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方法文章

利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

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DOI：

10.3791/63073

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2021年10月20日

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。

摘要

线粒体氧化还原稳态对神经元的存活和功能至关重要。尽管线粒体包含多种氧化还原系统，但含量丰富的硫醇-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽被认为是抗氧化防御的核心组分。因此，测量线粒体谷胱甘肽氧化还原电位可为线粒体氧化还原状态和氧化应激提供有价值的信息。谷氧还蛋白1-红色氧化还原敏感绿色荧光蛋白2（Grx1-roGFP2）是一种基因编码的、基于绿色荧光蛋白（GFP）的比率型谷胱甘肽氧化还原电位指示探针，其在400 nm和490 nm处有两个氧化还原状态敏感的激发峰，在510 nm处有一个单一发射峰。本文介绍了如何对靶向定位于线粒体的Grx1-roGFP2在原代海马和皮层神经元中进行共聚焦活细胞显微成像。文中描述了如何评估稳态下的线粒体谷胱甘肽氧化还原电位（例如用于比较不同疾病状态或长期处理），以及如何测量急性处理引起的氧化还原变化（以兴奋性毒性药物N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）为例）。此外，本文还展示了Grx1-roGFP2与线粒体膜电位指示剂四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的共成像，以说明Grx1-roGFP2如何与其他探针联用，实现多参数分析。本实验方案详细说明了（i）优化共聚焦激光扫描显微镜设置，（ii）施加刺激药物后使用二酰胺（diamide）和二硫苏糖醇（dithiothreitol）对传感器进行校准，以及（iii）使用ImageJ/FIJI软件进行数据分析的具体步骤。

引言

多种重要的线粒体酶和信号分子受到巯基氧化还原调节1。此外，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，并且对氧化损伤具有选择性易感性2。因此，线粒体的氧化还原电位直接影响生物能量学、细胞信号传导、线粒体功能以及最终的细胞存活能力3,4。线粒体基质中含有高浓度（1–15 mM）的巯基-二硫键氧化还原缓冲物质谷胱甘肽（GSH），以维持氧化还原稳态并发挥抗氧化防御作用5,6。GSH可通过共价结合靶蛋白（S-谷胱甘肽化）来调控其氧化还原状态和活性，并被多种解毒酶利用以还原被氧化的蛋白质。因此，在研究线粒体功能与病理生理过程时，线粒体谷胱甘肽氧化还原电位是一个极具信息价值的参数。

roGFP2 是 GFP 的一种变体，通过引入两个暴露于表面的半胱氨酸，形成一个人工的二硫醇-二硫键对，从而使其对氧化还原状态敏感7,8。它在约 510 nm 处有一个单一发射峰，在约 400 nm 和 490 nm 处有两个激发峰。重要的是，这两个激发峰的相对强度取决于 roGFP2 的氧化还原状态（图 1），因此该蛋白可作为一种比率型传感器。在 Grx1-roGFP2 传感器中，人源谷氧还蛋白-1（Grx1）被融合至 roGFP2 的 N 末端9,10。将 Grx1 酶共价连接到 roGFP2 上带来了两个主要改进：一是使传感器对 GSH/GSSG 谷胱甘肽氧化还原对具有特异性（图 1），二是使 GSSG 与 roGFP2 之间的平衡速率加快至少 100,000 倍9。因此，Grx1-roGFP2 能够实现对细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的特异性与动态成像。

Grx1-roGFP2 成像可在多种显微镜上进行，包括宽场荧光显微镜、转盘共聚焦显微镜和激光扫描共聚焦显微镜。该传感器在原代神经元中的表达可通过多种方法实现，包括脂质体转染11、DNA/磷酸钙共沉淀12、病毒介导的基因转移，或使用转基因动物作为细胞来源（图2）。本文实验采用包含 AAV1 与 AAV2 衣壳蛋白 1:1 比例的假型重组腺相关病毒（rAAV）13,14。使用该载体时，传感器表达水平通常在感染后 4–5 天达到峰值，并至少稳定维持两周。我们已成功在小鼠和大鼠的原代海马神经元及皮层神经元中应用 Grx1-roGFP2。

本文利用重组腺相关病毒（rAAV）介导的线粒体靶向Grx1-roGFP2在原代大鼠海马和皮层神经元中的表达，评估线粒体基础谷胱甘肽氧化还原状态及其急性扰动。提供了一套共聚焦活细胞成像实验方案，包含详细操作步骤：（i）优化激光扫描共聚焦显微镜设置，（ii）开展活细胞成像实验，以及（iii）使用FIJI软件进行数据分析。

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方案

所有动物实验均符合国家和机构的指导方针，包括欧洲议会的理事会指令2010/63/EU，并获得了英国国内事务部的完整伦理批准（海德堡大学动物福利办公室和卡尔斯鲁厄政府许可，许可证号T14/21和T13/21）。原代海马和皮层神经元按照标准操作程序从新生小鼠或大鼠幼崽中分离制备，并如前所述培养维持12-14天13。

1. 溶液的配制

  1. 成像缓冲液的储备液
    1. 根据表1配制每种储备液，并于4 °C保存。如需长期保存（>3个月），可将分装样品置于-20 °C保存。
组分分子量浓度 (M)质量 (g)体积 (mL)
NaCl58.44514.6150
KCl74.5531.125
MgCl2·6H2O203.31.925
CaCl2·2H2O147.0111.4710
甘氨酸75.070.10.37550
蔗糖342.31.525.6750
丙酮酸钠110.040.10.5550
HEPES238.3111.950
葡萄糖180.152.545100

表1：成像缓冲液的储备溶液。

  1. 药物和染料的储备液
    1. 将二胺（DA；用于最大405:488比率的校准）溶于水中，配制成0.5 M的储存液（例如，1 g溶于11.615 mL水中）。分装后于-20 °C保存20 °C.
    2. 将二硫苏糖醇（DTT；用于校准最小405:488比值）溶于水，配制成1 M的储备液（例如，5 g溶于32.425 mL水中）。分装后于-20 °C保存。20 °C 最长为3个月。
    3. 溶解 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA；用于诱导兴奋性毒性及线粒体氧化）溶于水，配制成10 mM的储备液（例如，25 mg溶于16.991 mL水中）。将分装样品储存于-20 °C. 用于长期保存（>6 个月），将等分试样保存在 -80 °C.
    4. 高氯酸四甲基罗丹明乙酯（TMRE；一种线粒体膜电位的小分子指示剂）
      1. 将TMRE粉末溶于甲醇中，配制成20 mM的储存液（例如，25 mg溶于2.427 mL甲醇中）。
      2. 将20 mM的储备液用甲醇按1:1,000比例稀释，以获得所需溶液 20 µM 储备液
      3. 分装 20 mM 和 20 µM 储备液，用 Parafilm 封口，避光保存于 -20 °C.
        注意：两种储存液均可稳定保存数年。使用1,000倍浓缩储存液（20 µM用于实验。
  2. 成像缓冲液
    1. 通过加入成像缓冲液的所有组分来制备 100 mL 成像缓冲液 表 2 加入80 mL无菌水至量筒中。用无菌水定容至100 mL。轻轻振荡量筒混匀，直至溶液呈现均匀状态。
      注意：建议使用渗透压计检测缓冲液的渗透压，应尽可能接近细胞的培养基渗透压。此处为315 mOsmol/L。根据需要调整蔗糖浓度，使成像缓冲液与培养基的渗透压相匹配。
    2. 调节pH至7.4。分装后保存于 4 °C 长达两周。如需长期保存，请将分装样品置于 -20 °C使用前让成像缓冲液达到室温。
组分储存液浓度 (M)终浓度 (mM)体积 (mL)
NaCl51142.3
KCl35.290.176
MgCl21.910.053
CaCl2120.2
Glycine0.10.0050.005
Sucrose1.5523.5
Sodium pyruvate0.10.50.5
HEPES1101
Glucose2.550.2

表2：成像缓冲液的组成。 表中所示体积用于配制100 mL成像缓冲液。

  1. 刺激与校准用溶液
    注意：每次实验前，将指定药物的储备液加入成像缓冲液中，现配现用。在实验过程中，将依次向成像室中添加刺激与校准用溶液（见第3-5步）。根据实验类型的不同，需配制不同的溶液，以确保在成像室的最终体积中达到相同的终浓度。
    1. 通过将63 µL的10 mM NMDA储备液加入6.937 mL成像缓冲液中，配制3x NMDA溶液（90 µM；成像室中的终浓度：30 µM）。向成像室中加入500 µL该溶液（最终体积：1.5 mL）。
    2. 通过将14 µL的0.5 M DA储备液加入6.986 mL成像缓冲液中，配制用于第3和第4步的2x DA溶液（1 mM；成像室中的终浓度：0.5 mM）。向成像室中加入1 mL该溶液（最终体积：2 mL）。
    3. 通过将28 µL的0.5 M DA储备液加入6.972 mL成像缓冲液中，配制用于第5步的4x DA溶液（2 mM；成像室中的终浓度：0.5 mM）。向成像室中加入500 µL该溶液（最终体积：2 mL）。
    4. 通过将45 µL的1 M DTT储备液加入8955 µL成像缓冲液中，配制1x DTT溶液（5 mM；成像室中的终浓度：5 mM）。吸除成像缓冲液后，向成像室中加入1 mL该溶液（最终体积：1 mL）。

2. 使用 TMRE 对细胞进行负载

注意：在本实验方案中，TMRE 以非淬灭模式15使用，终浓度为 20 nM。通常应使用在所选显微镜下仍能提供足够信号强度的最低 TMRE 浓度。由于长时间原代培养中蒸发不均，不同孔中的培养基体积可能存在差异。为确保各孔中 TMRE 浓度一致，切勿将 TMRE 直接加入各孔中。而应将每孔中的培养基更换为等量含 TMRE 的新鲜培养基。以下方案适用于置于 24 孔板中的原代神经元，每孔含约 1 mL 培养基。

  1. 在组织培养超净工作台中操作，从每个孔中收集 500 µL 培养基至一个共用的锥形管中。
  2. 每孔向该锥形管中加入 0.5 µL 的 20 µM TMRE 储存液（例如，24 孔板共需 12 µL）。
  3. 小心吸去第一孔中剩余的培养基，并替换为 500 µL 含 TMRE 的培养基；随后逐孔对剩余各孔进行相同操作。
    注意：注意避免细胞干燥，同时不要扰动细胞。
  4. 将细胞放回培养箱中，孵育至少 60 分钟，以确保染料充分平衡。
    注意：染料加载时间可延长至数小时，不会产生不良影响。
  5. 为确保整个成像实验过程中 TMRE 浓度一致并充分平衡，需在成像缓冲液及所有刺激溶液中维持 20 nM 的终浓度 TMRE。

3. 共聚焦显微镜扫描参数的优化

注意：此步骤旨在活体成像过程中在图像质量与细胞活性之间找到最佳平衡。本节描述 roGFP 成像参数的优化过程。如果进行多参数成像，则需要对其他指示剂进行类似的优化，包括确认基线稳定，且无漂白或光毒性迹象。 

  1. 启动共聚焦显微镜，并加载GFP成像的标准设置（488 nm 激发，505 - 550 nm 发射).
  2. 设置 将检测器设置为 12 位 或 16 位.
    注意：通常，8 位不足以满足定量成像的需求。
  3. 激活 逐序扫描 模式并添加 第二序列/轨道 (405 nm 激发，505 - 550 nm 发射).
  4. 对于两个通道，选择一个 伪彩色查找表 这表示过曝和欠曝的像素（例如， GLOW OU).
  5. 选择适合目标物体的物镜。
    注意：10x-40x 适用于单细胞分析，63x-100x 适用于单个线粒体分析。
  6. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入 1 mL 成像缓冲液，并将成像室置于显微镜上。
  7. 使用目镜和透射光聚焦细胞。
    注意：不要使用落射荧光光源定位和聚焦细胞。即使在低强度下，这也会对细胞产生不利影响。
  8. 以不同的像素格式记录图像。根据这些图像，选择能够清晰显示目标结构的最低像素数。
    注：通常，使用20倍和40倍物镜进行单细胞成像时，512 × 512像素的分辨率效果良好；使用63倍物镜进行单个线粒体成像时，1024 × 1024或2048 × 2048像素的分辨率通常效果更佳。
  9. 使用不同针孔尺寸记录图像。根据这些图像，选择能够提供目标结构可接受分辨率的最大针孔尺寸。
    注：通常，3-7 个 airy 单位效果较好。
  10. 使用不同激光强度记录图像。
    1. 相应调整检测器的增益和阈值。根据这些图像，选择能够产生可接受信号强度和信噪比的最低激光强度。
      1. 为确定信噪比，需测量包含细胞或线粒体的感兴趣区域（ROI1）以及不含细胞或线粒体的感兴趣区域（ROI2）中的信号强度，然后将ROI1的强度除以ROI2的强度。
        注意：目标是达到信噪比 >3 和单个 ROI 的信号强度在 405 nm 激发条件下（激光功率 1-3%）为 200-1,000，在 488 nm 激发条件下（激光功率 1%）为 300-1,500。
  11. 以不同的扫描速度和帧平均数采集图像，每种参数组合采集4-5幅图像。根据这些图像序列，选择能够提供可接受的图像噪声和图像间变异性的最高扫描速度和最低平均次数设置。
    注：在大多数情况下，600 Hz 的扫描速度以及 1-2 帧的平均设置效果良好。
  12. 使用新的盖玻片，采用优化的设置记录延时成像序列。
    注意：该序列的持续时间与图像采集间隔应与计划进行的实验相似。
  13. 延时成像结束后，向记录室中加入1 mL 2x DA溶液。继续成像2分钟。
  14. 使用蠕动泵或手持移液器吸去成像缓冲液。加入 1 mL 1x DTT 溶液。继续成像 5 分钟。
  15. 分析延时实验（见第5节）。
    1. 验证在使用优化设置进行DA和DTT处理期间，两个通道均未出现曝光过度或曝光不足的情况。
    2. 确保在延时记录过程中，两个通道均未出现明显的荧光漂白现象；目标是 <首幅与末幅图像之间强度损失2%。
    3. 验证在成像过程中405:488比率未发生显著变化。
  16. 以若干盖玻片重复整个操作流程，逐步迭代，直至确定能够持续获得理想结果的实验条件。

4. 基础氧化还原状态的评估

  1. 启动显微镜，并加载第3节中的优化设置。
  2. 将帧平均设置为3-5。
  3. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入1 mL成像缓冲液，并将成像室放置在显微镜上。
  4. 使用目镜和透射光对细胞进行聚焦。
    注意：请勿使用落射荧光光源来定位或聚焦细胞。即使在低功率下，这也会对细胞产生不利影响。
  5. 切换至扫描模式，并使用488 nm通道的实时预览功能来聚焦并定位待成像的细胞。
  6. 使用多点采集功能在盖玻片上选择3-5个视野。
  7. 记录一幅基线图像。
  8. 向成像室中加入1 mL的2x DA溶液。
  9. 在1、2和3分钟时，使用实时预览确认或调整焦距，然后记录图像。
    注意：细胞通常在2分钟后完全氧化。
  10. 将成像室中的缓冲液更换为1 mL的1x DTT溶液。
  11. 在3和5分钟时，使用实时预览确认或调整焦距，然后记录图像。
    ​注意：细胞通常在4-5分钟后完全还原。

5. 急性处理的活体成像

注意：以下方案描述了线粒体氧化还原反应在NMDA处理下的成像过程。对于其他处理方式，可能需要调整实验的成像时间间隔和持续时间。

  1. 启动显微镜，并加载第 3 节中的优化设置。
  2. 将时间间隔设为30 s，持续时间设为25 min。
  3. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入 1 mL 成像缓冲液，然后将成像室放置在显微镜载物台上。
    注意：为避免热漂移导致的焦点偏移，在开始时间序列成像前，应将细胞在显微镜载物台上静置 10–15 分钟。
  4. 使用目镜和透射光对细胞进行聚焦。
    注意：请勿使用落射荧光光源来定位或聚焦细胞。即使在低强度下，这也会对细胞产生不利影响。
  5. 切换至扫描模式，并在实时预览中使用488 nm 通道对细胞进行聚焦和定位。
  6. 可选：为增加每次运行中记录的细胞数量，可使用多点功能对每张盖玻片采集 2–3 个视野。
  7. 开始时间序列采集，并记录 5 幅图像作为 2 分钟的基础值记录。
  8. 向成像室中加入 500 µL 的 3× NMDA 溶液（终浓度为 30 µM），并继续记录 20 幅图像，作为 10 分钟的 NMDA 反应记录。
    ​注意：神经元对渗透压变化极为敏感。因此，务必尽量减少成像缓冲液的蒸发。对于较长时间的处理，应使用盖子覆盖成像室。
  9. 向成像室中加入 500 µL 的 4× DA 溶液，并再记录 6 幅图像（最长 3 分钟校准）。
  10. 吸除成像室中的缓冲液，替换为 1 mL 的 1× DTT 溶液。再记录 10 幅图像（最短 5 分钟校准）。
  11. 结束记录，并保存图像序列。

6. 数据分析

  1. 在 FIJI 中进行数据导入与图像预处理
    1. 使用 Bio-Formats 导入器 打开第 4 步的一组图像或第 5 步的单个图像文件。点击 插件 | Bio-Formats | Bio-Formats 导入器。在弹出的对话框中，选择 以超堆栈形式查看：Hyperstack，设置 颜色模式：默认，勾选 自动缩放，且不将图像拆分为独立窗口。
      注意：自动缩放 仅优化数据在计算机屏幕上的显示效果，不会改变像素的实际强度值。
    2. 若打开了第 4 步中的单个图像，请点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接，将其合并为单一图像堆栈。
    3. 若图像序列中存在 XY 方向漂移，请点击 插件 | StackReg 对图像进行配准。在对话框中选择 刚体变换 或 平移。
    4. 通过点击 图像 | 类型 | 32 位，将图像格式更改为 32 位。
    5. 点击 图像 | 颜色 | 拆分通道，将各颜色通道拆分为独立窗口。
    6. 选择 通道 1（405 nm），通过点击 图像 | 调整 | 阈值 设置阈值以选定用于分析的线粒体。在对话框中选择 默认、红色、暗背景 和 堆栈直方图，等待选中像素显示为红色后，点击 应用。勾选 将背景像素设为 NaN 和 处理所有图像。
      注意：为避免潜在的观察者偏差，应使用自动阈值确定方法。FIJI 提供多种自动方法（如默认、Huang、Intermodes、Otsu），可在阈值对话框的下拉菜单中选择。通常默认方法效果良好。建议在首次分析时比较多种方法，以确定最适合本组图像的阈值方法。选定方法后，需将其应用于所有图像。
    7. 对 通道 2（488 nm）重复步骤 6.1.6。
    8. 通过点击 处理 | 图像计算器 创建比值图像，以可视化 405:488 nm 的比值。在对话框中选择 图像 1：通道 1，操作：除法，图像 2：通道 2，创建新窗口，处理所有图像。
    9. 将比值图像的 查找表 更改为 伪彩色。例如，选择 火焰色（Fire），点击 图像 | 查找表 | Fire。
  2. 图像分析
    1. 在比值图像上，围绕单个细胞或线粒体绘制感兴趣区域（ROI）。每绘制一个 ROI 后，点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 | 添加 将其加入 ROI 管理器（快捷键：'T'），并选择 显示全部。
      注意：由于在步骤 6.1.6 和 6.1.7 中已将背景像素设为“非数值”（NaN），这些像素不会影响测量结果。因此，在 ROI 中包含少量背景像素是可以接受的。
    2. 点击 ROI 管理器 | ctrl+A 全选 ROI | 更多 | 多重测量，测量各个细胞的 405:488 比值。在对话框中选择 测量所有切片 和 每切片一行。
    3. 将测量结果导出至电子表格软件。
    4. 选择 405 nm 图像，使用 ROI 管理器中存储的 ROI，参照步骤 6.2.2 测量所有 ROI 的强度。
    5. 将测量结果导出至电子表格软件。
    6. 选择 488 nm 图像，使用 ROI 管理器中存储的 ROI，参照步骤 6.2.2 测量所有 ROI 的强度。
    7. 将测量结果导出至电子表格软件。
    8. 点击 ROI 管理器 | ctrl+A 全选 ROI | 更多 | 保存，保存 ROI 以供后续使用。
    9. 推荐操作：生成 405 nm 和 488 nm 信号的强度-时间曲线图。确认任一通道均无明显漂白现象（成像序列末尾的信号强度应 ≥ 初始图像的 98%），且在传感器响应期间两条曲线呈相反方向变化（例如，氧化过程中 405 nm 信号应上升，而 488 nm 信号应下降）。
  3. 数据归一化
    1. 对每个比值图像中的 ROI，确定 DA 处理期间的最大值（Rmax）和 DTT 处理期间的最小值（Rmin）。
    2. 按以下公式计算归一化比值：
      figure-protocol-1
      注意：此方法将最大比值设为 1.0，最小比值设为 0。
  4. 线粒体形态学分析
    1. 为在步骤 6.2.6 测量 roGFP 强度的同时获取线粒体形态学参数，请进入 分析 | 设置测量，勾选 形态描述符 和 拟合椭圆。
      注意：除平均强度外，结果 窗口中还将包含主轴长度（Major）、次轴长度（Minor）、长宽比（AR；主轴除以次轴；圆形线粒体 AR ≈ 1，细长线粒体 AR 更大），以及圆形度（Circ.）和圆度（Round）等参数。

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结果

生长因子撤除后稳态线粒体氧化还原状态差异的定量分析
为展示线粒体氧化还原状态稳态差异的定量分析，将标准培养基中培养的原代神经元与培养48小时后撤除生长因子的神经元进行比较。撤除生长因子72小时后可导致神经元发生凋亡性细胞死亡。16细胞在培养48小时后进行成像，以检测线粒体氧化还原状态的变化是否先于该过程。原代大鼠皮层神经元接种于聚-L-鸟氨酸包被的盖玻片上，并在第几天感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2病毒 体外 6（DIV6）并在DIV12进行成像。根据本方案第4节，在配备40x/1.10水镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜上，于室温下进行活细胞成像。共聚焦参数设置为：针孔7个艾里单位，像素大小568.7 nm（512 × 512像素），扫描速度600 Hz，405 nm激光功率3%，488 nm激光功率1%，发射波长范围505–550 nm，帧平均4次。两种条件下原始的405:488 nm比值之间无显著差异图3B）。数据归一化后，在撤除生长因子组中可检测到一部...

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讨论

对线粒体氧化还原状态进行定量和动态测量，可提供有关线粒体和细胞生理的重要信息。目前已有多种荧光探针可用于检测活性氧、"氧化还原应激"或"氧化应激"。然而，后两个术语定义不明确，且常缺乏特异性9,17,18。与化学染料相比，Grx1-roGFP2具有多项优势9,19：（i）作为一种激发光比率型传感器，它可对传感器表达水平、绝对荧光强度以及细胞或细胞器密度进行内在归一化；（ii）作为一种基因编码探针，可将其靶向定位至细胞器或特定亚细胞区域，如突触前末梢或突触后树突棘；（iii）传感器的基因表达避免了染料加载步骤，而化学染料的加载可能对原代神经元造成应激；（iv）与普通的氧化还原敏感性化学染料相比，Grx1-roGFP2对谷胱甘肽氧化还原电位具有高度特异性；（v）该传感器的氧化与还原过程可逆，因而能够检测瞬时的...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号：BA 3679/5-1；FOR 2289：BA 3679/4-2）资助。A.K. 获得伊拉斯谟+（ERASMUS+）奖学金支持。我们感谢 Iris Bünzli-Ehret、Rita Rosner 和 Andrea Schlicksupp 在原代神经元制备方面提供的帮助。我们感谢 Tobias Dick 博士提供质粒 pLPCX-mito-Grx1-roGFP2。图 4 所示实验在海德堡大学尼康影像中心完成。图 2 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
氯化钙 (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306
二胺 (DA)Sigma-AldrichD3648
二硫苏糖醇 (DTT)Carl Roth GmbH6908.1
葡萄糖 (2.5 M 储存液)Sigma-AldrichG8769
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
甘氨酸neoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES (1 M 储存液)Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
氯化镁 (MgCl2·6H2O)Sigma-Aldrich442611-M
N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)Sigma-AldrichM3262
氯化钾 (KCl)Sigma-AldrichP3911
氯化钠 (NaCl)neoFroxx GmbHLC-5932.1
丙酮酸钠 (0.1 M 储存液)Sigma-AldrichS8636
丙酮酸钠Sigma-AldrichP8574
蔗糖Carl Roth GmbH4621.1
高氯酸四甲基罗丹明乙酯 (TMRE)Sigma-Aldrich87917
设备
成像室Life Imaging Services (巴塞尔，瑞士)10920适用于 Ø12 mm 盖玻片的 Ludin Chamber Type 3
激光扫描共聚焦显微镜，显微镜LeicaDMI6000
激光扫描共聚焦显微镜，扫描单元LeicaSP8
蠕动泵VWRPP1080 181-4001
转盘共聚焦显微镜，相机HamamatsuC9100-02 EMCCD
转盘共聚焦显微镜，培养系统TokaiHitINU-ZILCF-F1
转盘共聚焦显微镜，显微镜NikonTi microscope
转盘共聚焦显微镜，扫描单元YokagawaCSU-X1
软件
FIJIhttps://fiji.sc
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参考文献

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