大鼠颈静脉永久性插管术的显微外科技术用于口服给药后连续血液采样

摘要

本文展示了建立长期颈静脉插管大鼠模型的详细显微外科技术，用于在同一动物体内进行连续血液采集。在大鼠恢复期间，监测了其生理和血液学参数。该模型已应用于研究口服多酚的药代动力学，且不会引起动物应激反应。

摘要

在小型实验动物中采血对于药物先导化合物的优化是必要的，但可能对实验动物造成严重伤害和应激，从而可能影响实验结果。大鼠颈静脉插管（JVC）是一种广泛用于重复采血的模型，但需要熟练的外科手术技能和动物护理培训。本文详细描述了建立和维持永久性JVC大鼠模型的显微外科操作步骤，重点介绍颈静脉导管的放置与封堵方法。文章强调了监测生理学参数（如体重、食物和水的摄入量）及血液学参数的重要性，并展示了术后6天内大鼠恢复期间的相关结果。此外，在JVC大鼠模型中测定了口服给予的天然酚类化合物鞣花酸的药物血浆浓度-时间曲线。

引言

从小型实验动物（如啮齿类、豚鼠和兔）中多次采集血样，是药物先导化合物优化的重要环节，也有助于减少科研中所使用的动物数量^1,2开发新诊断工具和药物制剂（如疫苗）的流程需要获取不同体积的血液，以评估其稳健性和性能 体内，例如药代动力学（PK）、毒性和敏感性^3,4,5.

血液样本采集的实验室方法 broadly 分为两类：手术法和非手术法⁶非手术方法相对易于掌握，包括心脏穿刺、眶窦穿刺以及隐静脉和尾静脉采血等常用技术。某些非手术方法可实现多次采血，但采血量较小，且可能对动物造成身体创伤和心理应激。¹另一方面，手术方法是重复穿刺采血的常用替代方案，涉及在动物血管中置入临时或永久性导管^7,8,9通过插管可在清醒大鼠中反复采集大量血液，同时避免因操作技术、固定及麻醉所引起的压力与疼痛

方案

以下所述操作步骤是根据西北工业大学机构动物护理和使用委员会批准的方案（编号：202101117）进行的。

1. 术前准备（手术前一天）

注意：所需溶液包括生理盐水（0.9% w/v 氯化钠）、肝素化生理盐水（1% w/v 肝素钠）、导管封管液、非甾体抗炎药（NSAID），例如美洛昔康溶液（2 mg/mL）。

1. 溶液配制
   1. 在1.5 mL无菌微量离心管中分装200 µL预包装导管封管液。
      注意：导管封闭液由肝素化生理盐水（0.4% v/v 肝素钠）与甘油按体积比1:1混合而成。
   2. 将1 g肝素钠与100 mL生理盐水混合，制备1%肝素化生理盐水。
   3. 将美洛昔康溶于生理盐水中，配制浓度为2 mg/mL的溶液，用于术后镇痛。
      注意：制备好的肝素化生理盐水和美洛昔康溶液需经0.22 µm滤器过滤。所有溶液均须灭菌后于4°C保存，以备后续使用。
2. 手术器械与材料
   1. 将所有清洁的手术器械装入一个袋子中，并用一条高压灭菌指示胶带封口。参考 图1A 针对所使用的特定外科手术器械。
   2. 将手术包在121 °C下高压灭菌30分钟，以备次日使用。

结果

本方案已全面展示了如何利用显微外科技术建立长期的JVC模型，以进行系列血液采集。 图1A 展示了进行手术所需的关键外科器械和材料。图中还标明了带有三个蓝色标记的PU导管规格，这有助于研究人员在步骤3.3中正确放置静脉插管。.，如何利用PU导管上的刻度标记来引导插管（图1B）。建立JVC大鼠模型所需的时间线也需充分了解图1C）。尽管JVC手术的操作时间约为35分钟，但如果研究人员技术熟练，JVC大鼠模型需要10–14天（适应与恢复期）方可投入使用；相比之下，非手术方法（如断尾法或眶窦穿刺）在经过适当培训后可立即使用。

术后6天内的生理和血液学状况也进行了研究（图2）。在恢复期间，大鼠的体重增长、食物和水的摄入量以及全血细胞计数均存在波动（图2A、B

讨论

掌握血管插管技术需要大量的练习，并从每次操作中吸取经验。Christakis 等人通过累积和（CUSUM）分析发现，研究人员需要在一年内对 200 只大鼠进行练习，才能具备开展候选药物药代动力学（PK）评价的能力²⁰。然而，随着操作大鼠数量的增加，静脉插管所需的手术时间可显著缩短^13,20。采用本方案后，成功插管颈静脉并采集血样的成功率从约 50% 提高至 80% 以上（共操作 15 只大鼠），初始手术时间也从 2 小时缩短至 35 分钟。

建立JVC大鼠模型的演示包含多个关键步骤。首先，颈部周围的切口区域对于初始定位颈静脉至关重要。若进行右侧JVC操作，切口区域通常选择在锁骨上方、沿颈部中线右侧的位置（参见第3.2节颈静脉分离）。其次，JVC的成功依赖于制备一段清洁的静脉。在钝性分离软组织后，颈静脉可通过以下两个特征进行识别：1）近端具有两个分支；2）附着有淋巴结。第三，在将导管插入颈静脉时（参见第3.3节颈静脉插管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含EDTA抗凝剂的0.5 mL离心管	Xinkang	N/A	采集血液样本用于血液学检测
0.5*20 mm 1.0-mL注射器	KLMEDICAL	N/A	用生理盐水冲洗或更换液体
0.6*28.5 mm 5.0-mL注射器	HD	N/A	皮下注射
1.0-mL钝头注射器（22G）	skillsmodel	S4-PKT22G	通过导管注射生理盐水并采集血液样本
1.5 mL无菌微量离心管	Axygen	MCT-150-C-S	储存无菌导管锁闭液、肝素化生理盐水和美洛昔康溶液
1.5 mL微量离心管	Biosharp	BS-15-M	血液采集
1/2 圆弧切割 5*12 mm缝合针	skillsmodel	S4-FHZ	穿入肌层以固定导管
3/8圆弧切割 7*17 mm缝合针	skillsmodel	S5-FHZ	缝合大鼠皮层切口
6-0无菌不可吸收丝线	JUNSHENG	N/A	结扎
75%医用酒精	HONGSONG	N/A	消毒
粘性胶带	LIUTAI	N/A	固定大鼠体位
高压灭菌指示胶带	Biosharp	BS-QT-028	标记已灭菌物品
全自动血细胞分析仪	Sysmex	XN-550	血液学检测
Castroviejo显微剪刀	skillsmodel	WA1010	在血管上剪开切口
离心机	Thermo Fisher Scientific	75002402	血浆制备
清洁垫	Qingjie	N/A	准备手术区域
棉球	HC	N/A	伤口消毒与灭菌
棉签	BEITAGOGO	N/A	消毒
弯血管钳	skillsmodel	N/A	结扎
DN50不锈钢大鼠固定器	skillsmodel	S4-RGDQ1	限制大鼠活动以便操作
鞣花酸	Aladdin	E102710-25g	用于口服给药的天然酚类化合物
半弯镊子	skillsmodel	53072	提起肌层和组织，分离颈静脉并打结缝线
加热垫	Warm mate	N/A	防止动物体温流失
肝素钠	Solarbio	H8060	抗凝剂
碘伏	Xidebao	N/A	清洁伤口
虹膜剪刀	skillsmodel	54002	钝性分离肌层
异氟烷	RWD	R510-22-16	麻醉
LED灯	EMPERORFEEL	N/A	手术照明
液相色谱-质谱联用仪	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	检测血浆中药物浓度
美洛昔康	Hongqiang	N/A	镇痛药
生理盐水	KL	N/A	配制溶液并防止血管干燥
宠物剃毛刀	Codos	3180	剃除毛发
磷酸盐缓冲液	ZHHC	PW012	配制鞣花酸溶液
PU导管	skillsmodel	RJVC-PU	颈静脉插管
小动物手术麻醉控制台	RWD	68620	手术工作站
喷雾瓶	Other	N/A	无菌工作台
不锈钢堵头（22G）	skillsmodel	S4-PKD22G	堵塞导管以确保其密封性
不锈钢穿刺针芯	skillsmodel	S$-PKDGZ	引导导管穿出体外
无菌锁闭液	skillsmodel	SK-FB	封闭导管以维持其无菌状态
直式喂食针	skillsmodel	N/A	灌胃
手术包	BKMAM	N/A	用于手术器械灭菌的容器
手术剪刀	skillsmodel	J21070	在大鼠皮肤上剪切切口
血管扩张平衡镊	skillsmodel	WA3020	扩张血管并引导套管顺利插入
ZS-MV小动物麻醉机	ZSLab	1057003	诱导和维持麻醉