带稳定针的小鼠股骨横断

骨折，骨表面连续性的断裂，发生在人群的所有部分。由于衰老或疾病而骨骼脆弱的人，它们变得严重，脆性骨折的医疗保健费用预计将在5年内超过250亿美元^{1，2，3，4，5}。了解骨折修复所涉及的生物学机制将是开发旨在增强愈合过程的新疗法的起点。以前的研究表明，骨折后，会发生四个重要步骤，使骨骼愈合:（1）血肿的形成;（2）形成纤维软骨愈伤组织;（3）软愈伤组织矿化形成骨骼;（4）愈合骨的重塑^6，7。许多生物过程被激活以成功愈合骨折。首先，在骨折后立即启动急性促炎反应^6，7。然后，骨膜被激活并扩张，骨膜细胞分化成软骨细胞以形成软骨愈伤组织，其生长以填充被破坏的骨节段^{6，7，8，9}留下的间隙。神经和血管细胞侵入新形成的愈伤组织以提供促进修复所需的额外细胞和信号分子^{6，7，8，9，10}。除了有助于愈伤组织形成外，骨膜细胞还分化成成成骨细胞，在桥接愈伤组织中铺设编织骨。最后，破骨细胞重塑新形成的骨骼以恢复到其原始形状和层状结构^{7，8，9，10，11}。许多小组开发了骨折修复的小鼠模型。小鼠早期和最常用的骨折模型之一是Einhorn方法，其中重量从特定的高度¹²下降到腿上。缺乏对角度和用于诱导骨折的力的控制，导致骨不连续性的位置和大小产生很多可变性。随后，它导致观察到的特定骨折愈合反应的变化。其他流行的方法是手术干预以产生胫骨单皮质缺损或应力性骨折，这些手术诱导相对温和的愈合反应^10，13。这些模型中的可变性主要是由于执行该过程的人¹⁴。

在这里，详细的小鼠股骨损伤模型允许控制断裂，以提供可重复的损伤，并允许对股骨骨折修复进行定量和定性评估。具体而言，在成年小鼠的股骨中引入完全突破并稳定骨折末端，以解释物理负荷在骨骼愈合中的作用。还详细介绍了使用组织学和显微计算断层扫描（microCT）采集组织和成像愈合过程不同步骤的方法。

所有描述的动物实验都得到了哈佛医学区机构动物护理和使用委员会的批准。该方案使用12周龄的C57BL / 6J小鼠（雄性和雌性）。C57BL / 6J雄性和雌性小鼠在12周龄左右达到峰值骨量，股骨宽度足以适合稳定针，使它们成为用于该方案的适当菌株¹⁵。

1. 手术准备

1. 高压灭菌手术设备，包括手术剪刀、直钳、弯曲镊子、手术夹具和金刚石切割轮（见 材料表），以最大限度地降低感染风险。
2. 将干净的小鼠笼放在加热垫上，以方便术后恢复。将加热垫设置为达到37-45°C之间的温度。
3. 使用异氟醚室将小鼠置于麻醉状态。将诱导氧流量设置为2 L /min，异氟醚诱导量设置为2-4%，维持鼻锥氧气设置为2 L / min，维持异氟醚为1.4%。
4. 确认鼠标的呼吸是稳定的，并且它们对脚趾捏合没有反应。在每只眼睛上涂抹一层薄薄的眼药膏，以防止角膜刮伤。将小鼠转移到无菌垫上，并使用鼻锥保持麻醉，以与步骤1.3相同的速率连续输送异氟醚。
   注意:建议使用12周龄或更大的小鼠，因为年轻小鼠的股骨可能太薄而无法容纳稳定针。
5. 皮下注射小鼠0.05mg / kg体重的缓释丁丙诺啡（见 材料表）。
6. 使用电动修剪器，在两条大腿上剃除一个2 x 2厘米的正方形，对应于股骨的位置。
7. 使用无菌纱布或拭子对剃须区域进行消毒，以铺上一层碘，然后用70%乙醇冲洗（图1A）。

2. 手术

1. 使用无菌手术刀，在剃光的消毒区域做一个5毫米的切口，剥开皮肤以暴露下面的筋膜。
2. 使用直镊子和细剪刀巧妙地抓住并切割直接覆盖股骨的筋膜，以暴露肌肉。筋膜切口 5 mm 足以进入下层肌肉。
3. 使用一对直镊子，轻轻地将肌肉与股骨分开，将组织损伤降至最低。
4. 一旦可以看到股骨，在分离的肌肉和骨骼之间滑动股骨下方的弯曲镊子。让镊子慢慢打开以保持肌肉分离并固定股骨，以促进干净的切口。
   注意:当镊子未握住时，股骨必须保持暴露并与肌肉和皮肤分开，如图 1B所示。
5. 使用低功率设置的手持锯在股骨轴中间进行横向切割（参见刀片和所用旋转工具套件 的材料表 ）。
   注意:一旦股骨被完全切开，就会产生两个骨折末端:近端部分（附着在髋骨上）和远端部分（连接到膝盖，也称为窒息关节）。避免在一次运动中切割股骨。相反，进行3-5次传递，直到股骨完全切开。这对于避免周围组织过热并产生大量骨碎片，从而对愈合产生负面影响至关重要。
6. 将导针（23 G x 1 TW IM，0.6 mm x 25 mm）（参见 材料表）插入远端部分的骨髓腔中。当您推动穿穿膝关节时，用手指轻轻地扭转针头（图1C）。
   1. 从远端取出导针，并在近端重复，使用相同的轻柔扭转运动将导针推过髋关节。将导针留在近端，其尖端从皮肤中出现（图1D）。
      注:为了稳定骨折末端，首先使用导针来形成穿过骨折末端的路径，然后将稳定销穿过该通道以固定骨折末端¹⁴。
7. 将稳定销（针，27 G x 1 1/4，0.4 mm x 30 mm）（参见 材料表）插入导针的尖端（图1E）。轻轻推动，使稳定针在导针离开近端骨髓腔时进入。
   1. 丢弃导针。使用镊子将远端与近端保持并对齐，并继续将稳定销穿过远端骨髓腔，直到它使用2.6中形成的通路离开膝关节（图1F）。
      注意:稳定销现在应从髋关节和膝关节突出。
8. 使用手术钳，拉动针尖以使近端和远端部分靠近在一起，因此它们几乎不接触。如果需要，用镊子重新对齐骨折末端，并使用手术夹具将稳定销的末端朝向骨折部位折叠（ 参见材料表）。
   1. 使用线切割器从针的底座上取下塑料。使用夹子，扭转销钉的两端直至钝化，以避免内部组织损伤。
      注意:骨折末端现在锁定到位，以便鼠标可以减轻受伤腿部的重量。如果断裂端无法分离，则固定销钉。线切割机也可用于钝化末端。稳定针必须在整个研究期间保持在原位，直到小鼠被安乐死。试图移开针可能会破坏骨折反应的稳定性，并对动物造成伤害。插针可以在解剖时取下。
9. 使用直镊子将肌肉重新定位到股骨上。使用弯曲的镊子，将皮肤的末端捏在一起，并使用伤口夹子关闭开口。
   注意:不要用夹子太紧地闭合皮肤，否则鼠标会避免将重量放在这条腿上。在恢复过程中限制物理负载可能会延迟修复过程。
10. 在另一条腿上重复步骤2.2至2.4，并在不进行股骨骨折的情况下关闭伤口。
    注意:这种假手术的股骨作为对侧对照。
11. 撤回异氟醚暴露，将小鼠置于加热的笼子中，并确保它们在10-15分钟内恢复意识。
12. 手术后5天每天监测小鼠的活动和切口部位，以发现窘迫或感染的迹象。
    注意:如果动物表现出疼痛迹象，不进食和/或犹豫不决，请咨询兽医人员并给予额外的镇痛药。
13. 手术后10天取下伤口夹。
    注意:如果伤口在10天后似乎没有闭合，请在取下夹子之前咨询兽医人员和IACUC。

3. 组织收获

1. 通过CO₂吸入对小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。
   注:该程序与美国兽医协会安乐死小组一致。
2. 使用剪刀和镊子，从两条小鼠腿上取下皮肤，将股骨头从髋骨上脱臼，并切开相邻的肌肉以释放腿部。
   注意:避免去除股骨周围的太多肌肉，因为愈伤组织可能会脱落或受损。
3. 避免使用稳定针，切开膝关节，将股骨与胫骨分开。
4. 在股骨远端和近端周围解剖，以暴露稳定针的末端。
5. 使用硬线切割器，切割销的折叠钝端，以便仅保留销的直端。使用镊子缓慢而轻柔地将稳定销滑出股骨。
   注意:如果针脚不容易滑出，请勿用力，因为这可能会移开愈伤组织并损坏样品。相反，请尝试旋转针脚并将其小心地取下。固定后，拔下针脚也可能更容易。

4. 组织学 - 阿尔西安蓝/曙红/橙G染色

注意:阿尔西安蓝/橙色G/曙红染色通常用于可视化软骨（蓝色）和骨骼（粉红色）。软骨面积可以量化为总愈伤组织面积的比例（图2A，B）。

1. 将股骨固定在10%中性缓冲福尔马林中，在4°C下过夜。
2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤固定样品。
3. 将样品置于0.5M EDTA中，pH 8.0在缓慢旋转的摇摇杯上2周。每隔一天更换一次EDTA溶液，以确保有效的脱钙。
   注:摇床不需要特定的转速;确保液体在容器中流动以覆盖所有样品。完全脱钙可以通过股骨的X射线进行测试。
4. 为了处理用于包埋石蜡的样品，将它们孵育在以下溶液中（每个1小时）:70%EtOH，95%EtOH，100%EtOH，100%EtOH，二甲苯，二甲苯，石蜡，石蜡。
5. 将样品嵌入石蜡中进行切片。
6. 使用切片机切割5-7μm厚的骨折股骨纵向切片。
7. 通过将切片在2个二甲苯浴中孵育（每个5分钟）来脱烷蜡。
8. 通过在以下乙醇梯度（每个2分钟）中孵育切片来重新水合:100%EtOH，100%EtOH，80%EtOH，70%EtOH。
9. 将滑梯放入自来水中1分钟。
10. 制作Alcian蓝，酸性醇，铵水和Eosin / Orange G的溶液用于组织学，如 补充文件1中所述。
    注意:每种溶液的建议体积应足以完全浸没载玻片进行染色。
11. 将载玻片置于酸性酒精中30秒，并在Alcian Blue中孵育40分钟。
12. 在流动的水龙头下轻轻清洗，直到水清澈约2分钟。
13. 将载玻片在酸性酒精中快速浸渍1秒。
14. 按照步骤 4.9 中所述冲洗。
15. 在铵水中孵育15秒。
16. 按照步骤 4.9 中所述冲洗。
17. 置于95%EtOH中1分钟，并在Eosin / Orange G中孵育90秒。
18. 在70%EtOH，80%EtOH和100%EtOH中浸渍，快速脱水载玻片。
19. 将载玻片置于二甲苯中1分钟以清除载玻片。
20. 应用安装介质和盖玻片进行成像。
    注意:对于分子分析，可以从愈伤组织中分离RNA和蛋白质。在解剖镜下仔细解剖肌肉，并使用手术刀将愈伤组织与下层骨骼分开。

5. 微细胞核酸

注意:在愈合的后期阶段，可以进行microCT来成像和量化硬愈伤组织和骨折间隙中的矿化。在C57BL / 6J小鼠中，愈伤组织通常在骨折后10天（dpf）后通过microCT矿化和检测（图2C）。

1. 将股骨固定在10%中性缓冲福尔马林中，在4°C下过夜。
   注意:MicroCT可以在用于组织学的相同股骨上进行，只要在EDTA脱钙之前进行（步骤4.3）。当对两种技术使用相同的股骨时，执行microCT，检索样本并转到步骤4.3。
2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤固定样品并储存在70%EtOH中。
3. 在55 kVP的能级和145μA的强度下，以7μm的各向同性体素尺寸进行microCT（参见 材料表）。
4. 勾勒出 microCT 切片的轮廓，以包括愈伤组织并排除皮质骨。
   注意:随着愈伤组织随着时间的推移矿化程度越来越高，可以调整阈值以可视化和测量不同阶段的愈伤组织体积。
5. 获得愈伤组织轮廓中包含的骨体积作为愈伤组织体积的测量值。
   注意:断裂间隙可以直接在microCT切片上测量为断裂所占据的距离。

在C57BL / 6J小鼠中，成功的手术完成了前面提到的愈合步骤，几乎没有局部炎症反应或假手术对侧股骨的骨膜受累。术后几小时形成血肿，骨膜被激活以招募骨骼祖细胞进行软骨发育。各种细胞群，如Prx1 + 间充质祖细胞，可以在修复过程中使用市售荧光报告小鼠模型进行追踪（图3）。在骨折后5天（dpf），Alcian Blue染色可用于可视化软愈伤组织，随后量化软骨区域（图2A，B）。通过microCT在28 dpf下可检测到矿化（图2C）。矿化愈伤组织体积、骨折间隙的距离以及通过机械测试测量的骨强度通常用作骨折修复的可量化结果。基因改造或药物干预可以改变恢复过程，因此建议进行时程研究以表征不同修复阶段的骨折。可以解剖整个愈伤组织进行分子分析，并且可以将对侧骨干用作对照。 如果骨折末端未与销钉对齐或未充分固定，则生成的图像将显示骨折部位的所有或一侧没有形成愈伤组织（图4）。

图 1:稳定针的断裂和插入。 （A） C57BL/6J 鼠标右腿上的正方形被剃光。（B）在皮肤和筋膜上做切口后，弯曲的镊子固定在股骨下方，以分离肌肉，皮肤和骨骼。（C）切口后，产生两个骨折末端:股骨的近端部分附着在髋骨上，远端部分附着在膝盖上。导针（绿色）插入远端部分并穿过膝关节。（四）将导针从远端截面取出，插入近端节，推过髋关节。（五）将稳定针（灰针）插入从髋关节突出的导针中。（F）稳定针被推过近端部分，进入远端部分，并使用C中导针形成的路径穿过膝关节 。

（A）在5，10和28 dpf处收集股骨骨折的福尔马林固定石蜡切片，并用Alcian Blue /Eosin/Orange G染色。（B）使用ImageJ软件以5，10和28 dpf定量软骨面积。（C）在28 dpf时观察到矿化，并通过microCT测量愈伤组织体积和裂缝间隙。比例尺 = 1，000 μm。数据显示为 SEM ±平均值。矿化愈伤组织体积是通过在骨折部位的皮质骨周围轮廓测量的。深灰色区域描绘了图像上的矿化愈伤组织，而皮质骨（浅灰色）不包括在测量中。数据显示为"SEM±平均值。请单击此处查看此图的放大版本。

图3:荧光报告基因模型用于可视化骨折后Prx1 + 骨膜细胞的扩张。 Prx1CreER;Rosa26td番茄 小鼠每日注射5天，给予80mg/ kg体重的他莫昔芬诱导tdTomato表达。最后注射后三天，开始股骨骨折，并以7或14 dpf处死小鼠以跟踪表达Prx1的细胞及其后代（Prx1 +）位于骨折愈伤组织内的位置和扩张的骨膜。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图4:由于手术问题导致的不规则愈合示例。 在本例中，骨折末端未正确对齐，稳定针刺穿股骨近端部分。这些错误导致股骨形成，其中股骨被刺穿（黄色盒子）而不是在切割部位。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

补充文件1:组织学所需溶液的组成。请点击此处下载此文件。

作者没有任何利益冲突需要披露。