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Bioengineering

कर्षण बल माइक्रोस्कोपी में अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल पैटर्निंग तकनीकों का उपयोग कर सेल आसंजन का नियंत्रण

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/63121
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 3, 2, 1
1Department of Cellular Biophysics, Max Planck Institute for Medical Research, 2Institute for Theoretical Physics and BioQuant, Heidelberg University, 3Institute for Molecular Systems Engineering (IMSE), Heidelberg University

Summary

निकट-यूवी लिथोग्राफी और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोजेल पर सेलुलर बलों को मापने के लिए जोड़ा जाता है। एकल कोशिकाओं की लक्षित प्रकाश-प्रेरित रिहाई एक ही नमूने पर माप की एक उच्च संख्या को सक्षम बनाती है।

Abstract

कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) कोशिका बलों को मापने के लिए मेचानोबायोलॉजी में उपयोग की जाने वाली मुख्य विधि है। आमतौर पर इसका उपयोग फ्लैट नरम सब्सट्रेट्स का पालन करने वाली कोशिकाओं के लिए किया जा रहा है जो सेल कर्षण (2 डी-टीएफएम) के तहत विकृत होते हैं। TFM रैखिक लोचदार सामग्री के उपयोग पर निर्भर करता है, जैसे polydimethylsiloxane (PDMS) या polyacrylamide (PA)। पीए पर 2 डी-टीएफएम के लिए, उच्च थ्रूपुट प्राप्त करने में कठिनाई मुख्य रूप से सेल आकृतियों और कर्षणों की बड़ी परिवर्तनशीलता से परिणाम देती है, मानकीकरण के लिए बुलाती है। हम तेजी से और कुशलता से 2 डी-टीएफएम अध्ययन के लिए micropatterned पीए hydrogels बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। माइक्रोपैटर्न को पहली बार मास्कलेस फोटोलिथोग्राफी द्वारा निकट-यूवी प्रकाश का उपयोग करके बनाया जाता है जहां बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन केवल माइक्रोपैटर्न क्षेत्रों से बंधते हैं, जबकि बाकी सतह कोशिकाओं के लिए गैर-चिपकने वाली रहती है। बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन का माइक्रोपैटर्निंग सक्रिय एल्डिहाइड समूहों की उपस्थिति के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को समायोजित करने के लिए विभिन्न आकारों के चिपकने वाले क्षेत्र होते हैं। TFM माप के लिए, हम एक्रिलामाइड और bis-acrylamide की मात्रा को अलग-अलग करके और नियमित फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन साइटोमेट्री (FTTC) के साथ सेल कर्षण क्षेत्रों के पुनर्निर्माण के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन को ट्रैक करके विभिन्न लोच के पीए हाइड्रोजेल का उपयोग करते हैं।

सेल बलों की सटीक रिकॉर्डिंग को और अधिक प्राप्त करने के लिए, हम एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों के लिए परिभाषित क्षेत्रों में सेल कर्षण जारी करने के लिए पैटर्न वाले प्रकाश की एक नियंत्रित खुराक के उपयोग का वर्णन करते हैं। हम इस विधि को स्थानीय यूवी रोशनी कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (LUVI-TFM) कहते हैं। एंजाइमेटिक उपचार के साथ, सभी कोशिकाओं को एक साथ नमूने से अलग कर दिया जाता है, जबकि एलयूवीआई-टीएफएम कर्षण के साथ नमूने के विभिन्न क्षेत्रों में कोशिकाओं के बलों को अनुक्रम में दर्ज किया जा सकता है। हम इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का प्रदर्शन करते हैं (i) सब्सट्रेट के लिए नियंत्रित आसंजन के एक समारोह के रूप में सेल कर्षण बलों का अध्ययन करने के लिए, और (ii) एक ही नमूने से प्रयोगात्मक टिप्पणियों की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए।

Introduction

अपने बाह्य कोशिकीय वातावरण के साथ बातचीत करते समय, अनुयायी कोशिकाएं उन बलों को लागू करती हैं जो मुख्य रूप से इंटीग्रिन-आधारित फोकल आसंजन द्वारा मध्यस्थता की जाती हैं जो एक्टिन साइटोस्केलेटन से एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) को जोड़ती हैं। फोकल आसंजन मल्टीप्रोटीन असेंबली हैं जो फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन जैसे ईसीएम-प्रोटीन के लिए इंटीग्रिन के बंधन के आसपास केंद्रित हैं। इंटीग्रिन क्लस्टरिंग और फोकल आसंजन की वृद्धि न केवल एक यांत्रिक रूप से स्थिर कनेक्शन की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि अन्य फोकल आसंजन प्रोटीन की भर्ती के लिए भी महत्वपूर्ण है, जिसमें वे भी शामिल हैं जो सेलुलर संकुचन के विनियमन के लिए RhoA मार्ग को सक्रिय करते हैं1। एक्टिन साइटोस्केलेटन की RhoA-निर्भर संकुचन कोशिकाओं को अंतर्निहित ईसीएम पर फैलने और माइग्रेट करने की अनुमति देता है, और इसकी कठोरता को समझने के लिए भी। कर्षण बलों का वितरण दृढ़ता से कोशिकाओं के प्रसार क्षेत्र और आकार पर निर्भर करता है, जिनमें से दोनों मैट्रिक्स गुणों पर भरोसा करते हैं और इसलिए साइटोस्केलेटल संगठन को प्रभावित करते हैं, अंततः मैट्रिक्स यांत्रिकी और साइटोस्केलेटल संगठन 3,4 के बीच एक बंद प्रतिक्रिया लूप बनाते हैं।

सतह micropatterning तकनीकों ईसीएम चिपकने वाला प्रोटीन प्रस्तुत माइक्रोन आकार के क्षेत्रों का निर्माण करके सेल आकार के एक परिभाषित नियंत्रण की अनुमति देते हैं; इन क्षेत्रों के आकार के अनुसार, एकल कोशिकाएं, या कोशिकाओं के समूह जो माइक्रोपैटर्न 5 का पालन करते हैं। ईसीएम प्रोटीन को विभिन्न दृष्टिकोणों जैसे माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग, फोटो-पैटर्निंग या लेजर-पैटर्निंग 6 द्वारा ग्लास सब्सट्रेट पर पैटर्न किया जा सकता है। यूवी प्रकाश का उपयोग (π = 185 या 375 एनएम) सतह antifouling रणनीतियों के साथ संयुक्त विभिन्न आकार और आकार डिजाइन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है और सतह किनारों के पास एक उच्च परिशुद्धता के साथ कई प्रोटीन प्रकार के स्थिरीकरण7,8. पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) जैसे प्रोटीन विकर्षक रसायनों के साथ लेपित क्षेत्रों को या तो क्रोमियम फोटोमास्क या डिजिटल मिरर डिवाइस (डीएमडी) -आधारित मास्कलेस लिथोग्राफी सिस्टम के साथ संरक्षित किया जाता है। मास्क में पैटर्न उन क्षेत्रों के यूवी प्रकाश के संपर्क में आने की अनुमति देते हैं जो तब ईसीएम प्रोटीन के साथ पैटर्न किए जाएंगे। ईसीएम प्रोटीन के साथ हाइड्रोजेल सतहों के पैटर्निंग के लिए कांच की सतह से प्रोटीन को हटाने और उन्हें पैटर्न से क्रॉसलिंक करने के लिए एक हस्तांतरण चरण की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, नरम सामग्रियों पर पैटर्निंग को पहले एक विकर्षक प्रोटीन के साथ फोटोमास्क कोटिंग करके प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद गहरी यूवी रोशनी का उपयोग करके अनमास्क किए गए क्षेत्रों को जलाकर। चूंकि गहरी यूवी ओजोन उत्पन्न करती है और प्रोटीन बाइंडिंग के लिए सतह को प्रतिक्रियाशील बनाती है, इसलिए नकाबपोश क्षेत्रों को ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है और अंत में जेल को सीधे अनमास्क किए गए क्षेत्रों के शीर्ष पर पॉलिमराइज़ किया जाता है9,10।

पैटर्न वाले हाइड्रोजेल का उपयोग टीएफएम करने के लिए किया जा सकता है, एक तकनीक जो सेल-सामग्री इंटरफेस 11 पर सेल बलों को मापती है। 2डी-टीएफएम में, एक मोटी बहुलक फिल्म की सपाट सतह का उपयोग करता है, जिसमें मार्कर मोतियों को विरूपण 12,13,14,15 को ट्रैक करने के लिए एम्बेडेड किया गया है। विस्थापन वैक्टर निकालने के लिए, दो छवियों को संयोजित करना आवश्यक है, विकृत राज्य में से एक और विरूपण के बिना एक संदर्भ छवि। दो छवियों को तब छवि प्रसंस्करण के साथ एक दूसरे पर मैप किया जाता है। उच्च मार्कर घनत्व पर, यह आमतौर पर कण छवि वेलोसिमेट्री (PIV) के साथ किया जाता है, जो हाइड्रोडायनामिक प्रवाह के पुनर्निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। कम मार्कर घनत्व और 3 डी-टीएफएम में, यह आमतौर पर पार्टिकल ट्रैकिंग वेलोसिमेट्री (पीटीवी) के साथ किया जाता है, जिसमें प्रयोगात्मक डेटा सेट की विशिष्ट विशेषताएं शामिल हैं। कम्प्यूटेशनल रूप से सस्ता विकल्प का एक उदाहरण ऑप्टिकल प्रवाह है, जैसे कि कनाडे-लुकास-टोमासी (केएलटी) एल्गोरिदम 16। हाइड्रोजेल सब्सट्रेट के मामले में, फ्लोरोसेंट मोतियों को आमतौर पर सामग्री पोलीमराइजेशन के दौरान उच्च घनत्व पर एम्बेडेड किया जाता है, और एंजाइमेटिक टुकड़ी पर सेल रिलीज से पहले और बाद में छवियों को दर्ज किया जाता है। अनुयायी कोशिकाओं की एंजाइमेटिक टुकड़ी, उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा, हाइड्रोजेल पर सभी कोशिकाओं से सेलुलर कर्षणों की एक साथ रिहाई की ओर जाता है, जिससे उच्च संख्या में कोशिकाओं से विस्तृत विश्लेषण प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है।

यहां हम सेल आकार और स्थानीयकरण को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और सब्सट्रेट से व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने के लिए यूवी का उपयोग करके अनुक्रम में कर्षण बलों को कुशलतापूर्वक मापने की एक विधि पेश करते हैं। कर्षण बल माप के लिए, हम दोहरी-स्तरित पीए हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के लिए एक तकनीक पेश करते हैं, जहां फ्लोरोसेंट मोती केवल शीर्ष परत में एम्बेडेड होते हैं, जो उनके घनत्व को बढ़ाता है और उनके ऊर्ध्वाधर प्रसार को कम करता है। माइक्रोपैटर्निंग के साथ सेलुलर कर्षण बलों की यूवी-मध्यस्थता रिलीज के संयोजन से सेल टुकड़ी पर स्थानिक नियंत्रण प्राप्त करना संभव हो जाता है (उदाहरण के लिए, ब्याज के क्षेत्र में अन्य कोशिकाओं के आसंजन को प्रभावित किए बिना एकल कोशिकाओं का), बशर्ते कि पैटर्न वाली कोशिकाओं के बीच पर्याप्त दूरी हो। सेलुलर कर्षण को तब 2 डी-टीएफएम के लिए सबसे कुशल और विश्वसनीय विधि का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया जाता है, अर्थात्, फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन साइटोमेट्री (एफटीटीसी) नियमितीकरण 17,18 के साथ।

Protocol

1. methacrylated coverslips की तैयारी

नोट: ग्लास coverslips pa hydrogels सहसंयोजक लिंक करने के लिए methacrylated हैं और इसलिए कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन के दौरान उनकी टुकड़ी को रोकने के लिए। माइक्रोस्कोप ग्लास कवरलिप्स का उपयोग उच्च छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए किया जाता है।

  1. 300 एमएल समाधान तैयार करने के लिए, एक साफ 400 एमएल ग्लास बीकर लें और इसे धुएं के हुड के अंदर रखें।
  2. बीकर में डबल आसुत पानी (ddH2O) के 10 mL जोड़ें। एसिटिक एसिड के 18.75 मिलीलीटर जोड़ें (≥99.8% प्रो विश्लेषण, पीए), 3-(Trimethoxysilyl) प्रोपिल methacrylate के 18.75 mL और इथेनॉल के 252.5 mL (≥99.8% प्रति वर्ष) एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर। समाधान को एक क्रिस्टलीकृत पकवान में डालें।
  3. परिशुद्धता पोंछे के साथ 24 मिमी गोल ग्लास coverslips साफ. एक कस्टम-निर्मित polytetrafluorethylene रैक में coverslips जगह.
  4. समाधान में रैक विसर्जित करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. रैक लें और इथेनॉल (99.8% प्रति वर्ष) के साथ सभी coverslips कुल्ला। हवा के प्रवाह के तहत कवरलिप्स को सुखाएं।
    नोट: Methacrylated coverslips को RT पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. कांच coverslips पर बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के micropatterning

नोट: ग्लास कवरलिप्स को पहले अणुओं की एक परत के साथ लेपित किया जाता है, जिसमें प्रोटीन और सेल विकर्षक शामिल होते हैं। इस परत को तब एक फोटोपैटर्निंग तकनीक का उपयोग करके हटा दिया जाता है, ताकि माइक्रोपैटर्न्ड क्षेत्रों में एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन के बाद के जमाव की अनुमति मिल सके।

  1. एक 15 मिमी गोल ग्लास कवरस्लिप लें और इसे पेट्री डिश पर रखें। कवरस्लिप के ऊपरी हिस्से को चिह्नित करने के लिए हीरे के पेन का उपयोग करें। फिर, 0.4 mbar और 200 W पर ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के माध्यम से 2 मिनट के लिए सफाई के लिए आगे बढ़ें।
  2. पिपेट 100 μL प्रत्येक coverslip की सतह पर 0.01% पॉली-एल-लाइसिन समाधान के। RT पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) pH 8.5 के साथ coverslips धोएं। किसी भी अतिरिक्त तरल को हटा दें लेकिन सतह को गीला रखें।
  3. पिपेट 100 μL 50 मिलीग्राम / एमएल पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) मिथाइल ईथर succinimidyl valeric एसिड (एमपीईजी-एसवीए) में 10 mM HEPES पीएच 8.5 प्रत्येक coverslip की सतह पर। RT पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें। 10 mM HEPES pH 8.5 के साथ coverslips कुल्ला और हवा के प्रवाह के नीचे सूख जाओ।
  4. यूवी-संवेदनशील फोटोइनिशिएटर (जैसे, पीएलपीपी-जेल) के 2 μL जोड़ें, इसके बाद सतह पर इथेनॉल के 40 μL (≥99.8% प्रति वर्ष) के बाद। सतह पर जेल और इथेनॉल का एक सजातीय वितरण प्राप्त करने के लिए, पेट्री डिश को धीरे-धीरे आगे और पीछे झुकाएं। समाधान polymerize करने के लिए 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  5. नीचे एक 20 मिमी छेद के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश के अंदर एक एकल कवरस्लिप रखें। यह नीचे से आने वाले लेजर बीम को सीधे कांच की सतह तक पहुंचने की अनुमति देता है।
  6. माइक्रोस्कोप और एक प्रकाश पैटर्निंग मॉड्यूल को चालू करें (इस डिवाइस के साथ काम करने की अनुमति केवल लेजर सुरक्षा अधिकारियों से सुरक्षा परिचय के बाद दी जाती है)। 20x हवा उद्देश्य पर यूवी-ए लेजर कैलिब्रेट करें। मंच पर photoinitiator के साथ नमूना रखो. कांच की सतह पर फ़ोकस समायोजित करें और फ़ोकस नियंत्रण चालू करें। लोड करें और पूर्व-तैयार किए गए पैटर्न को लॉक करें।
    1. इंकस्केप जैसे ग्राफिक्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पैटर्न तैयार करें। सुनिश्चित करें कि पैटर्न फ़ाइल DMD आयामों (1824 x 1140 px, जो 20 x लेंस (0.28 μm/ px) पर 552 x 325 μm से मेल खाती है) से अधिक नहीं है।
      नोट:: यह DMD आकार (1824 x 1140 पिक्सेल) पैटर्न फ़ाइल आकार के रूप में उपयोग करने के लिए अनुशंसित है, क्योंकि यह पैटर्निंग के दौरान कोई त्रुटि सुनिश्चित करेगा। उदाहरण के लिए, 1830 x 1130 पिक्सेल आयाम के साथ एक पैटर्न फ़ाइल का उत्पादन न करें।
    2. पॉलीएक्रिलामाइड में पैटर्न हस्तांतरण के उद्देश्य के लिए, सुनिश्चित करें कि पैटर्निंग कांच के केंद्र से किनारे तक त्रिज्या के केवल 60% -70% तक की जाती है।
    3. एक एकल सेल को पैटर्न करने के लिए, पैटर्न के बीच 100 μm की दूरी और सेल समूह के लिए 150-300 μm के व्यास के साथ 50-100 μm के व्यास का उपयोग करें। उपयुक्त पैटर्न आकार अत्यधिक विशिष्ट सेल आकार पर निर्भर करता है, और कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए इसे पर्याप्त रूप से बड़ा होना चाहिए।
  7. 30 mJ / mm2 की यूवी खुराक द्वारा पैटर्निंग शुरू करें। पैटर्निंग अवधि पैटर्न की संख्या पर निर्भर करती है। एक एकल पैटर्न बनाने में लगभग 1 सेकंड लगते हैं।
  8. पैटर्निंग चरण को पूरा करने के बाद, सतह को तीन बार फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ कुल्ला करें। 25 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन के 100 μL के साथ नमूने को 1x PBS और 25 μg / mL फाइब्रिनोजेन Alexa488 संयुग्मित PBS में RT पर 1 h के लिए विघटित के साथ इनक्यूबेट करें। अन्य ईसीएम प्रोटीन के लिए, पूरी तरह से पैटर्न वाले क्षेत्रों को कवर करने वाली इष्टतम सांद्रता ढूंढें।
  9. 1x PBS के साथ सतह को तीन बार कुल्ला। सुनिश्चित करें कि पैटर्न ग्लास का उपयोग तुरंत ग्लास-पीए ट्रांसफर के लिए किया जाता है। हाइड्रोजेल तैयारी के दौरान RT पर PBS में पैटर्न वाले ग्लास को स्टोर करें।

3. पैटर्न पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोजेल का निर्माण

नोट: पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोजेल तैयार किए जाते हैं, जिसमें ऑक्सीकरण एन-हाइड्रॉक्सीएथिल एक्रिलामाइड (एचईए) शामिल हैं ताकि सतह पर मैट्रिक्स प्रोटीन के सहसंयोजक बंधन के लिए प्रतिक्रियाशील एल्डिहाइड समूहों को प्रस्तुत किया जा सके। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोजेल की शीर्ष परत पर फ्लोरोसेंट मोतियों को एम्बेड करने के लिए एक दोहरी परत दृष्टिकोण का उपयोग कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के दौरान मनका विस्थापन की रिकॉर्डिंग में सुधार करने के लिए किया जाता है।

  1. एक पेट्री डिश में methacrylated ग्लास coverslips रखो.
  2. ताजा ऑक्सीकरण एचईए समाधान तैयार करने के लिए, 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 9.55 मिलीलीटर डबल-आसुत पानी जोड़ें। फिर, 0.5 मिलीलीटर एचईए जोड़ें, और समाधान के 10 एमएल प्राप्त करने के लिए सोडियम (मेटा) पीरियडेट के 42 मिलीग्राम जोड़ें। लगातार 4 घंटे के लिए अंधेरे में समाधान हिलाएं।
  3. एक्रिलामाइड, बिस-एक्रिलामाइड, और डबल-आसुत पानी को तालिका 1 के अनुसार मिलाएं, स्टॉक समाधान हाइड्रोजेल के 10 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए (इसे धुएं के हुड के तहत करें, मोनोमर्स न्यूरोटॉक्सिक हैं)। Degas और एक एयरटाइट सील करने के लिए ढक्कन बंद करें।
    नोट: स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक के लिए एलीकोट में रखा जा सकता है। हमेशा उपयोग करने से पहले हाइड्रोजेल के यंग के मापांक को चिह्नित करता है।
  4. एक दोहरी स्तरित पीए हाइड्रोजेल तैयार करें (इसे धुएं के हुड के नीचे करें, मोनोमर्स न्यूरोटॉक्सिक हैं)।
    1. स्टॉक समाधान के 99.3 μL, 1% अमोनियम persulfate (APS) के 0.5 μL, और एक 1.5 mL ट्यूब में tetramethylethylenediamine (TEMED) के 0.2 μL को धीरे से मिलाकर नीचे की परत के साथ शुरू करें। समाधान से 10 μL ले लो और इसे methacrylated coverslip के केंद्र पर dropwise पिपेट.
    2. ध्यान से ड्रॉपलेट पर एक 15 मिमी गोल कवरस्लिप रखें और पोलीमराइजेशन के लिए 45 मिनट तक प्रतीक्षा करें। धीरे से एक scalpel के साथ शीर्ष coverslip अलग.
    3. शीर्ष परत के लिए, धीरे से ताजा ऑक्सीकृत HEA समाधान के 1 μL के साथ 93.3 μLof स्टॉक समाधान मिश्रण, फ्लोरोसेंट मोतियों के 5 μL (200 एनएम आकार के मोतियों के मोती के लिए प्रति वर्ग माइक्रोन तीन मोतियों के अनुरूप), 1% APS के 0.5 μL, और एक 1.5 mL ट्यूब में TEMED के 0.2 μL। समाधान से 5 μL ले लो और इसे पहले से ही polymerized नीचे परत के केंद्र पर dropwise पिपेट.
    4. धीरे बूंद पर micropatterned coverslip जगह. बूंद polymerize करने के लिए आरटी पर 45 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि पैटर्न वाला पक्ष बूंद को छूता है। धीरे से एक scalpel के साथ coverslip अलग.
  5. दो-घटक सिलिकॉन-गोंद का उपयोग करके कस्टम-ड्रिल किए गए 6-अच्छी तरह से प्लेटों के नीचे 24 मिमी कवरलिप्स को गोंद करें। 5 मिनट के बाद, कुओं में पीबीएस जोड़ें।
  6. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा polyacrylamide हाइड्रोजेल नमूनों के यंग मापांक की विशेषता है।
    1. AFM धारक पर एक गोलाकार टिप कैंटिलीवर माउंट करें।
    2. एक कठिन सब्सट्रेट (जैसे, ग्लास या अभ्रक) पर एक बल-दूरी वक्र (3-4 वी सेटपॉइंट) प्राप्त करके प्रत्येक कैंटिलीवर को कैलिब्रेट करें, कैंटिलीवर संवेदनशीलता को एक्सट्रपलेट करें, सतह से पीछे हट जाएं, और अपने वसंत स्थिरांक को प्राप्त करने के लिए एक थर्मल धुन का प्रदर्शन करें।
    3. हाइड्रोजेल नमूने पर कैलिब्रेटेड कैंटिलीवर रखें और निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके पीबीएस बफर में बल वक्र प्राप्त करें: 20-30 nN बल सेटपॉइंट, 5 या 10 μm / s दृष्टिकोण और पीछे हटने की गति, 5 μm रैंप आकार।
      नोट: एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप, एक हवा 40x उद्देश्य और एक हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फिल्टर के साथ सुसज्जित, कल्पना और पीए हाइड्रोजेल नमूनों के भीतर ईसीएम-micropatterned क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    4. AFM विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ अधिग्रहित बल बनाम दूरी घटता प्लॉट.
    5. संपर्क बिंदु का पता लगाएं और बल बनाम दूरी घटता को बल बनाम इंडेंटेशन वक्र में परिवर्तित करें।
    6. 0.2 और 0.5 के बीच एक पॉइसन अनुपात का उपयोग करते हुए, हर्ट्ज मॉडल (या टिप ज्यामिति के कार्य में एक उपयुक्त यांत्रिकी मॉडल) के साथ वक्र के इंडेंटेशन भाग को फिट करें।

4. यूवी-ए लेजर रोशनी (LUVI-TFM) द्वारा सेल कर्षण बलों की स्थानीय रिहाई

नोट: यूवी-ए लेजर हाइड्रोजेल के परिभाषित क्षेत्रों में स्थानीयकृत कोशिकाओं में कर्षण बलों को जारी करने के लिए लागू किया जाता है। यूवी-ए लेजर (यानी, π = 375 एनएम सॉलिड-स्टेट लेजर, <15 एमडब्ल्यू) एक क्लास 3 बी लेजर है। बिना तेल वाली लेजर बीम आंखों के लिए और अक्सर त्वचा के लिए खतरनाक होती है। परावर्तित और बिखरे हुए प्रकाश और विकिरण खतरनाक हो सकते हैं। इसके अलावा, यूवी विकिरण त्वचा कैंसर का कारण बन सकता है। उपकरणों के साथ काम करने की अनुमति केवल लेजर सुरक्षा अधिकारियों से सुरक्षा परिचय के बाद है।

  1. कुओं से पीबीएस एस्पिरेट करें।
  2. बीज 3 x 106 कोशिकाओं प्रति 6-अच्छी तरह से विकास माध्यम में प्लेट. फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए, उच्च ग्लूकोज ड्यूलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का उपयोग करें जिसमें एल-ग्लूटामाइन होता है और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक होता है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस / 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोपी शुरू करने से पहले फ्लोटिंग कोशिकाओं को निकालने के लिए नमूने धोएं।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 वातावरण का तापमान प्राप्त करने के लिए कक्ष और गैस की आपूर्ति के इनक्यूबेशन माइक्रोस्कोप को चालू करें।
  4. माइक्रोस्कोप और लेजर पैटर्निंग मॉड्यूल को चालू करें। यदि आवश्यक हो, तो लियोनार्डो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके 20x वायु उद्देश्य पर यूवी-ए लेजर को फिर से कैलिब्रेट करें। मंच पर नमूनों के साथ कस्टम-निर्मित 6-अच्छी तरह से प्लेट रखें। पीए की सतह पर फ़ोकस समायोजित करें.
  5. रोशनी पैटर्न सेटअप करें और रुचि की कोशिकाओं को चिह्नित करें। हाइड्रोजेल की सतह पर पुन: ध्यान केंद्रित करें। ब्राइटफील्ड चैनल में कोशिकाओं की छवि प्राप्त करें। Cy5 चैनल (दूर-लाल फ़िल्टर, 650 एनएम उत्तेजना, 670 एनएम उत्सर्जन) पर स्विच करें और विकृत अवस्था में मोतियों की एक छवि लें।
  6. लेजर चैनल पर शिफ्ट करें। 3 मिनट के लिए लेजर चालू करें। हमारे विशेष सेटअप में, यह 6,000 mJ / mm2 की एक हल्की खुराक से मेल खाता है।
  7. Cy5 चैनल पर स्विच करें और अविकृत स्थिति में मोतियों की एक छवि प्राप्त करें।
    नोट:: माउस भ्रूण fibroblasts का उपयोग कर प्रयोग के लिए, संदर्भ/undeformed छवि रिकॉर्ड करने के लिए 15 मिनट के बाद के लिए प्रतीक्षा करें ( प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)। यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अलग हो सकता है। 4.5-4.7 चरणों को पुन: रुचि के किसी अन्य कक्ष (सेल) के लिए दोहराएँ।
  8. यूवी-ए रोशनी के बाद ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक (सेलरॉक्स) का उपयोग करें। CellRox कम राज्य में गैर-फ्लोरोसेंट है और, जब प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों द्वारा ऑक्सीकरण किया जाता है, तो ~ 665 एनएम के उत्सर्जन अधिकतम के साथ फ्लोरेसेस।
  9. प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार, इमेजिंग मीडिया में 5 μM अभिकर्मक जोड़ें और 37 °C/5% CO2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, गर्म 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x को धोएं और इमेजिंग मीडिया को बदलें। एक समान प्रकाश जोखिम का उपयोग करके यूवी-ए रोशनी से पहले और बाद में प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा Cy5 सिग्नल रिकॉर्ड करें।

5. छवि प्रसंस्करण, कण छवि velocimetry और कर्षण बलों की गणना

नोट: सेल कर्षण बलों फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन का विश्लेषण करके दर्ज किए जाते हैं और कण छवि velocimetry के आधार पर छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके गणना की जाती है।

  1. फ्लोरोसेंट मोतियों की छवियों को खोलें, इससे पहले (यानी, विकृत) और फिजी का उपयोग करके लेजर (यानी, अनिर्धारित) के बाद। दो छवियों को एक स्टैक के रूप में मर्ज करें (छवि | स्टैक | स्टैक करने के लिए छवियाँ)।
  2. StackReg प्लगइन (पी. Thévenaz, प्रौद्योगिकी लॉज़ेन के स्विस संघीय संस्थान) का उपयोग कर दो छवियों के बीच सही पार्श्व बहाव. छवियों को 8 बिट में बदलें (छवि | टाइप करें | 8 बिट) और 1024 x 1024 पिक्स के लिए फिर से स्केल (छवि | स्केल)। हमेशा शुरुआत में संदर्भ छवि के साथ एक छवि अनुक्रम (TIFF स्वरूप) के रूप में सहेजें।
  3. OpenPIV परियोजना में लागू के रूप में PIV-फ़ील्ड से एक क्रॉस-सहसंबंध तकनीक 19 का उपयोग करके विस्थापन वेक्टर फ़ील्ड प्राप्त करें।
    1. सुनिश्चित करें कि आराम से (undeformed) छवि और विकृत छवि आकार wR और पिक्सेल में wD की खोज खिड़कियों के साथ कवर कर रहे हैं. प्रत्येक खोज विंडो के लिए, निम्न सूत्र का उपयोग करके एक क्रॉस-सहसंबंध फ़ंक्शन निर्धारित करें:
      Equation 1
      यहां, आर (आई, जे) और डी (आई, जे) चयनित खोज विंडो में छंटनी की गई दो छवियों की तीव्रता क्षेत्रों का वर्णन करते हैं और बाद में दर्पण गद्देदार होते हैं। Equation 2 और Equation 3 उनके औसत मूल्य का वर्णन करें। खिड़की के आकार को wR = 32 और wD = 32 होने के लिए चुना जाता है और पड़ोसी खोज खिड़कियों के बीच 70% के ओवरलैप का उपयोग किया जाता है।
    2. प्रत्येक खोज विंडो के लिए एक विस्थापन वेक्टर Equation 4 निर्धारित करें जो क्रॉस-सहसंबंध फ़ंक्शन को ऑप्टिमाइज़ करता है और खोज विंडो की केंद्र स्थिति को असाइन करता है। Subpixel सटीकता एक गाऊसी का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है के रूप में maxima क्षेत्र के चारों ओर फिट के रूप में वर्णित 20.
    3. अस्पष्ट विस्थापन वैक्टर को ढूँढें और निकालें. खोज खिड़कियों के अनुरूप विस्थापन वैक्टर जहां 1.5 की सीमा के नीचे क्रॉस-सहसंबंध फ़ंक्शन के दो उच्चतम स्थानीय मैक्सिमा के बीच के अनुपात को अस्पष्ट 21 के रूप में माना जाता है।
    4. 1.522 की अवशिष्ट थ्रेशोल्ड के लिए सामान्यीकृत माध्यिका परीक्षण में विफल होने वाले विस्थापन वैक्टर को छोड़ दें।
    5. (वैकल्पिक) सभी विस्थापनों से एक निश्चित वेक्टर Equation 5 को घटाकर शेष पार्श्व बहाव को सही करें। ऐसा इसलिए किया जाता है क्योंकि सेल से दूर एक चयनित क्षेत्र में विस्थापन गायब हो जाता है।
    6. एक घन बहुपद इंटरपोलेशन का उपयोग कर इनपुट छवियों के 4 पिक्सल की रिक्ति के साथ एक नियमित ग्रिड के लिए परिणामी विस्थापन वेक्टर फ़ील्ड interpolate। अनुपलब्ध डेटापॉइंट्स एक चिकनी bivariate spline एक्सट्रपलेशन का उपयोग करके भरे जाते हैं। पिक्सेल में एक विस्थापन वेक्टर छवि के पिक्सेल अनुपात (20x एयर लेंस के लिए 0.33 μm / px) द्वारा एक स्थानीय विरूपण से संबंधित है।
    7. (वैकल्पिक) दर्पण पैड छवि को बाद के विश्लेषण में बज कलाकृतियों को कम करने के लिए।
    8. 0.2-0.3 के पैरामीटर के साथ, बहाव सुधार के कारण किनारे प्रभाव को समाप्त करने के लिए एक Tukey विंडो फ़ंक्शन द्वारा विरूपण फ़ील्ड गुणा करें। इस प्रयोग में, माइक्रोपैटर्न्ड क्षेत्र जो एफओवी के केंद्र में है, ब्याज का है।
  4. नियमित फूरियर ट्रांसफॉर्म कर्षण साइटोमेट्री (FTTC)18 का उपयोग करके कर्षण का पुनर्निर्माण करें। नियमितीकरण के रूप में हम सबसे सरल उचित विकल्प का उपयोग करते हैं, अर्थात्, 0 वें क्रम के तिखोनोव (एल 2) नियमितीकरण 23,24,25। एक इष्टतम नियमितीकरण पैरामीटर π को इस तरह से चुना जाता है कि यह 26 द्वारा परिभाषित सामान्यीकृत क्रॉस सत्यापन (GCV) फ़ंक्शन को कम करता है:
    Equation 6
    यहाँ एक स्टैक्ड वेक्टर है जिसमें सभी फूरियर सैंपलिंग मोड के लिए दिए गए मान के लिए पुनर्निर्मित कर्षण क्षेत्र के x और y घटक होते हैं और G रैखिक ऑपरेटर मैपिंग ट्रैक्शन फ़ील्ड को उनके संबंधित विस्थापन क्षेत्र में है, जैसा कि FTTC के लिए परिभाषित किया गया है। योग वेक्टर घटकों पर चल रहा है। ui सभी फूरियर नमूना मोड के लिए विस्थापन क्षेत्र के x और y घटक हैं। जीसीवी का व्यापक रूप से बीमार व्युत्क्रम समस्याओं के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है और यह अक्सर टीएफएम में उपयोग किए जाने वाले एल-वक्र मानदंड का एक अच्छा विकल्प है। एक Lanzcos फिल्टर का उपयोग सीमित आवृत्ति स्थान और विस्थापन क्षेत्र अपसैम्पलिंग के कारण कलाकृतियों को कम करने के लिए किया जाता है। कर्षण गणना पीए के यंग के मापांक (उदाहरण के लिए, 11.3 kPa) और पॉइसन के अनुपात पर निर्भर करती है (उदाहरण के लिए, क्रॉसलिंकर एकाग्रता के आधार पर 0.2 और 0.5 के बीच की सीमा में पीए के लिए)।

Representative Results

पीए हाइड्रोजेल को मेथाक्रिलेटेड ग्लास कवरलिप्स पर पॉलिमराइज़ किया गया था, जो पीए के सहसंयोजक लिंकेज के लिए प्रतिक्रियाशील समूहों को प्रस्तुत करते हैं। इस तरह, हाइड्रोजेल को एक जलीय घोल में रखते समय, सब्सट्रेट से उनकी टुकड़ी को रोका गया था (चित्रा 1 ए-डी)। हाइड्रोजेल सतह के पास फिड्यूशियल मार्करों का एक उच्च घनत्व प्राप्त करने के लिए, हमने एक दोहरे स्तरित पीए हाइड्रोजेल की तैयारी विकसित की। नीचे की परत, किसी भी फ्लोरोसेंट मोतियों के बिना, methacrylated coverslip पर polymerized था। इसके बाद, मोतियों वाली एक और परत को नीचे की परत (चित्रा 1ई-एच) के शीर्ष पर पॉलिमराइज़ किया गया था, जो अवसादन की आवश्यकता को प्रतिस्थापित करता है, जिसका उपयोग अक्सर एक एकल फोकल प्लेन में मनका वितरण प्राप्त करने और मनका घनत्व को बढ़ाने के लिए किया जाता है। टीएफएम माप के दौरान सेल आकार पर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, हमने एक ग्लास कवरस्लिप से पूर्व-पॉलिमराइज्ड पीए (चित्रा 1 एफ-एफ') तक फाइब्रोनेक्टिन-पैटर्न वाले माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रत्यक्ष हस्तांतरण के माध्यम से माइक्रोपैटर्न पीए हाइड्रोजेल का उत्पादन किया। शीर्ष हाइड्रोजेल परत समाधान में 1% गैर-पारंपरिक क्रॉसलिंकर (ऑक्सीकरण एचईए) के अलावा एल्डिहाइड समूह प्रदान करता है जो फाइब्रोनेक्टिन के अमाइन समूहों को सहसंयोजक रूप से बांधते हैं।

हमने पीए हाइड्रोजेल तैयार किए, जो मोटाई में लगभग 60 μm हैं और हाइड्रोजेल सतह के करीब ऊपरी परत में फ्लोरोसेंट मोतियों को सीमित करते हैं। इस प्रकार के हाइड्रोजेल उलटे माइक्रोस्कोप और काफी मोटी के साथ सेलुलर कर्षण इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट है (टीएफएम करने के लिए न्यूनतम मोटाई को ग्लास सब्सट्रेट के किसी भी प्रभाव को रोकने के लिए 20-30 μm) 18 होने की सूचना दी गई है। फ्लोरोसेंट मोतियों के स्थानीयकरण को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1I) द्वारा चित्रित किया गया था। हाइड्रोजेल पर प्रोटीन हस्तांतरण की कल्पना करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईसीएम प्रोटीन का उपयोग किया और उन्हें एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 जे) द्वारा चित्रित किया। हमने कोशिकाओं या एकल कोशिकाओं के समूहों के आसंजन की अनुमति देने के लिए 100 μm (बाईं ओर) और 50 μm (दाईं ओर) के व्यास के साथ फाइब्रोनेक्टिन के माइक्रोपैटर्न्ड सर्कल तैयार किए, जैसा कि अनुयायी कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के ओवरले में दिखाया गया है, और फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए फिड्यूशियल मोतियों और फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न्स। एक अलग नमूने पर, माइक्रोपैटर्न्ड फाइब्रोनेक्टिन के लिए एकल कोशिकाओं की आसंजन प्रतिक्रिया को अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पैक्सिलिन (चित्रा 1K) जैसे फोकल आसंजन प्रोटीन के स्थानीयकरण की छवि के लिए मान्य किया गया था।

ईसीएम प्रोटीन कोटिंग और हाइड्रोजेल कठोरता दोनों सेल आसंजन 26 के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। हमारे पीए हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए, हमने AFM27 द्वारा नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों का प्रदर्शन किया, जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित था। तीन अलग-अलग कठोरताओं के हाइड्रोजेल सब्सट्रेट तैयार किए गए थे और हमारे सेटअप (चित्रा 2 और तालिका 1) के साथ परीक्षण किया गया था। गोले के आकार के AFM कैंटिलीवर को चक्रीय रूप से संपर्क किया गया था और बिना पेटेंट पीए हाइड्रोजेल और फाइब्रिनोजेन से वापस ले लिया गया था, जो एलेक्सा 488-माइक्रोपैटर्नेड क्षेत्रों में संयुग्मित थे, जबकि बल-दूरी घटता रिकॉर्ड करते हुए। इसके बाद, संपर्क बिंदु मूल्यांकन और हर्ट्ज मॉडल के आवेदन ने हमें प्रत्येक नमूने के यंग के मापांक (ई) का अनुमान लगाने की अनुमति दी। ईसीएम माइक्रोपैटर्निंग ने यंग के मापांक को नहीं बदला, जो कि प्रत्येक अनपेक्षित पीए हाइड्रोजेल के बराबर रहा।

सब्सट्रेट पर अनुयायी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए कर्षण बलों को मापने के लिए, हमने सेल ट्रैक्शन (चित्रा 3 ए) को जारी करने के लिए यूवी लेजर मॉड्यूल (यूवी-ए 6000 एमजे / एमएम 2) के पास से सुसज्जित एक वाइडफील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर किए गए संदर्भ आधारित टीएफएम के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप विकसित किया। चूंकि लेजर बीम रोशनी को स्पैटियो-अस्थायी रूप से नियंत्रित किया जा सकता है, न केवल उच्च लेजर खुराक के साथ एक एकल सेल या सेल क्लस्टर को चुनिंदा रूप से उजागर करना संभव है, बल्कि यह भी और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि ट्रिप्सिन जैसे पाचन एंजाइम का उपयोग करके पूरे नमूने से सेल हटाने का विघटनकारी मध्यवर्ती चरण अब आवश्यक नहीं है। इस तरह के एक उच्च लेजर खुराक के साथ रोशन कोशिकाओं ने एक ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित किया जिससे कोशिका मृत्यु हो गई (चित्रा 3 बी)। सेल की मृत्यु ने सब्सट्रेट से कर्षणों की रिहाई को प्राप्त किया, जैसा कि मनका विस्थापन द्वारा इंगित किया गया है (चित्र 3 ए में सचित्र)। हमने पीए हाइड्रोजेल (चित्रा 3 बी-सी) के माइक्रोन-आकार के क्षेत्रों को चुनिंदा रूप से रोशन करने के लिए एक प्रकाश पैटर्निंग मॉड्यूल के साथ यूवी-ए रोशनी को जोड़ा। इस तरह माइक्रोपैटर्न्ड सेल क्लस्टर (चित्रा 3 सी, एफ) या एकल कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के कर्षण को जारी करना संभव है। महत्वपूर्ण रूप से, हमारे समय में ईसीएम पैटर्न वाले हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुण यूवी एक्सपोजर (चित्रा 2 सी) से काफी प्रभावित नहीं थे। ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि को चित्र 3 डी, ई में दिखाया गया है। सामान्यीकृत क्रॉस सत्यापन (चित्रा 3B, F) द्वारा चुने गए नियमितीकरण पैरामीटर के साथ नियमितीकृत FTTC का उपयोग करके कर्षण बलों का पुनर्निर्माण किया गया था। एकल कोशिकाओं के लिए बलों की रिहाई 15 मिनट की अवधि में हुई, और LUVI-TFM का परिणाम ट्रिप्सिन-आधारित TFM (चित्रा 3G-H) के बराबर है।

Figure 1
चित्र 1: TFM के लिए पैटर्न वाले फाइब्रोनेक्टिन-सब्सट्रेट तैयारी की योजना। (A) नीचे की परत के लिए समाधान एक मेथाक्रिलेटेड सतह पर पाइप किया गया है। (बी) एक छोटे से साफ कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक बूंद पर रखा जाता है। (C) जेलेशन का समय 45 मिनट है। (D) शीर्ष कवरस्लिप अलग हो गया है। नीचे की परत तैयार है। (ई) शीर्ष परत के लिए समाधान हाइड्रोजेल पर पाइप किया गया है। (च) पैटर्न वाले कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक बूंद पर रखा जाता है। (F') कांच पर चिपकने वाले प्रोटीन के माइक्रोपैटर्निंग को यूवी-लिथोग्राफी के पास मास्कलेस द्वारा उत्पादित किया जाता है, और फिर ग्लास से पीए हाइड्रोजेल में स्थानांतरित किया जाता है। चिपकने वाले प्रोटीन के मुक्त अमाइन समूह, उदाहरण के लिए, फाइब्रोनेक्टिन, पीए सतह पर एल्डिहाइड समूहों के लिए सहसंयोजक रूप से बांधते हैं। (G) जेलेशन का समय 45 मिनट है। (H) शीर्ष कवरस्लिप अलग हो गया है। पैटर्न पीए हाइड्रोजेल तैयार है। (I) एक confocal xyz माइक्रोग्राफ का एक 3 डी प्रतिनिधित्व सतह के पास fiducial मोतियों का एक उच्च घनत्व दिखा. (जे) एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों (हरे) के साथ पीए की सतह पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले फाइब्रोनेक्टिन (मैजेंटा) का एक माइक्रोग्राफ, कोशिकाओं की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ ओवरले किया गया है। (के) एक सर्कल के आकार के फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न (100 μm) का पालन करने वाले एकल सेल की अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग। नाभिक (नीला), पैक्सिलिन (लाल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: AFM द्वारा नमूना यांत्रिक गुणों का लक्षण वर्णन. (ए) एएफएम नैनोइंडेंटेशन प्रायोगिक सेटअप। एक गोले के आकार के कैंटिलीवर का उपयोग यूवी उपचार से पहले या बाद में ईसीएम माइक्रोपैटर्न की जांच करने के लिए किया जाता है, और दोहरे स्तरित पीए (5% एक्रिलामाइड, 0.3% बिस्-एक्रिलामाइड) क्षेत्रों के गैर-पैटर्न वाले क्षेत्रों। (बी) ईसीएम माइक्रोपैटर्न (काला) के लिए प्रतिनिधि बल बनाम इंडेंटेशन वक्र। हर्ट्ज फिट (लाल) का उपयोग नमूने के यंग के मापांक (ई) की गणना करने के लिए किया जाता है। (ग) यूवी-ए एक्सपोजर के बाद गैर-पैटर्न वाले दोहरे स्तरित पीए क्षेत्रों (कोई ईसीएम), ईसीएम माइक्रोपैटर्न और ईसीएम माइक्रोपैटर्न के लिए यांत्रिक माप। सलाखों का मतलब एसई .M ± है (ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा परीक्षण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. स्थानीय यूवी-ए रोशनी टीएफएम (LUVI-TFM) दृश्य के एक बड़े क्षेत्र के अंदर स्थानीय कर्षण बल माप को सक्षम बनाता है। (ए) स्थानीय यूवी-ए रोशनी टीएफएम की योजना। कोशिकाओं को यूवी-ए लेजर की एक उच्च खुराक के साथ इलाज किया जाता है ताकि अविकसित (संदर्भ) छवि प्राप्त की जा सके। (बी) यूवी-ए लेजर रोशनी से पहले एक एकल सेल की ब्राइटफील्ड छवि। मध्य: यूवी-ए लेजर रोशनी के बाद एक एकल सेल की ब्राइटफील्ड छवि। दाएँ: एक एकल एमईएफ का कर्षण बल एक फाइब्रोनेक्टिन लेपित पीए हाइड्रोजेल (ई = 5.74 केपीए) का पालन करता है जो 50 μm व्यास यूवी-लाइट बीम (लाल धराशायी रेखा) के साथ प्रकाशित होता है। (सी) बाएं: माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) के एक समूह के कर्षण बलों की रिकॉर्डिंग माइक्रोपैटर्न्ड फाइब्रोनेक्टिन (सर्कल, 100 μm व्यास) का पालन करते हुए। क्लस्टर को 200 μm व्यास यूवी-लाइट बीम (लाल धराशायी रेखा) के साथ रोशन किया गया था। दाएँ: माउस भ्रूण fibroblasts (MEF) के एक समूह के कर्षण बलों की रिकॉर्डिंग micropatterned फाइब्रोनेक्टिन (सर्कल, 300 μm व्यास) का पालन. क्लस्टर को 300 μm व्यास यूवी-लाइट बीम (लाल धराशायी रेखा) के साथ रोशन किया गया था। स्केल बार = 200 μm. (D,E) एक उच्च यूवी-ए लेजर खुराक के बाद बढ़ी हुई Cy5 सिग्नल तीव्रता द्वारा इंगित कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जाता है। ऑक्सीडेटिव तनाव कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। स्केल बार = 200 μm. (F) बाएँ: माउस भ्रूण fibroblasts (MEF) के एक समूह से तनाव गर्मी मानचित्र micropatterned फाइब्रोनेक्टिन (सर्कल, 100 μm व्यास) का पालन। दाएँ: माउस भ्रूण fibroblasts (MEF) के एक समूह से तनाव गर्मी मानचित्र micropatterned फाइब्रोनेक्टिन (सर्कल, 300 μm व्यास) का पालन. (जी) 100 μm फाइब्रोनेक्टिन माइक्रोपैटर्न का पालन करने वाली एमईएफ कोशिकाएं यूवी-ए एक्सपोजर के बाद धीरे-धीरे अपने कर्षण जारी करती हैं। पूर्ण रिलीज 15 मिनट के बाद प्राप्त की जाती है (संदर्भ छवि को तब 15 मिनट के बाद लिया गया था)। (एच) 300 μm व्यास पैटर्न-फाइब्रोनेक्टिन का पालन करने वाली एमईएफ कोशिकाओं के लिए पारंपरिक ट्रिप्सिन आधारित-टीएफएम के साथ तुलना। यूवी-ए रोशनी (6,000 एमजे / एमएम 2) के परिणाम के बाद 15 मिनट की प्रतीक्षा पारंपरिक ट्रिप्सिन उपचार (यानी, 20 मिनट के लिए 0.05%) से गैर-महत्वपूर्ण रूप से अलग है। सलाखों का मतलब एसई.M (दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट, **** पी < 0.0001, * पी < 0.05, एनएस पी ≤0.5) का मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक्रिलामाइड (%) बिस-एक्रिलामाइड (%) 40% स्टॉक समाधान (मिलीलीटर) से एक्रिलामाइड 2% स्टॉक समाधान (मिलीलीटर) से बीआईएस-एक्रिलामाइड पानी (मिलीलीटर) यंग का मापांक (kPa)
4 0.1 1 0.5 8.5 5,74 ± 0,53
5 0.15 1.25 0.75 8 9,69 ± 0,68
5 0.3 1.25 1.5 7.25 11,33 ± 1,06

तालिका 1: हाइड्रोजेल स्टॉक समाधान मिश्रण और परिणामी लोच

सभी डेटा मैक्स प्लैंक सोसाइटी (एडमंड) के ओपन एक्सेस डेटा रिपॉजिटरी में जमा किए जाते हैं और निम्नलिखित पते के माध्यम से एक्सेस किए जा सकते हैं: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम फ्लोरोसेंट मोतियों वाले माइक्रोपैटर्न पीए हाइड्रोजेल की तैयारी का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग टीएफएम अध्ययनों के लिए फिड्यूशियल मार्करों के रूप में किया जाता है। हमारा दृष्टिकोण तीन चरणों पर आधारित है: 1) दोहरी-स्तरित पीए हाइड्रोजेल की तैयारी; 2) ईसीएम प्रोटीन के micropatterning और हाइड्रोजेल सतह पर उनके हस्तांतरण; 3) TFM के लिए पैटर्न के पास यूवी प्रकाश का उपयोग करें। सब्सट्रेट के लिए सेल कर्षण का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप को फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन से संबंधित बलों की गणना करने के लिए ज्ञात कठोरता मूल्यों के साथ रैखिक लोचदार सामग्री के उपयोग की आवश्यकता होती है26। पीए हाइड्रोजेल तैयार करना आसान है, कठोरता को आसानी से ट्यून किया जा सकता है, और वे आमतौर पर कठोरता संवेदन और टीएफएम 18,28 के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, पूरे हाइड्रोजेल के पुनरुत्पादक पोलीमराइजेशन समय और सजातीय पोलीमराइजेशन प्राप्त करने के लिए, अभिकर्मकों के लिए स्थितियों और समय को संग्रहीत करने पर ध्यान दिया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, एपीएस को अपनी गतिविधि को खोने से बचने के लिए एक डेसिकेटर में रखा जाना चाहिए; TEMED को प्रत्यक्ष प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। ऑक्सीकृत एचईए का उपयोग हाइड्रोजेल सतह पर मैट्रिक्स प्रोटीन के सहसंयोजक बंधन की अनुमति देता है, जो एक पूर्ण और स्थिर प्रोटीन परत के गठन को प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। ऑक्सीकृत HEA समाधान हर बार पीए hydrogels गढ़े जाते हैं ताजा तैयार किया जाना चाहिए. दोहरी स्तरित पीए हाइड्रोजेल तीन मुख्य लाभ प्रदान करता है: 1) यह जेल को बेहद पतला बनाने की आवश्यकता के बिना हाइड्रोजेल सतह के पास फिड्यूशियल मोतियों का एक समरूप वितरण प्राप्त करने का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है (यानी, <20 μm)। हाइड्रोजेल मोटाई पर नियंत्रण टीएफएम के साथ सटीक माप प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब लोचदार सब्सट्रेट बहुत पतला होता है, तो फाइब्रोब्लास्ट जैसी मजबूत अनुयायी कोशिकाएं अंतर्निहित कठोर ग्लास सब्सट्रेट 29,30 को समझ सकती हैं और यांत्रिक रूप से प्रतिक्रिया कर सकती हैं। मोटी हाइड्रोजेल बल पुनर्निर्माण के लिए छवि अधिग्रहण को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इसके अलावा, कई माइक्रोस्कोप में उन्हें समायोजित करने के लिए पर्याप्त स्थान नहीं होगा, हाइड्रोजेल को संलग्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास सब्सट्रेट की अतिरिक्त मोटाई पर विचार करते हुए, जब तक कि अल्ट्राथिन माइक्रोस्कोपी स्लाइड का उपयोग नहीं किया जाता है। 2) दोहरी स्तरित पीए हाइड्रोजेल में, पीए हाइड्रोजेल की सतह के पास फिड्यूशियल मोतियों का समरूप वितरण एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग किए बिना प्राप्त किया जाता है, बल्कि हाइड्रोजेल समाधान और फ्लोरोसेंट मोतियों की सटीक मात्रा के एक सरल इनक्यूबेशन के साथ। PIV विश्लेषण करते समय उच्च मनका घनत्व महत्वपूर्ण लाभ का होता है क्योंकि यह कर्षण बलों के संकल्प और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता के बिना सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाता है। 3) सेल-सामग्री इंटरफ़ेस के करीब एक पतली परत में मोतियों को सीमित करना एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ-साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कर्षण बलों की इमेजिंग को सक्षम बनाता है। हाइड्रोजेल तैयार करते समय, उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले यह दृढ़ता से नीचे के ग्लास का पालन करता है। हम हाइड्रोजेल परतों के पोलीमराइजेशन के लिए संकेतित इनक्यूबेशन समय का पालन करने की सलाह देते हैं, क्योंकि हाइड्रोजेल सतह को नुकसान पहुंचाए बिना सतह के शीर्ष पर कांच को हटाना मुश्किल हो सकता है।

लोचदार गुणों को मापने के लिए सबसे प्रसिद्ध तकनीकें एएफएम, नैनोइंडेंटेशन, तन्यता परीक्षण और रियोमेट्री हैं। हालांकि, नैनोइंडेंटेशन उन सामग्रियों पर बहुत अधिक उपभेदों को प्रेरित करता है जो लोचदार गुणों के निर्धारण को प्रभावित कर सकते हैं। दूसरी ओर तन्यता परीक्षण और रिओमेट्री मैक्रोस्कोपिक माप तकनीकें हैं, जबकि कोशिकाएं एक सूक्ष्म पैमाने पर बातचीत करती हैं31,32। एएफएम शारीरिक परिस्थितियों के तहत कम उपभेदों के साथ माइक्रोस्केल पर माप की अनुमति देता है। AFM माप की विश्वसनीयता प्रतिकूल रूप से प्रभावित हो सकती है यदि प्रयोगात्मक विवरण अनुपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, इंडेंटेशन बल और गति) या अपर्याप्त डेटा रिकॉर्ड किया गया है27। Huth et al. AFM डेटा से यंग के मोडुली को निकालने के लिए एक एल्गोरिथ्म का वर्णन करता है, जो माप विवरण को स्थिर रखने पर जोर देता है27। यह एल्गोरिथ्म यंग के मोडुली का एक सटीक और विश्वसनीय निर्धारण प्रदान करता है और इसका उपयोग हमारे प्रयोगों के लिए किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने अलग-अलग दिनों में बनाए गए नमूनों पर कई वक्रों को मापा और बहुत समान परिणाम प्राप्त किए (ca. 1-2 kPa के माध्य मानों की भिन्नता)। इससे पता चलता है कि हमारे जैल की कठोरता की मज़बूती से भविष्यवाणी की जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल में, हम कांच पर माइक्रोपैटर्न्ड क्षेत्रों को बनाने के लिए एक फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग करते हैं, जिसे तब हाइड्रोजेल सतहों पर स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया माइक्रोपैटर्निंग डीएमडी (डिजिटल माइक्रो-मिरर डिवाइस) -आधारित मास्कलेस नियर-यूवी लिथोग्राफी (π = 375 एनएम)7 पर आधारित है। एक डीएमडी में एक चिप पर बड़ी संख्या में माइक्रोमिरर होते हैं। एक एकल पिक्सेल एक एकल माइक्रो-मिरर से मेल खाता है। एक कंप्यूटर से पिक्सेलेटेड पैटर्न छवि फ़ाइल को डीएमडी के माध्यम से प्रक्षेपित किया जाता है और एक उद्देश्य लेंस का उपयोग करके सतह पर केंद्रित किया जाता है। प्रोटीन के माइक्रोपैटर्निंग के लिए, केंद्रित लेजर प्रकाश का उपयोग एक फोटोइनिशिएटर की मदद से विकर्षक बहुलक ब्रश को क्लीव करने के लिए किया जाता है। बाद में, उजागर क्षेत्रों को ईसीएम प्रोटीन से भर दिया जाता है। यह मुखौटा रहित एब्लेशन विधि नए पैटर्न डिजाइन करने में महान लचीलापन प्रदान करती है, क्योंकि यह फोटोमास्क के उपयोग पर भरोसा नहीं करती है। एक पैटर्न को डिजाइन करना और लागू करना बहुत आसान है क्योंकि इंकस्केप जैसे फ्रीवेयर का उपयोग करके केवल कई मिनट लगते हैं। हालांकि, कम समय में उत्पादित पैटर्न और नमूने की संख्या एक बड़ी खामी है, क्योंकि इस विधि का उपयोग केवल हर बार एक सब्सट्रेट को पैटर्न करने के लिए किया जा सकता है। फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल एक निकट यूवी ठोस-राज्य लेजर स्रोत का उपयोग करता है जो कई मिलीवाट का उत्सर्जन करता है। बिना तेल वाली लेजर बीम आंखों और त्वचा के लिए खतरनाक है। परावर्तित और बिखरे हुए प्रकाश और विकिरण भी खतरनाक हो सकते हैं। हैंडलिंग लेजर अधिकारियों से एक सुरक्षा निर्देश के साथ किया जाना चाहिए। एक फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग करते समय प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोपैटर्निंग और एब्लेशन के दौरान लेजर ठीक से सतह पर केंद्रित है। पैटर्निंग के दौरान यूवी-लाइट की एक सुसंगत रोशनी खुराक (समय से गुणा तीव्रता) इस बात पर निर्भर करती है कि लेजर सतह पर कैसे केंद्रित है। खराब फोकस के कारण सतह पर एक कमजोर तीव्रता के परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल सतह पर ईसीएम हस्तांतरण की विफलता हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप कोई कोशिकाएं हाइड्रोजेल से जुड़ी नहीं होती हैं।

टीएफएम प्रयोगों में, अनुयायी कोशिकाओं और फिड्यूशियल मार्करों की प्रारंभिक इमेजिंग के बाद, कोशिकाओं को उनके आराम की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए ट्रिप्सिन उपचार द्वारा पीए हाइड्रोजेल से जारी किया जाता है। इस चरण को निष्पादित करने में एक दोष माइक्रोस्कोपी चरण पर नमूने को संभाल रहा है। एक परफ्यूजन कक्ष के बिना, पकवान के ढक्कन को खोलना, माध्यम को एस्पिरेट करना, रिंसिंग, और पिपेटिंग ट्रिप्सिन समाधान शुरुआती और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। वास्तव में, ये प्रक्रियाएं xyz अक्षों में बहाव का एक प्रमुख स्रोत हैं, जिसके परिणामस्वरूप स्थिति और फोकस का नुकसान होता है। हमारे स्थानीय-यूवी रोशनी प्रोटोकॉल टीएफएम को शुरुआती लोगों के लिए एक अधिक सुलभ तकनीक बनाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी-आधारित मास्कलेस फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग किया, लेकिन सिद्धांत रूप में किसी भी यूवी-ए प्रकाश प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है, अंततः सब्सट्रेट के क्षेत्रों की रक्षा के लिए मास्क के साथ संयोजन में, जहां सेल कर्षण बलों को दर्ज नहीं किया जाना चाहिए। कम तरंग दैर्ध्य दृश्यमान प्रकाश की एक महत्वपूर्ण खुराक के साथ कोशिकाओं को उजागर करना (उदाहरण के लिए, बैंगनी प्रकाश जो डीएपीआई उत्सर्जन को उत्तेजित करता है) ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि का कारण बनेगा, जिसके परिणामस्वरूप फोटोटॉक्सिसिटी और सेल मृत्यु हो सकती है। इसलिए, इस तकनीक को यूवी लेजर मॉड्यूल के बिना एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि तीव्रता बहुत कमजोर है, इस मामले में एंजाइमेटिक उपचार के साथ टीएफएम को पूरा करना बहुत आसान होगा।

LUVI-TFM के साथ एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के छोटे समूहों की स्थानीय टुकड़ी के कारण कई मापों के लिए एक ही नमूने का उपयोग करना संभव है। हालांकि, पड़ोसी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग बलों से बचने के लिए, अलग करने के लिए कोशिकाओं के चयन पर ध्यान दिया जाना चाहिए। इस प्रकार, माइक्रोपैटर्न की अनुपस्थिति में एकल सेल माप के लिए, भीड़-भाड़ वाले क्षेत्रों से बचा जाना चाहिए; एकल माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं पर माप के लिए, पैटर्न को इस तरह से डिज़ाइन किया जाना चाहिए कि एकल संरचनाओं के बीच की दूरी कम से कम पैटर्न वाले क्षेत्र के व्यास से दोगुनी हो। हम अनुक्रम में आसन्न पैटर्न से कोशिकाओं का उपयोग नहीं करने की भी सलाह देते हैं, बल्कि सब्सट्रेट पर दूर के क्षेत्रों से उनका नमूना लेते हैं। हमारा माप एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर अच्छी तरह से आयोजित किया जाता है जो एक फोकस नियंत्रण सुविधा और 40 x एयर एनए = 0.9 लेंस से सुसज्जित होता है, जहां लेंस की काम करने की दूरी पर्याप्त रूप से लंबी होती है और एक अच्छी तरह से दूसरे तक तेजी से आंदोलन अत्यधिक ट्यूनेबल होता है। TFM अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की लक्षित टुकड़ी एक एकल सेल या एक पूरे छोटे सेल क्लस्टर के सेलुलर बल को मापने के लिए प्रभावी है (उदाहरण के लिए, व्यास में 300 μm तक)। हमारे सेटअप का उपयोग करते हुए, हमने एकल कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के यूवी उपचार के लिए सेल गोलाई और टुकड़ी देखी, जबकि छोटे सेल क्लस्टर के लिए टुकड़ी शायद ही कभी हुई। यह सेल कर्षण बलों के एक कम करके आंकने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। बड़े सेल क्लस्टर के लिए, एंजाइमेटिक टुकड़ी की सिफारिश की जाती है, क्योंकि उपयोगकर्ताओं को पूरे क्लस्टर की छवि के लिए 20x हवा के उद्देश्य का उपयोग करना चाहिए और एक फोकस नियंत्रण सुविधा की आवश्यकता होती है। चूंकि 20x एयर लेंस के फोकस की गहराई बहुत लंबी है, इसलिए हैंडलिंग उच्च आवर्धन उद्देश्य के रूप में महत्वपूर्ण नहीं होगी। उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कोशिकाओं के एब्लेशन के लिए फोकस सही ढंग से सेट किया गया है, क्योंकि रोशनी की खुराक सतह पर लेजर फोकस पर निर्भर है। जबकि हम पड़ोसी अनुपचारित कोशिकाओं के साथ संभावित यांत्रिक बातचीत के कारण सेल कलेक्टिव में एलयूवीआई-टीएफएम का उपयोग करने में संभावित सीमाओं से अवगत हैं, यह पहलू वास्तव में लक्षित सेल एक्सट्रूज़न के यांत्रिकी पर अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, उपकला मोनोलेयर्स से।

अंत में, हमारे TFM दृष्टिकोण के साथ माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं के प्रकाश प्रेरित रिलीज के साथ संयुक्त, हम सेल आसंजन बलों को मापने के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को रिज़ॉल्यूशन और संवेदनशीलता में सुधार के उद्देश्य से माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके आगे बढ़ाया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल वीडियो उत्पादन में समर्थन के लिए श्रीमती रेबेका अल्वाराडो और पांडुलिपि पर रचनात्मक आलोचना के लिए श्री स्टीफन कैसले को धन्यवाद देते हैं। हम सेलुलर बायोफिज़िक्स विभाग के सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं, मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च सहायक चर्चाओं के लिए। मैक्स-प्लैंक-Gesellschaft से E.A.C.-A तक वित्तीय सहायता। और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 से E.A.C.-A. और P4 से U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 अमेरिका के लिए) को भी बहुत स्वीकार किया जाता है। J.B. वित्तीय सहायता के लिए कार्ल Zeiss फाउंडेशन धन्यवाद. E.A.C.-A., C.S. और U.S.S. जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) द्वारा समर्थित मैक्स प्लैंक स्कूल मैटर टू लाइफ के माध्यम से धन स्वीकार करते हैं। सीएस यूरोपीय अनुसंधान परिषद (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate #440159 Sigma Aldrich
Acetic acid #33209 Honeywell
Acrylamide 40 % #1610140 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
AFM cantilever #CP-CONT-BSG-A-G NanoAndMore 5 μm spherical tip
AFM system #NanoWizard3 JPK Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter
Ammonium persulfate #A3678 Sigma
Bis-acrylamide 2 % #1610142 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
Camera sCMOS #C11440-42U30 Hamamatsu
Camera sCMOS #ANDORZYLA4.2 Oxford Instrument
CellRox #C10422 Thermo Fisher
Custom incubator chamber EMBLEM
Dental glue #1300 100 Picodent
DMEM #41965 Thermo Fisher
Epifluorescence microscope #Eclipse Ti2E Nikon
Epifluorescence microscope #Axiovert200 Zeiss
Ethanol #9065.3 Carl Roth
FBS South America #S181T Thermo Fisher
Fibrinogen #F13191 Invitrogen Alexa488 conjugate
Fibronectin #F1141 Sigma
Fluorescent beads 200 nm #F8805 Invitrogen Carboxylated (365/415)
Fluorescent beads 200 nm #F8848 Invitrogen Carboxylated (505/515)
Fluorescent beads 200 nm #F8810 Invitrogen Carboxylated (580/605)
Fluorescent beads 200 nm #F8807 Invitrogen Carboxylated (660/680)
Glass coverslip 15 mm round #41001115 Assistent
Glass coverslip 24 mm round #41001124 Assistent
Microscope Objective #MRH08230 Nikon 20x air NA 0.45
Mouse Embryonic Fibroblasts #CRL-2991 ATCC
mPEG-SVA #MPEG-SVA-5000 Laysan Bio
N-Hydroxyethyl acrylamide #697931 Aldrich
Plasma cleaner #100-E TePla
PLPP gel #PLPPgel Alveole
Poly-L-lysine #P4823 Sigma Aldrich
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) SuSoS
Sodium(meta) periodate #S1878 Sigma Aldrich
TEMED #17919 Thermo Scientific
UV Patterning module #PRIMO Alveole
UVO cleaner #342-220 Jelight

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References

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Bioengineering अंक 179 कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (TFM) micropatterns hydrogels सेल आसंजन बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स सेल यांत्रिकी निकट पराबैंगनी (यूवी) लिथोग्राफी
कर्षण बल माइक्रोस्कोपी में अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल पैटर्निंग तकनीकों का उपयोग कर सेल आसंजन का नियंत्रण
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