利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

摘要

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。

摘要

线粒体氧化还原稳态对神经元的存活和功能至关重要。尽管线粒体包含多种氧化还原系统，但含量丰富的硫醇-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽被认为是抗氧化防御的核心组分。因此，测量线粒体谷胱甘肽氧化还原电位可为线粒体氧化还原状态和氧化应激提供有价值的信息。谷氧还蛋白1-红色氧化还原敏感绿色荧光蛋白2（Grx1-roGFP2）是一种基因编码的、基于绿色荧光蛋白（GFP）的比率型谷胱甘肽氧化还原电位指示探针，其在400 nm和490 nm处有两个氧化还原状态敏感的激发峰，在510 nm处有一个单一发射峰。本文介绍了如何对靶向定位于线粒体的Grx1-roGFP2在原代海马和皮层神经元中进行共聚焦活细胞显微成像。文中描述了如何评估稳态下的线粒体谷胱甘肽氧化还原电位（例如用于比较不同疾病状态或长期处理），以及如何测量急性处理引起的氧化还原变化（以兴奋性毒性药物N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）为例）。此外，本文还展示了Grx1-roGFP2与线粒体膜电位指示剂四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的共成像，以说明Grx1-roGFP2如何与其他探针联用，实现多参数分析。本实验方案详细说明了（i）优化共聚焦激光扫描显微镜设置，（ii）施加刺激药物后使用二酰胺（diamide）和二硫苏糖醇（dithiothreitol）对传感器进行校准，以及（iii）使用ImageJ/FIJI软件进行数据分析的具体步骤。

引言

多种重要的线粒体酶和信号分子受到巯基氧化还原调节¹。此外，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，并且对氧化损伤具有选择性易感性²。因此，线粒体的氧化还原电位直接影响生物能量学、细胞信号传导、线粒体功能以及最终的细胞存活能力^3,4。线粒体基质中含有高浓度（1–15 mM）的巯基-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽（GSH），以维持氧化还原稳态并发挥抗氧化防御作用^5,6。GSH可通过共价结合靶蛋白（S-谷胱甘肽化）来调控其氧化还原状态和活性，并被多种解毒酶利用以还原被氧化的蛋白质。因此，在研究线粒体功能与病理生理过程时，线粒体谷胱甘肽氧化还原电位是一个极具信息价值的参数。

roGFP2 是 GFP 的一种变体，通过引入两个暴露于表面的半胱氨酸，形成一个人工的二硫醇-二硫键对，从而使其对氧化还原状态敏感^7,8。它在约 510 nm 处有一个单一发射峰，在约 400 nm 和 490 nm 处有两个激发峰。重要的是，这两个激发峰的相对强度取决于 roG....

方案

所有动物实验均符合国家和机构的指导方针，包括欧洲议会的理事会指令2010/63/EU，并获得了英国国内事务部的完整伦理批准（海德堡大学动物福利办公室和卡尔斯鲁厄政府许可，许可证号T14/21和T13/21）。原代海马和皮层神经元按照标准操作程序从新生小鼠或大鼠幼崽中分离制备，并如前所述培养维持12-14天¹³。

1. 溶液的配制

1. 成像缓冲液的储备液
   1. 根据表1配制每种储备液，并于4 °C保存。如需长期保存（>3个月），可将分装样品置于-20 °C保存。

....

组分	分子量	浓度 (M)	质量 (g)	体积 (mL)
NaCl

结果

生长因子撤除后稳态线粒体氧化还原状态差异的定量分析
为展示线粒体氧化还原状态稳态差异的定量分析，将标准培养基中培养的原代神经元与培养48小时后撤除生长因子的神经元进行比较。撤除生长因子72小时后可导致神经元发生凋亡性细胞死亡。¹⁶细胞在培养48小时后进行成像，以检测线粒体氧化还原状态的变化是否先于该过程。原代大鼠皮层神经元接种于聚-L-鸟氨酸包被的盖玻片上，并在第几天感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2病毒 体外 6（DIV6）并在DIV12进行成像。根据本方案第4节，在配备40x/1.10水镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜上，于室温下进行活细胞成像。共聚焦参数设置为：针孔7个艾里单位，像素大小568.7 nm（512 × 512像素），扫描速度600 Hz，405 nm激光功率3%，488 nm激光功率1%，发射波长范围505–550 nm，帧平均4次。两种条件下原始的405:488 nm比值之间无显著差异图3B）。数据归一化后，在撤除生长因子组中可检测到一部.......

讨论

对线粒体氧化还原状态进行定量和动态测量，可提供有关线粒体和细胞生理的重要信息。目前已有多种荧光探针可用于检测活性氧、"氧化还原应激"或"氧化应激"。然而，后两个术语定义不明确，且常缺乏特异性^9,17,18。与化学染料相比，Grx1-roGFP2具有多项优势^9,19：（i）作为一种激发光比率型传感器，它可对传感器表达水平、绝对荧光强度以及细胞或细胞器密度进行内在归一化；（ii）作为一种基因编码探针，可将其靶向定位至细胞器或特定亚细胞区域，如突触前末梢或突触后树突棘；（iii）传感器的基因表达避免了染料加载步骤，而化学染料的加载可能对原代神经元造成应激；（iv）与普通的氧化还原敏感性化学染料相比，Grx1-roGFP2对谷胱甘肽氧化还原电位具有高度特异性；（v）该传感器的氧化与还原过程可逆，因而能够检测瞬时的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氯化钙 (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306
二胺 (DA)	Sigma-Aldrich	D3648
二硫苏糖醇 (DTT)	Carl Roth GmbH	6908.1
葡萄糖 (2.5 M 储存液)	Sigma-Aldrich	G8769
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
甘氨酸	neoFroxx GmbH	LC-4522.2
HEPES (1 M 储存液)	Sigma-Aldrich	15630-080
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
氯化镁 (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	442611-M
N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)	Sigma-Aldrich	M3262
氯化钾 (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
氯化钠 (NaCl)	neoFroxx GmbH	LC-5932.1
丙酮酸钠 (0.1 M 储存液)	Sigma-Aldrich	S8636
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P8574
蔗糖	Carl Roth GmbH	4621.1
高氯酸四甲基罗丹明乙酯 (TMRE)	Sigma-Aldrich	87917
设备
成像室	Life Imaging Services (巴塞尔，瑞士)	10920	适用于 Ø12 mm 盖玻片的 Ludin Chamber Type 3
激光扫描共聚焦显微镜，显微镜	Leica	DMI6000
激光扫描共聚焦显微镜，扫描单元	Leica	SP8
蠕动泵	VWR	PP1080 181-4001
转盘共聚焦显微镜，相机	Hamamatsu	C9100-02 EMCCD
转盘共聚焦显微镜，培养系统	TokaiHit	INU-ZILCF-F1
转盘共聚焦显微镜，显微镜	Nikon	Ti microscope
转盘共聚焦显微镜，扫描单元	Yokagawa	CSU-X1
软件
FIJI		https://fiji.sc
StackReg 插件		https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg 插件		https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java