该分析性计算平台为对细菌群体基因组学感兴趣的微生物学家、生态学家和流行病学家提供了实用指导。具体而言，本文展示了如何进行：i）基于系统发育指导的分层基因型作图；ii）基于频率的基因型分析；iii）亲缘关系与克隆性分析；iv）谱系差异性附属基因座的鉴定。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
细菌群体中层级基因型与附属基因组位点的启发式挖掘
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细菌全基因组测序（WGS）的常规化和系统性应用正在提升公共卫生实验室和监管机构所开展流行病学调查的准确性和分辨率。大量公开可用的WGS数据可用于在大规模上研究病原菌群体。最近，一个名为ProkEvo的免费计算平台被发布，旨在利用细菌WGS数据实现可重复、自动化且可扩展的基于层级结构的群体基因组分析。本研究中对ProkEvo的应用展示了将标准的群体基因型图谱绘制与附属基因组内容挖掘相结合在生态推断中的重要性。特别是，本工作使用R编程语言，基于ProkEvo生成的结果进行了群体尺度的层级分析。主要目标是为微生物学家、生态学家和流行病学家提供一个实用指南，展示如何：i）使用系统发育指导的层级基因型图谱绘制方法；ii）评估基因型的频率分布以作为生态适应性的代理指标；iii）利用特定的基因型分类来确定亲缘关系和遗传多样性；以及iv）绘制谱系特异性的附属基因座图谱。为了增强分析的可重复性和可移植性，采用了R Markdown文件来完整展示整个分析流程。示例数据集包含了来自人畜共患食源性病原菌Salmonella Newport的2,365个分离株的基因组数据。基于系统发育锚定的层级基因型图谱绘制（血清型 -> BAPS1 -> ST -> cgMLST）揭示了该群体的遗传结构，突出显示序列型（ST）是关键的区分性基因型。在三个最主要的谱系中，ST5与ST118的共同祖先比与高度克隆型的ST45谱系更为接近。基于ST的差异进一步体现在附属的抗菌药物耐药性（AMR）基因座分布上。最后，采用基于系统发育锚定的可视化方法，将层级基因型与AMR内容相结合，揭示了亲缘结构和谱系特异性的基因组特征。综上所述，该分析方法为利用泛基因组信息开展启发式细菌群体基因组分析提供了一些指导原则。
引言
细菌全基因组测序（WGS）在公共卫生实验室和监管机构的常规监测及流行病学调查中的应用日益广泛，已显著加强了对病原体暴发事件的调查能力1,2,3,4。因此，目前已有大量去标识化的WGS数据公开可用，可用于以前所未有的规模研究病原菌物种的群体生物学特征，包括基于群体结构、基因型频率以及跨多个储存库、地理区域和环境类型的基因/等位基因频率的研究5。最常见的基于WGS的流行病学调查通常仅依赖共享的核心基因组内容进行分析，即仅使用共享（保守）区域进行基因型分类（例如变异位点检测），而这些变异位点则成为流行病学分析和溯源追踪的基础1,2,6,7。通常，基于细菌核心基因组的分型采用多位点序列分型（MLST）方法，所用位点数量从七个到数千个不等8,9,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备输入文件
注意：该实验方案可在此处获取 - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code。 本方案假设研究人员已专门使用 ProkEvo（或类似流程）生成了所需的输出文件，这些文件可在 Figshare 仓库中获取（https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - 需登录凭证 - 用户必须创建免费账户方可访问文件！）。值得注意的是，ProkEvo 可自动从 NCBI-SRA 仓库下载基因组序列，仅需提供一个包含基因组编号列表的 .txt 文件作为输入20，本研究中用于 S. Newport 美国分离株的该文件已在此提供（https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729）。 有关如何安装和使用该细菌基因组学平台的详细信息，请参见此处（https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start）20
- 使用 FastTree
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过利用计算平台ProkEvo进行群体基因组学分析，细菌全基因组测序数据挖掘的第一步是结合核心基因组系统发育关系来考察其层级化的群体结构（图1）。在以下情况下 S. enterica 谱系I，以 S. Newport 数据集的群体结构按层级划分如下：血清型（最低分辨率层级）、BAPS1 亚群或单倍型、ST 世系以及 cgMLST 变异型（最高分辨率层级）20. 这种基于系统发育指导的层级种群结构分析特别允许检验以下几点：i）在基于SISTR被错误分类为其他血清型的基因组情况下，其系统发育分布 沙门氏菌；ii) 种群的遗传或亲缘结构；iii) 不同基因型分辨率水平下的分化模式；iv) 揭示进化、生态或流行病学模式背后的主要基因型单元；v) 通过BAPS1亚群或单倍型组成分析ST谱系间的祖先关系，以及ST谱系内cgMLST变异型之间的关系；vi) 基于cgMLST变异型组成对ST谱系基因型同质性程度的部分评估。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
基于系统的启发式方法和分层种群结构分析为识别细菌数据集中可能解释独特生态学和流行病学模式的新基因组特征提供了框架20。此外，将附属基因组数据映射到种群结构上，可用于推断祖先获得和/或近期衍生的性状，这些性状有助于ST谱系或cgMLST变异株在不同储存库中的传播6,20,21,45,46。更广泛而言，对细菌种群中泛基因组内容分布的全球性评估可揭示种群近期可能经历的生态趋向性或地理空间/时间瓶颈背后的多样化模式18,21。对于致病菌而言，通过挖掘临床分离株与环境分离株的种群结构，可识别与人畜共患病事件相关的遗传决定因素，并用于改进诊断和监测手段
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究工作得到了内布拉斯加大学林肯分校农业研究部（UNL-IANR）、国家抗菌耐药性研究与教育中心以及内布拉斯加食品与健康中心（隶属于食品科学与技术系，UNL）的资金支持。本研究的完成依赖于内布拉斯加大学林肯分校的霍兰计算中心（HCC），该中心获得了内布拉斯加研究计划的支持。我们还感谢通过霍兰计算中心访问开放科学网格（OSG）所提供的资源，开放科学网格由美国国家科学基金会和美国能源部科学办公室提供支持。本研究使用了Pegasus工作流管理软件，该软件由美国国家科学基金会资助（项目编号 #1664162）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 经筛选的耐药性数据 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762 | ||
| 原始耐药性数据 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994 | ||
| BAIPS 分析结果 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003 | ||
| 核心基因组系统发育树 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006 | ||
| 基因组 SRA 数据 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209 | ||
| Linux、Mac 或 PC | 任意高性能计算平台 | ||
| MLST 分析结果 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997 | ||
| SISTR 分析结果 | https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000 | ||
| 需提供 figshare 账户凭据以登录并访问相关文件 |
参考文献
- Grad, Y. H., et al. Genomic epidemiology of the Escherichia coli O104:H4 outbreaks in Europe, 2011. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3065-3070 (2012).
- Worby, C. J., Chang, H. -H., Hanage, W. P., Lipsitch, M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
