Method Article

使用比率指标对原代神经元中的线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行实时成像

DOI:

10.3791/63073

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October 20th, 2021

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1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

In This Article

Summary

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本文介绍了一种方案，用于使用共聚焦活显微镜确定原代海马和皮质神经元中基底氧化还原状态和氧化还原反应的差异。该协议可以应用于其他细胞类型和显微镜，只需最少的修改。

Abstract

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线粒体氧化还原稳态对神经元的活力和功能很重要。虽然线粒体含有几种氧化还原系统，但高度丰富的硫醇二硫化物氧化还原缓冲液谷胱甘肽被认为是抗氧化防御的核心参与者。因此，测量线粒体谷胱甘肽氧化还原电位提供了有关线粒体氧化还原状态和氧化应激的有用信息。戊二醇1-roGFP2 （Grx1-roGFP2） 是一种基于遗传编码的绿色荧光蛋白 （GFP） 的谷胱甘肽氧化还原电位比率指标，在 400 nm 和 490 nm 处具有两个氧化还原状态敏感的激发峰，在 510 nm 处具有单个发射峰。本文介绍了如何在原代海马和皮质神经元中对线粒体靶向Grx1-roGFP2进行共聚焦实时显微镜检查。它描述了如何评估稳态线粒体谷胱甘肽氧化还原电位（例如，比较疾病状态或长期治疗）以及如何测量急性治疗时的氧化还原变化（以兴奋性毒性药物 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）为例）。此外，本文还介绍了Grx1-roGFP2和线粒体膜电位指示剂四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的共同成像，以证明Grx1-roGPF2如何与其他指标进行多参数分析。该协议详细说明了如何（i）优化共聚焦激光扫描显微镜设置，（ii）应用药物进行刺激，然后用二酰胺和二硫甲状腺素进行传感器校准，以及（iii）使用ImageJ / FIJI分析数据。

Introduction

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几种重要的线粒体酶和信号传导分子受到硫醇氧化还原调节1。此外，线粒体是活性氧的主要细胞来源，并且选择性地容易受到氧化损伤2。因此，线粒体氧化还原电位直接影响生物能量、细胞信号传导、线粒体功能，并最终影响细胞活力3，4。线粒体基质含有大量（1-15 mM）的硫醇二硫化物氧化还原缓冲谷胱甘肽（GSH），以维持氧化还原稳态并建立抗氧化防御5，6。GSH可以共价附着在靶蛋白（S-谷胱甘氨酸化）上以控制其氧化还原状态和活性，并被一系列减少氧化蛋白的解毒酶使用。因此，在研究线粒体功能和病理生理学时，线粒体谷胱甘肽氧化还原电位是一个高度信息性的参数。

roGFP2是GFP的一种变体，通过添加两个表面暴露的半胱氨酸而变得氧化还原敏感，形成人造二硫醇 - 二硫醚对7，8。它在~510nm处具有单个发射峰，在~400 nm和490 nm处具有两个激发峰。重要的是，两个激发峰的相对振幅取决于roGFP2的氧化还原状态（

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Protocol

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所有动物实验均符合国家和机构指南，包括欧洲议会理事会指令2010/63 /EU，并已获得内政部的完全道德批准（海德堡大学动物福利办公室和卡尔斯鲁厄Regierungspraesidium，许可证T14 /21和T13/21）。根据标准程序从新生小鼠或大鼠幼崽中制备原代海马和皮质神经元，并如前所述维持12-14天13。

1. 溶液的制备

  1. 成像缓冲液的库存解决方案
    1. 根据 表1 准备每种储备溶液，并将其保持在4°C。 对于长期储存（>3个月），将等分试样保存在-20°C。
元件兆瓦浓度（M）量（g）容积（毫升）
氯化钠58.44
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Results

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生长因子戒断后稳态线粒体氧化还原状态差异的定量分析
为了证明线粒体氧化还原状态稳态差异的定量，在成像前将标准培养基中生长的原代神经元与没有生长因子培养48小时的神经元进行比较。生长因子戒断导致72小时16后凋亡神经元细胞死亡。在48小时后对细胞进行成像，以测试在此之前是否在线粒体氧化还原状态发生变化。在聚L-鸟氨酸包被盖玻片上生长的原代大鼠皮质神经元在 体外 第6天（DIV6）上感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2，并在DIV12上成像。根据该协议的第4节，在配备40x / 1.10水浸物镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜上在室温下进行实时成像。共聚焦设置为针孔7通风单元，像素大小568.7nm（512 x 512像素），扫描速度600 Hz，激光功率405 nm 3%，激光功率488 nm 1%，发射带宽505-550 nm和帧平均4。两种条件的原始405:488nm比值之间没有显着差异（图3B）。数据归一化后，在生长因子戒断组中可检测到具有增加的405:488nm比.......

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Discussion

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线粒体氧化还原状态的定量和动态测量提供了有关线粒体和细胞生理学的重要信息。有几种荧光化学探针可用于检测活性氧，"氧化还原应激"或"氧化应激"。然而，后一术语没有明确界定，往往缺乏特异性9，17，18。与化学染料相比，Grx1-roGFP2具有几个优点9，19:（i）作为激发比传感器，它为传感器表达水平，绝对荧光强度和细胞或细胞器密度提供了固有的归一化;（ii）作为遗传编码探针，它可以靶向细胞器或特定的亚细胞区室，如突触前末端或突触后树突棘;（iii）传感器的遗传表达消除了对染料负载的需求，在化学染料的情况下，这可能对原代神经元造成压力;（iv）与一般的氧化还原敏感化学染料相比，Grx1-roGFP2对谷胱甘肽氧化还原电位具有高度特异性;（v）传感器的氧化和还原是可逆的，能够测量瞬态氧化还原变化;（vi）与仅允许检测相对变化的化学染料相比.......

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Disclosures

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作者声明他们没有利益冲突。

Acknowledgements

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这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（BA 3679/5-1;对于 2289:BA 3679/4-2）。A.K.由ERASMUS +奖学金支持。我们感谢Iris Bünzli-Ehret，Rita Rosner和Andrea Schlicksupp准备了原代神经元。我们感谢Tobias Dick博士提供pLPCX-mito-Grx1-roGFP2。 图4 所示的实验是在海德堡大学尼康成像中心进行的。 图2 是用 BioRender.com 准备的。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<强>试剂
氯化钙 （CaCl2·2H2O）Sigma-AldrichC3306
二酰胺 （DA）Sigma-AldrichD3648
二硫苏糖醇 （DTT）Carl Roth GmbH6908.1
葡萄糖（2.5 M 储备溶液）Sigma-AldrichG8769
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
甘氨酸neoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES（1 M 储备溶液）Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
氯化镁 （MgCl2·6H2O）Sigma-Aldrich442611-M
N-甲基-D-天冬氨酸酯（NMDA）Sigma-AldrichM3262
钾（KCl）Sigma-AldrichP3911
钠（NaCl）neoFroxx GmbHLC-5932.1
酮酸钠（0.1 M储备溶液）Sigma-AldrichS8636
丙酮酸钠Sigma-AldrichP8574
蔗糖Carl Roth GmbH4621.1
四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）Sigma-Aldrich87917
设备
成像室Life Imaging Services（瑞士巴塞尔）10920Ludin室类型 3 for &奥斜杠;12mm 盖玻片
激光扫描共聚焦显微镜，徕卡DMI6000
激光扫描共聚焦显微镜，扫描装置徕卡SP8
蠕动泵VWRPP1080 181-4001
转盘共聚焦显微镜，相机滨松C9100-02 EMCCD
转盘共聚焦显微镜，孵化系统TokaiHitINU-ZILCF-F1
转盘共聚焦显微镜，显微镜尼康Ti
转盘共聚焦显微镜，扫描装置横川CSU-X1
software
FIJIhttps://fiji.sc
StackReg 插件
TurboReg 插件https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java
氯化氯化丙显微镜 https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java

References

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  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).

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Mitochondrial Redox StateGlutathione Redox PotentialPrimary NeuronsRatiometric IndicatorConfocal Live MicroscopyGrx1 roGFP2 SensorMitochondrial Membrane PotentialNMDA TreatmentImageJ AnalysisTMRE Co Imaging

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