提取。- 如图3G所示，分离眼睛下方的头部顶端部分。
- 沿脑干顶部的虚线所示位置切开皮肤和颅骨（图3H），但不移除脑干。
- 在头部后方做一处2 mm的皮肤-颅骨切口，如图3I所示（参见示意图以明确操作）。
注意：该切口可提供初始抓握点，便于剥离皮肤和颅骨层。通常这两层会一起被剥离。标准切口长度为2 mm，与所用微型弹簧剪刀刃部长度一致。 - 通过固定切口一侧并小心牵拉另一侧，开始剥离皮肤-颅骨层。同样需谨慎操作，继续剥离头部基部组织，直至完全暴露脑组织（图3J）。
注意：此操作必须极为小心，注意避免牵拉过程中带动脑组织。可交替从两侧剥离，以清除覆盖在脑组织上的组织层。
- 将温热的琼脂糖（37–40 °C）倒入3 cm培养皿中。
- 使用带孔小勺夹取脑组织，通过将勺底轻压在干燥的纸巾上吸除多余液体，然后将脑组织放入琼脂糖培养皿中。
注意：必须尽可能去除脑组织周围的液体，以确保琼脂糖与组织之间形成良好的粘附。 - 将含有液态琼脂糖的培养皿置于冰上。使用较小的勺子搅拌琼脂糖10秒，使其均匀冷却。调整脑组织至培养皿中央位置，并将其水平放置，背侧朝上，确保脑组织从各个方向完全被琼脂糖覆盖（图3K）。
注意：脑组织放入琼脂糖后通常会沉至皿底；应使用小勺轻轻抬起脑组织，使其下方形成1–2 mm的间隙。 - 对所有脑组织重复步骤7.8–7.10。
- 待琼脂糖完全凝固后，在琼脂糖块上方加入500 µL HBSS-G溶液以防止干燥，随后用冰覆盖培养皿。
注意：切片前需将样品置于冰上5分钟，使脑组织温度降至4 °C。
8. 器官型脑片培养
注意：使用70%-96%的乙醇清洁振动切片机及周围表面，以避免切片污染。振动切片机工作站的设置（见材料表）如图3B所示。
- 将冷的HBSS-G加入振动切片机缓冲液槽中，并在外槽中加入冰，以在整个操作过程中保持HBSS-G的低温。
- 使用鼓泡石向缓冲液槽中的HBSS-G持续通入碳氧混合气体（carbogen）。
- 使用新刀片在脑组织周围做一个较大的切口（约2 × 2 cm），取出包含脑组织的琼脂糖块，周围需保留足够的琼脂糖，以便将琼脂糖修整成一个小矩形块。
注意：此步骤可调整组织块的角度，使脑的矢状轴垂直于振动切片机的载物台，冠状轴与刀片平行。在脑的背侧保留约5 mm的琼脂糖，以便于切片操作。 - 在样品托中央滴加少量快干型无溶剂超级胶水，并涂抹至能覆盖琼脂糖块底部的范围。
- 轻轻拿起琼脂糖块，用纸巾轻拍底部使其干燥。将琼脂糖块放置在样品托的涂胶区域上，脑的吻端朝上。将样品托置于冰上，静置1分钟使胶水干燥。
- 待胶水完全干燥后，将样品托放入缓冲液槽中。
- 以15°角进行冠状面切片。
注意：切片厚度可根据具体应用调整。本实验中切片厚度为150 µm。修整顶部多余琼脂糖及嗅球时，将振动切片机速度设为1.0–1.5 mm/s；收集用于分析的皮层切片时，将切割速度降低至0.5 mm/s。大多数振动切片机可在切片后暂停，以便逐片收集。若出现切片质量下降或组织从琼脂糖脱落的情况，可尝试降低切割速度或更换刀片。 - 使用洁净的刮铲收集脑切片，并将其放置于聚四氟乙烯（PTFE）膜上，该膜通过石蜡固定于35 mm玻璃底培养皿内（每张膜最多放置五片脑切片）（图3L-M）。
注意：使用石蜡将PTFE膜固定在35 mm玻璃底培养皿内，可在添加切片培养基及成像过程中稳定膜的位置。 - 使用200 µL移液器移除PTFE膜上切片周围的多余HBSS-G，使切片保持半干燥状态。
- 直接向PTFE膜下方空间加入500 µL预热至35 °C的切片培养基。
注意：添加培养基时膜下不得产生气泡，否则会导致部分或全部切片无法进行培养基交换。每2天更换200 µL培养基，或每次成像后更换。 - 将切片在35 °C、5% CO2条件下孵育。
9. 免疫组织化学
- 每皿加入 1 mL 含 4% 蔗糖的 4% 多聚甲醛（PFA）固定组织切片，在室温下孵育 30 分钟。
注意：操作 PFA 时需穿戴实验服和手套，固定步骤应在化学通风橱中进行，并妥善处理 PFA 废液。 - 用 300 µL PBS 洗涤切片两次，每次 5 分钟。将切片转移至 24 孔板中。
注意：实验可在该阶段暂停。向切片中加入含 NaN3 的 PBS 并于 4 °C 保存。NaN3 为有毒化合物，操作含该物质的溶液时需穿戴实验服和手套。步骤 9.3–9.10 需在轨道摇床上进行。 - 用 300 µL 0.1 M 甘氨酸在 4 °C 下对切片进行封闭，过夜。
- 在室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟，以去除甘氨酸。
- 用 300 µL PBS-T 在室温下对切片进行透化处理，持续 2 小时。
- 用含 10% 山羊血清的 PBS-T 在室温下封闭 2 小时。
- 将一抗（抗波形蛋白抗体，稀释比例为 1:200；参见 材料表）用含 10% 山羊血清的 PBS-T 溶液稀释后，加入 300 µL，在 4 °C 下孵育过夜。
注意：在步骤 9.8–9.12 中，需避光操作以防止荧光淬灭。 - 在室温下用 PBS 洗涤一抗 3 次，每次 20 分钟。
注意：此处使用 PBS 而非 PBS-T，以彻底去除 Triton X-100。 - 加入 300 µL 二抗（Alexa Fluor 488 或 647 标记抗体，稀释比例为 1:400；参见 材料表），用 PBS 稀释后在室温下孵育 2 小时。
注意：去除二抗后立即加入 DAPI，稀释比例为 1:10,000，孵育 5 分钟。 - 在室温下用 PBS 洗涤二抗 3 次，每次 20 分钟；再用蒸馏水洗涤 2 次，每次 1 分钟。
- 用细刷将切片转移至载玻片上，然后在 30 °C 下干燥 20 分钟。
- 使用水溶性封片剂封片。将载玻片在室温下放置过夜，使封片剂充分固化。
10. 成像采集
注意：无论采用何种DNA递送方法（IUE或EUE），脑片均在相同的发育阶段（E17.5–E18.5）进行分析。IUE可使神经前体细胞继续分裂并发育两天 体内另一方面，EUE 可用于追踪早期发育事件。
- 打开培养箱孵育器，并将其设置为 35 °C、5% CO₂2-理想情况下在成像前4小时开始，以使显微镜组件在35 °C下达到平衡。
- 对于组织切片的深层成像，应使用水浸物镜，以减少组织与物镜之间折射率的不匹配。
注意：此处使用了超分辨率成像模式。通过聚四氟乙烯（PTFE）膜进行成像时，需要使用长工作距离（约1 mm）的物镜。若无长工作距离物镜，可将切片转移至8孔玻璃底培养皿中。转移切片时，先在膜表面加入1 mL切片培养基，然后用刮铲将切片轻轻抬起，并转移至含有200 µL培养基的孔中。使用1 mL移液枪头吸除多余培养基，使切片保持半干燥状态。 - 为成像轴突生长，选择细胞密度较低至中等的皮层区域。为成像生长锥动态变化，定位位于皮层中间带或室下带的生长锥。
- 在图像处理软件中定义z轴堆栈大小（参见 材料表对于大范围z轴堆栈中的轴突生长，设置步长为2 µm；对于小范围z轴堆栈中的生长锥，设置步长为1 µm。
注意：始终考虑生长锥和轴突在 x、y 和 z 平面上的潜在移动。在器官型培养中，轴突的生长速度远高于在 体外 培养物。此处，约80 µm的z轴堆叠足以成像轴突生长。对于生长锥动态观察，约6 µm的z轴堆叠已足够。 - 为在更大范围内成像神经元轴突生长，定义一个拼接扫描区域。
- 使用尽可能低的激光功率，以最大限度降低成像过程中光漂白生长锥的风险。
- 为观察轴突生长，以5分钟为间隔，连续成像2小时；为观察生长锥动态变化，以2.5至3秒为间隔，连续成像2至5分钟。
11. 数据分析
- 使用速度图测量轴突生长速度
- 通过 文件 > 打开 在 Fiji14 中打开图像文件，并选择图像。
- 通过 图像 > 图像栈 > Z 投影 > 最大强度投影 获得延时图像的最大强度投影。
- 浏览延时图像序列，定位一个正在生长的轴突。
- 定位后，沿生长中的轴突画一条线。从第一帧中轴突的顶端开始，贯穿整个延时序列跟随轴突走向。
- 使用插件 KymoResliceWide 生成速度图。
- 通过进入 图像 > 属性 设置速度图的比例尺。在 像素宽度 中设置以 µm 为单位的距离，在 像素高度 中设置以 s 或 min 为单位的时间。
- 进入 分析 > 测量。
注：将给出相对于 x 轴的角度。 - 在电子表格中使用以下公式代入角度计算轴突生长速度：SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ))。
- 使用图像分析软件测量生长锥体积（参见 材料表）。
- 通过 文件 > 打开 在图像分析软件中打开图像文件，并选择目标文件。
- 选择 添加新表面 向导。
注：左下角将出现一个包含六个步骤的区域，用于手动编辑。 - 在步骤 1 的 算法设置 下选择 仅分割感兴趣区域。在步骤 2 中，裁剪帧以使所有帧中的整个生长锥均被包含。
- 在步骤 3 中保持阈值设为 绝对强度，并在步骤 4 中确保整个生长锥区域被正确阈值化。
- 在步骤 5 中，在 滤波类型 下选择 体素数量 lmg = 1。
注：在最后一步中可能会生成多个测量集。此处仅创建了一个用于体积的测量。 - 点击 执行 按钮以完成所有创建步骤，并结束 添加新表面向导。
- 在向导窗口顶部的 统计 选项卡中，选择 详细 选项卡下的 特定值 和 体积。
结果
采用所述方法流程获得的代表性结果如图所示。本演示中使用了E15.5小鼠，但该方案可轻松适用于从E11至E17晚期的几乎所有胚胎发育阶段。在本方案中，可选择使用 子宫外 电穿孔（EUE； 图 2A, 2C-I）或 在子宫内 电穿孔IUE； 图 2B，C，和 2J-Q) 用于将质粒递送至侧脑室壁的前体神经元。这些前体细胞是未来皮层投射神经元（CPN）的来源。15,16质粒混合物用于驱动稀疏神经元特异性表达膜靶向（Lyn）-mNeonGreen图1A）或 LifeAct 增强型 (E)GFP（图1B) 分别用于评估生长锥的整体行为和肌动蛋白动态。此外，使用质粒混合物对单个神经元进行标记，标记物为 turbo(t)-RFP 或 zoanthus sp. (Zs) 绿色荧光蛋白（ZsGreen）图1C）被纳入观察，这有助于监测独立邻近神经元的生长锥行为。
从电转染胚胎中解剖脑组织是获得高质量脑切片、保持脑组织天然结构的关键步骤，需谨慎操作。解剖器械和振动切片机需提前准备，并用乙醇仔细灭菌（图3A，B）。随后，小心解剖电转染胚胎的头部并取出脑组织。此处展示了在E15（图3C-F）和E12.5（图3G-J）进行子宫内电穿孔（EUE）处理的胚胎脑组织代表性解剖过程。脑组织取出后立即包埋于琼脂糖基质中，切片后置于底部为玻璃的培养皿内的聚四氟乙烯（PTFE）膜插入物上进行孵育（图3K-M）。
脑片的健康状态是确保实验结果可靠的关键控制点。每天需进行肉眼检查以排除任何污染。此外，在培养结束后，脑片会被固定并进行免疫组织化学染色。本实验中使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来评估整体细胞排列情况，使用波形蛋白（vimentin）染色来观察胶质细胞的组织结构，特别是放射状胶质细胞（RG）支架的结构。通常情况下，无论是经IUE还是EUE处理后成功培养的脑片，其DAPI染色均显示正常的细胞分布，且放射状胶质细胞排列相对有序，具有朝向顶面并与软脑膜接触的突起结构17（图4A和4B）。然而，偶尔也可在培养的脑片中观察到RG支架明显紊乱的情况，尤其是在经EUE电穿孔处理的样本中（图4C）。RG支架严重紊乱的脑片常表现出神经元迁移障碍和轴突发育缺陷（未展示）。因此，对RG支架结构的检测是一种简便的培养后筛选方法，可用于甄别来自可靠脑片的实验数据。
通过子宫内电穿孔（IUE）或子宫外电穿孔（EUE）将表达Lyn-mNeonGreen质粒混合物导入后获得的脑切片，均可实现相似的稀疏神经元标记。图中展示了一个表达Lyn-mNeonGreen的典型锥体细胞皮层投射神经元及其生长锥动态行为的示例（图 5A 和 补充视频 1， 左上角）。此外，使用表达肌动蛋白探针的质粒标记神经元，以分析轴突生长锥的肌动蛋白动态 原位 (图5B 和 补充视频 1， 左下角 原位 实验还采用了双-Cre/Dre荧光蛋白表达质粒设计（图1C 和 补充视频 1，右侧）。该质粒中的 tRFP 或 ZsGreen 荧光蛋白可分别被邻近神经元中的 Dre 或 Cre 重组酶特异性且独立地激活（图 5C）。这种实验设计能够对对照神经元与邻近的经修饰神经元（特定的功能获得或功能缺失）的生长锥进行并列分析，从而避免因使用不同脑片来测试对照与实验条件所导致的变异性。
从录制的视频生成的明场显微图像序列（kymograph）可进行分析，从而轻松获得诸如随时间变化的突出活动和生长长度等动态生长参数（图6A）。需要注意的是，通过简单调整延时成像的时间分辨率，即可测量轴突延伸速度，持续时间为2 h（图6A）。此外，生长锥体积随时间的变化——作为评估生长锥总体动态活性的一个指标——也可便捷获取，本实验中使用了授权软件进行分析（图6B 和 图6E、F）。该参数可用于评估肌动蛋白踏车运动的速度以及生长锥探索过程中丝状伪足与片状伪足之间的动态平衡。
图 1：本实验方案中所用质粒的示意图。 （A）pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen。（B）p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP。（C）pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA。质粒组件及荧光蛋白来源的相关信息见图中框注部分。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：工作流程 子宫外 和 在子宫内 E15.5小鼠的电穿孔 (A手术站的设置 子宫外 电穿孔。B手术站的设置 在子宫内 电穿孔。C) 将麻醉小鼠的子宫角拉出腹腔外。D从子宫囊中提取胚胎。E通过完全性脊髓横断进行胚胎处死 通过 一条斜切口；注意避免了断头。F将胚胎置于固定装置中，并将DNA/快绿混合物注射到左侧侧脑室。G,H) 将胚胎头部置于铂金镊电极之间，阴极（红色箭头）位于大脑皮层上方 60° 角度。 (I) 将胚胎的臂部（黑色箭头）置于固定器外侧，以防止操作过程中胚胎滑动。J) 胚胎在子宫囊内旋转以暴露头部。K,L通过子宫壁将DNA/快绿混合物注射到胚胎的侧脑室中。M将胚胎头部置于铂镊电极之间，使阴极（红色箭头）位于大脑皮层上方 60° 角度。N缝合的肌肉切口 通过 连续锁边缝合。O缝合的皮肤切口 通过 间断缝合。P使用外科伤口夹固定伤口，并用聚维酮碘进行消毒。Q) 将小鼠放置于恢复笼中，并使用远红外加热灯保暖。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：E15.5 和 E12.5 胚胎脑的提取及器官型脑片培养流程。（A）用于脑组织提取的工具。（B）器官型培养工作站的设置。（C–F）E15.5 胚胎脑的提取过程。（G–J）E12.5 胚胎脑的提取过程。虚线标示切口位置，红色箭头指示镊子牵拉方向。（K）将脑组织包埋于含有 3% 低熔点琼脂糖的 3 cm 培养皿中，使脑下方保留 1–2 mm 的琼脂糖间隙。（L）收集厚度为 150 µm 的脑片。（M）将脑片转移至聚四氟乙烯（PTFE）膜插件上，该插件由石蜡膜（蓝色箭头）固定于 35 mm 培养皿中。红色星号标记表示由振动切片机获得的脑片（L）及其转移至 PTFE 膜的过程（M）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：健康器官型脑片中保守的放射状胶质细胞结构。 E17.5 胚胎脑切片的共聚焦图像，显示经颅内电穿孔（IUE）（A）和胚胎外电穿孔（EUE）（B,C）后放射状胶质细胞排列（波形蛋白，绿色）及整体细胞结构（DAPI，品红色）。注意EUE偶尔可能引起放射状胶质细胞排列的明显紊乱（C）。放大区域对应主图中红色虚线框所示部分：比例尺，10 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图5: 原位 急性器官型脑片中生长锥动态的可视化 (A，B神经元及其相应的生长锥分别以 Lyn-mNeonGreen 和 LifeAct-GFP 标记。红色星号标记表达 Lyn-mNeonGreen 的神经元的生长锥。蓝色星号标记表达 LifeAct-GFP 的神经元的生长锥。C) 利用包含 tRFP（品红色）和 ZsGreen（绿色）的双质粒系统标记的邻近神经元及其相应的生长锥。右侧所示的生长锥图像位于左侧捕获视野之外，图像采集时间紧随生长锥延时成像之后；比例尺， 5 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 6：轴突生长速度与生长锥体积的分析。 （A）表达 Lyn-mNeonGreen 的神经元上的轴突追踪（上图）及其使用 ImageJ 生成的相应线扫图（下图）。（B）使用图像分析软件对生长锥的 z 层叠视频进行重建（上图），以及使用表面测量工具高亮显示的同一生长锥（下图）。（C）显示多根轴突随时间变化的生长速度曲线图。（D）图（C）中轴突的平均生长速度的量化结果。（E）显示生长锥体积随时间变化的曲线图。（F）图（E）中生长锥平均体积的量化结果；比例尺，5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：锥体皮层神经元的放射状迁移与神经元极化。 示意图展示正在发育的锥体皮层神经元（粉色）从生发性脑室区（VZ）沿放射状胶质细胞突起（灰色）向软脑膜表面进行放射状迁移。迁移过程中，具有极性的神经元形成前端突起（未来的树突）和尾端突起（未来的轴突），并持续向中间带（IZ）延伸。红色虚线框表示成像所观察的皮层区域，具体位于中间带（IZ）、脑室下区（SVZ）或轴突束汇合处（绿色）。该插图使用基于网络的绘图工具 BioRender.com 制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 质粒 | 浓度 (µg/µL) | 预期用途 |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | 0.25 | 标记膜定位蛋白（Lyn） |
| + | + | |
| p-Tub-alpha-1-iCre | 0.08 | |
| p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | 0.125 | 生长锥中丝状肌动蛋白（F-actin）标记 |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | 1 | 对相邻的两群神经元进行独立标记 |
| + | + | |
| p-Tub-alpha-1-iCre | 0.004 | |
| + | + | |
| p-Tub-alpha-1-Dre | 0.2 |
表1：本实验方案中使用质粒的列表。 各质粒的名称、浓度及其预期用途。
补充视频 1：急性器官型脑片中生长锥动态的原位可视化。 使用 Lyn-mNeonGreen（左上）和 LifeAct-GFP（左下）标记的生长锥动态。相邻的生长锥通过包含 tRFP（品红色；右上）和 ZsGreen（绿色；右下）的双质粒系统进行差异标记。成像时间间隔为 2.5 秒。比例尺为 5 µm。请点击此处下载该文件。
讨论
生长锥如何感知其周围环境并作出反应，以协调轴突的同步延伸与导向，目前仍存在争议3,18在二维基质上的开创性研究揭示了轴突形成、生长和导向过程中驱动生长锥动态变化的力所产生的基本分子机制2,10,11,12,19. 最近在三维基质中的研究表明，第三个维度对生长锥的行为以及轴突生长具有多大的影响8,9然而，指导生长锥动态的复杂机制 体内 仍有待深入研究。
制备IUE或EUE脑组织的器官型脑片培养已被广泛使用并有充分文献记录。该技术已成为研究活体脑组织中神经元发育与行为的金标准20,21。事实上，该方法已成功结合多种高分辨率成像技术，用于原位可视化特定的分子过程和形态学事件in situ。此类研究包括但不限于轴突的形成与延伸19,22、皮层神经元迁移19,22,23,24、中心体动态25,26、微管动态27，以及突触前和突触后区室的功能动态28,29。
该方案填补了实验神经生物学领域的一项空白，实现了对发育中皮层神经元生长锥动态的可视化观察 原位，在 离体 急性脑切片培养，以及用于分析所获数据的工具。
急性脑切片培养被用于建立本方案，因为它们（1）经过一定练习后易于制备；（2）提供了一个便于研究嵌入于组织中的生长锥的可及性系统 准-完全地-生理环境，同时具有足够的透明度以实现高分辨率的活细胞成像；（3）可扩展用于多种转基因小鼠品系；（4）结合宫内电转染（IUE）或胚胎外电转染（EUE），几乎可无限拓展分子工具的递送能力，用于评估生长锥和轴突的功能表现 体内 在功能缺失/获得条件下，结合荧光报告基因和细胞骨架探针。
该方法学在电穿孔胚胎脑室（EUE）和宫内电穿孔（IUE）两种背景下均有描述。尽管EUE仍是一种高度可靠的方法，但与采用IUE作为递送方式相比，使用EUE导致获得的脑切片中放射状胶质细胞（RG）网络紊乱的发生率升高（图4C）。RG结构排列的紊乱会显著影响神经元迁移以及轴突延伸的模式30,31。这些是预测在特定时间点何处可找到用于分析的轴突、以及轴突所处微环境类型的关键参数。RG网络显著受损的脑切片通常表现出皮层神经元层状结构形成障碍，进而导致轴突走向混乱。因此，强烈建议对RG网络的结构完整性进行评估和控制。值得注意的是，结构完整性较差与胚胎脑组织年龄增加相关。事实上，在较年轻的E12.5-E13.5胚胎中通常未观察到此类效应19。
本方案详尽且易于操作。然而，为获得最佳结果，有几个关键步骤必须格外谨慎并加以注意。这些步骤已在方案中明确指出，包括：（1）调整电穿孔时所用DNA的用量以实现稀疏标记；（2）在脑组织提取过程中避免损伤；（3）控制包埋脑组织时琼脂糖的温度；（4）针对特定年龄的脑组织调试最适琼脂糖浓度；以及（5）荧光染料的选择，相关经验如下所述。在方案优化过程中，对多种荧光染料在活细胞中的性能进行了评估 原位 成像测试中，本方案选用单体GFP变体EGFP和NeonGreen用于制备LifeAct标记和Lyn标记的质粒（图 5A，B）。此外，还测试了RFP变体mScarlet，发现其在此实验体系中非常适用（数据未显示）。多聚体tRFP（二聚体）和ZsGreen（四聚体）（图5C 和 补充视频 1， 右侧）也进行了测试。当方法要求在DNA递送后快速产生荧光信号时，推荐使用这些快速折叠且超亮的荧光蛋白。
在使用脑片培养时，常见的做法是利用来自不同大脑的脑片来测试对照和实验条件，这会带来固有的、不必要的变异性。本文采用了一种表达系统，可对相邻神经元进行独立修饰，并通过报告基因表达实现细胞识别。需要注意的是，在本示例中（图5C），表达两种不同荧光蛋白的神经元之间并无差异。然而，举例而言，将此类质粒混合物与携带Cre敏感基因的转基因小鼠品系结合使用时，tRFP（Dre敏感）将标记保持为野生型的神经元，而ZsGreen（同样为Cre敏感）则标记发生基因重组的神经元。因此，可在同一脑片内同时并列研究两种不同基因型（以及可能的不同表型）的生长锥。
用于分析的轴突和生长锥的定位是一个重要考虑因素。皮层神经元在从脑室区（VZ）向皮层板（CP）进行放射状迁移的过程中发生极化。在此过程中，神经元形成一个前端突起（未来的树突）和一个将发育为轴突的尾端突起，最终这些尾端突起会加入中间区（IZ）中的先锋轴突，建立轴突束32。因此，为了捕获轴突生长锥，成像操作在IZ区的轴突纤维上进行，包括从CP区延伸出的轴突以及早期生成且已与轴突束相关联的轴突；或者最终，在横穿IZ区并延伸至其下方的纤维中进行（图7）。
本方案使得在器官型脑片中对神经元进行超分辨率成像成为可能。传统上，对较厚样本成像时，光散射是一个显著问题。在过去的二十年中，光学技术取得了广泛进展，使得对厚样本的成像成为可能。本研究中使用了长工作距离物镜，以更好地观察生长锥等较小结构。不可避免的是，本方案无法捕捉到逆行性肌动蛋白流或微管动力学等更精细的事件。长工作距离物镜需要较低的数值孔径（NA），但能够保留来自厚切片的信息。然而，该方案也可适配于工作距离较短的物镜。这需要将脑片平稳转移至玻璃底培养皿中，以保持结构完整性。但采用此方法会导致存活时间缩短——约15小时——这是由于气体交换丧失所致（数据未显示）。与二维培养不同，三维环境中的生长锥占据更大的体积，且需要在z轴方向进行运动伪影校正。为了增强对精细事件的成像能力，必须采用现代共聚焦技术。因此，建议使用快速扫描的z轴堆栈电机，例如高灵敏度共聚焦显微镜上配备的z-Galvo系统33。
值得注意的是，本方案存在三个主要局限性。首先，通常难以控制任何给定质粒的表达水平/表达细胞数量 体内这会导致即使在保持相同质粒浓度的情况下，所有切片之间仍存在变异性。因此，必须预先谨慎选择所用表达载体中的调控元件。其次，目前尚无法利用膜插件对精细事件进行成像。这一限制可通过前一段中提出的方法学改进加以克服。最后，生长锥对光极为敏感，容易迅速发生光漂白。因此，使用激光扫描显微镜对生长锥进行频繁成像，即使仅持续5分钟，也常常导致生长锥塌陷。在这方面，可采用基于光片显微技术的新型成像设备，以实现对脑切片的长期成像34.
此类方案有望开辟新的研究途径，使人们能够更深入地理解生长锥识别并响应复杂信号所需的关键因素 在体 环境，更重要的是，揭示这种复杂相互作用的机制。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Maria Eugenia Bernis 为实验操作拍摄照片。同时感谢 Emily Burnside、Emily Handley、Thorben Pietralla、Max Schelski 和 Sina Stern 对稿件的阅读与讨论。我们衷心感谢出色的技术助理 Jessica Gonyer、Blanca Randel 和 Anh-Tuan Pham。感谢德国神经退行性疾病中心（DZNE）光学显微镜平台和动物实验设施提供的宝贵支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG）、国际截瘫研究基金会（IRP）以及 Wings for Life（资助对象：F.B.）提供资助。F.B. 是卓越集群 ImmunoSensation2、SFBs 1089 和 1158 的成员，并获得 Roger De Spoelberch 奖。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | 山羊抗小鼠 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | 山羊抗小鼠 |
| 抗波形蛋白抗体 | sigma-奥德里奇 | V2258-.2ML | 单克隆小鼠，克隆株 LN-6，腹水液 |
| B27添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| 聚维酮碘 | B. Braun | 3864154 | |
| Biozym Sieve GP 琼脂糖 | Biozyme | 850080 | |
| Braunol，喷雾剂ühflasche | B. Braun | 3864073 | |
| 布托啡诺（Temgesic） | GEHE Pharma | 345928 | |
| DAPI | sigma-奥德里奇 | D9542 | |
| DMZ 通用电极拉制仪 | Zeitz | NA | |
| 电动剃须刀 | 安第斯山脉 | NA | ProClip UltraEdge Super 2速型号 |
| 恩诺沙星（Baytril） | 拜耳 | 3543238 | 2.5%（wt/vol） |
| Eppendorf 微量移液器加载吸头 | FischerScientific | 10289651 | |
| 快绿 FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | 染料含量 ≥ 85 % |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 10500064 | |
| Fiji 2.1.0 | 美国国立卫生研究院 | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| 精细剪刀 | 精细科学工具 | 14058-09 | ToughCut/直刃/9厘米 |
| FluoroDish 细胞培养皿 | 世界精密仪器公司 | FD5040-100 | |
| Fluoromount 水性封片介质 | sigma-奥德里奇 | F4680-25ML | |
| 葡萄糖 | MedPex | 3705391 | 5% |
| GlutaMAX 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025092 | 钙，镁，无酚红 |
| 马血清 | Pan-Biotech | P30-0711 | |
| Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
| 异氟烷 | Virbac | NA | |
| 等渗盐水溶液 | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
| Leica VT1200 S 振动切片机 | Leica | 14048142066 | |
| LSM 880 配备 Airyscan | Zeiss | NA | |
| 美达佳 | Venusberg 药房 | 8890217 | 5 mg/ml |
| 小鼠 | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
| 微型阿德森镊子 | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| 微量移液器储存罐 | 世界精密仪器公司 | E210 | 16.16.27 |
| Microsoft Excel | 微软 | NA | https://www.microsoft.com/zh-cn/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
| Millicell 细胞培养小室 | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 毫米，亲水性聚四氟乙烯，0.4 µm |
| Moria 穿孔勺 | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
| Neurobasal 培养基（不含酚红） | 赛默飞世尔科技 | 12348017 | |
| Neuropan-2 补充剂 | Pan-Biotech | P07-11010 | |
| 正常山羊血清 | Abcam | ab138478 | |
| Olsen-Hegar持针器配剪刀 | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| p-Tub-α-1-Dre | Addgene | 133925 | |
| p-Tub-α-1-iCre | Addgene | 133924 | |
| p-Tub-α-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| 多聚甲醛 | sigma-奥德里奇 | P6148 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| PicoNozzle Kit v2 | 世界精密仪器公司 | 5430-ALL | |
| 铂金镊子电极 | 哈佛仪器 | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
| QIAGEN Maxi 试剂盒 | QIAGEN | 12162 | |
| 反射性伤口闭合夹 | 世界精密仪器公司 | 500344-10 | 7 mm |
| Pattex 迷你三件装瞬间胶 | Lyreco | 4722659 | |
| 方波电穿孔系统 ECM830 | 哈佛仪器 | W3 45-0052 | |
| 无菌纱布 | Braun Askina | 9031216 | |
| 无菌润滑眼膏 | Bayer Vital | PZN1578675 | |
| 无菌外科手套 | Sempermed | 14C0451 | |
| 蔗糖 | Roth | 4621.2 | |
| Supramid 5-0 外科丝线缝合线 | B. Braun | NA | |
| 薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 万纳斯弹簧剪 | 精细科学工具 | 15000-03 | |
| µ-8 孔玻璃底板 | Ibidi | 80827 |
参考文献
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