Summary
Aynı hayvanda sıralı kan alımı için daha uzun süreli juguler ven kanülasyon sıçanı modeli oluşturmak için ayrıntılı mikrocerrahi teknikler gösterilmiştir. Sıçanın iyileşme aşamasında fizyolojik ve hematolojik parametreler izlenmiştir. Bu model, hayvan stresine neden olmadan oral yoldan uygulanan polifenolün farmakokinetiğini incelemek için uygulanmıştır.
Abstract
Küçük laboratuvar hayvanlarında kan örneklemesi farmasötik kurşun optimizasyonu için gereklidir, ancak deney hayvanlarına büyük zarar ve strese neden olabilir ve bu da sonuçları potansiyel olarak etkileyebilir. Sıçanlarda juguler ven kanülasyonu (JVC), tekrarlanan kan alımı için yaygın olarak kullanılan bir modeldir, ancak cerrahi becerilerin ve hayvan bakımının yeterli eğitimini gerektirir. Bu makalede, juguler kanülün yerleştirilmesi ve sızdırmazlığına özel olarak odaklanarak kalıcı bir JVC sıçan modelinin kurulması ve sürdürülmesi için mikrocerrahi prosedürler detaylandırılmıştır. Fizyolojik (örneğin, vücut ağırlığı, yiyecek ve su alımı) ve hematolojik parametrelerin izlenmesinin önemi, sıçanın iyileşmesi sırasında ameliyat sonrası 6 gün boyunca sunulan sonuçlarla vurgulanmıştır. JVC sıçan modelinde oral yoldan uygulanan doğal fenol ellajik asidin ilaç-plazma konsantrasyon-zaman profili belirlenmiştir.
Introduction
Kemirgenler, kobaylar ve tavşanlar gibi küçük laboratuvar hayvanlarından kan örneklerinin tekrar tekrar alınması, farmasötik kurşun optimizasyonu ve ayrıca araştırmada kullanılan hayvan sayısını azaltmak için önemli bir husustur 1,2. Yeni tanı araçları ve ilaç formülasyonu (örneğin, aşı) geliştirme boru hattı, farmakokinetiği (PK), toksisitesi ve duyarlılığı 3,4,5 gibi sağlamlıklarını ve performanslarını in vivo olarak değerlendirmek için farklı kan hacimlerine erişim gerektirir.
Kan örneği toplamaya laboratuvar yaklaşımı genel olarak cerrahi ve cerrahi olmayan 6 olmak üzere iki tip olaraksınıflandırılır. Cerrahi olmayan yaklaşımın, kardiyak ponksiyon, orbital sinüs delinmesi ve safen ve kuyruk veninin kanaması gibi yaygın teknikleri içeren araştırmacı için kavranması nispeten kolaydır. Bazı cerrahi olmayan yöntemlerle çoklu kan örneklemesi mümkündür, ancak numune hacmi küçüktür ve hayvanlarda fiziksel yara ve psikolojik strese neden olabilir1. Öte yandan, cerrahi yaklaşım tekrarlanan venipunktura favori bir alternatiftir ve hayvanların kan damarlarına geçici veya kalıcı bir kanülün yerleştirilmesini içerir 7,8,9. Büyük kan hacmi, bilinçli sıçanlarda kanülden tekrar tekrar çekilebilirken, kullanım tekniği, kısıtlama ve anestezi 7,8,10,11 nedeniyle stres ve ağrıdan kaçınılabilir. Bununla birlikte, kanül implantasyonu, kanı başarılı bir şekilde toplamak için yeterli eğitime sahip deneyimli bir araştırmacı gerektirir.
Sıçanlarda juguler ven kanülasyonu (JVC) yoluyla kan toplanması, PK6,10,12,13 ilacını incelemek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, JVC sıçan modelinin kurulması, mikrocerrahi becerilerin dikkatli bir şekilde uygulanmasını ve cerrahi sonrası bakım ve bakım bilgisine ihtiyaç duymaktadır. Özellikle ameliyattan sonra sıçan, daha ileri deneyler için stabil fizyolojik duruma ulaşmak için analjeziklerin uygulanmasını ve yeterli iyileşme süresini gerektirir13,14,15. Vücut ağırlığı artışı (yani, >10 g), sıçanın iyileşmesi için geçerli ve yaygın olarak uygulanan bir gösterge olmasına rağmen, sıçanların, erken başlangıçtaki14,15'te fark edilmesi ince olabilen dehidrasyon, enfeksiyon ve iltihaplanma nedeniyle ameliyat sonrası beklenmedik bir ölüme sahip olmaları nadir değildir. Ek olarak, JVC modelinde kateter tıkanıklığı, kan alımı sırasında bir sorun olmaya devam etmektedir.
Mevcut protokol, juguler venin tanımlanması, izolasyonu ve kanülasyonuna özel olarak odaklanarak anestezi uygulanmış bir sıçanda JVC için mikrocerrahi prosedürleri ayrıntılı olarak göstermiştir. İyileşme aşamasında sıçanların fizyolojik ve hematolojik olarak izlenmesinin önemi vurgulanmaktadır. Son olarak, JVC sıçan modelini doğrulamak için oral yoldan uygulanan doğal fenol ellajik asidin PK'sini zayıf biyoyararlanımlı (yani düşük sistemik konsantrasyon) incelemek için venöz kateter yoluyla seri kan örnekleri toplandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan prosedürler, Northwestern Politeknik Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (No. 202101117) tarafından onaylanan bir protokolün parçası olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Preoperatif hazırlık (ameliyattan bir gün önce)
NOT: Gerekli çözeltiler: normal salin (% 0.9 w / v sodyum klorür), heparinize salin (% 1 w / v heparin sodyum), kateter kilit çözeltisi, meloksikam çözeltisi (2 mg / mL) gibi steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaç (NSAID).
- Çözelti hazırlama
- Aliquot 200 μL, 1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpünde önceden paketlenmiş kateter kilit çözeltisi.
NOT: Kateter kilit çözeltisi, gliserol (v/v,1:1) ile karıştırılmış heparinize salinden (%0.4 v/v heparin sodyum) oluşur. - % 1 heparinize salin hazırlamak için normal salinin 100 mL'sinde 1 g heparin sodyum karıştırın.
- Postoperatif ağrı kesici için 2 mg / mL'lik bir konsantrasyon çözeltisi hazırlamak için meloksikamı normal salin içinde çözün.
NOT: Hazırlanan heparinize salin ve meloksikam çözeltisi 0,22 μm'lik bir filtreden geçirilir. Tüm çözeltiler sterilize edilir ve ileride kullanılmak üzere 4°C'de saklanır.
- Aliquot 200 μL, 1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpünde önceden paketlenmiş kateter kilit çözeltisi.
- Cerrahi aletler ve malzemeler
- Tüm temiz cerrahi aletleri bir torbaya koyun ve bir parça otoklav sterilizasyon bandı ile bantlayın. Kullanılan spesifik cerrahi aletler için Şekil 1A'ya bakınız.
- Cerrahi torbayı ertesi gün kullanım için 30 dakika boyunca 121 °C'de otoklavlayın.
- Hayvan hazırlığı
- Ameliyattan önce, tüm erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını standart Hayvan Odası'nda 22 ± 1 ° C'de kontrollü sıcaklıkta barındırın. Onları en az 7 gün boyunca standart laboratuvar yiyecek ve su ad libitum ile besleyin.
NOT: JVC modeli için hem erkek hem de dişi sıçanlar kullanılabilir ve tipik yaşları ve vücut ağırlıkları sırasıyla 9-14 hafta ve 294 ± 57 g arasında değişir. - Sıçanı, anestezi öncesi bir odada oksijenle karıştırılmış% 3-3.5% izofluran ile anestezi yapın. Sıçanın ayak sıkışmasına tepki vermemesi nedeniyle bilinçsiz hale gelip gelmediğini belirleyin.
- Sıçanı yavaşça dışarı çıkarın, sıçanın burnunu% 2 -% 2.5 izofluran sağlayan anestezik bir burun parçasına yerleştirin.
- Ventral ve dorsal pozisyonda, kürkü sağ omzunun etrafına ve boynun arka bölgelerine tüy dökücü krem ve evcil hayvan tıraş bıçağı ile iyice çıkarın. Ertesi gün yapılacak ameliyat için sıçanı kafese geri getirin.
- Ameliyattan önce, tüm erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını standart Hayvan Odası'nda 22 ± 1 ° C'de kontrollü sıcaklıkta barındırın. Onları en az 7 gün boyunca standart laboratuvar yiyecek ve su ad libitum ile besleyin.
2. Ameliyattan önce gün
- Aseptik iş istasyonunu hazırlama
- Operasyon alanını dezenfekte etmek için% 75 tıbbi alkol püskürtün ve ardından temiz bir yastıkla kaplı ısıtma yastığını yerleştirin. LED lambayı iş istasyonunun yanında soğuk bir ışık kaynağıyla ayarlayın.
- Gerekli çözeltileri (adım 1.1) oda sıcaklığına önceden ısıtın.
- İki steril 1.0 mL künt uçlu şırıngada sırasıyla 0.6 mL heparinize salin ve 0.15 mL kateter kilit çözeltisi doldurun. Steril bir 5.0 mL şırınga kullanarak normal salinin 2.5 mL'sini çekin.
- Pamuk toplarını% 75 tıbbi alkole batırın. Kullanmadan önce fazla etanol sıkın.
- Sıçanın vücut ağırlığını tartın ve kaydedin.
3. Ameliyat sırasında
- Cerrahi hazırlık
- Cerrahi paltoyu, steril eldivenleri ve yüz maskesini takın. Daha sonra sterilize edilmiş cerrahi keseyi açın, tüm cerrahi aletleri% 75 tıbbi alkolde bırakın ve kullanmadan önce kurulayın.
- Juguler ven izolasyonu
NOT: Bu parça için tahmini çalışma süresi 10 dakikadır.- Ameliyata hazır ve tıraş edilmiş sıçanı, bir indüksiyon odasında oksijenle karıştırılmış %3-%3,5 izofluran ile uyuşturun ve ayak sıkışmasına yanıt verilmemesi nedeniyle sıçanın bilinçsiz hale gelip gelmediğini belirleyin.
- Anesteziyi sürdürmek için sıçanın burnunu% 2 -% 2.5 izofluran ile beslenen burun parçasına yerleştirin.
- Subkutan olarak (s.q.) meloksikam çözeltisini 2 mg / kg'lık bir dozda enjekte edin.
NOT: Farmakokinetik çalışmasında ilgilenilen ilaç bileşiği ile etkileşime girmeyen analjezikleri seçtiğinizden emin olun. - Yapışkan bant kullanarak, sıçanın önkollarını ventral pozisyonlarında cerrahi platformun her iki tarafına da kısıtlayın.
- % 75 tıbbi alkol ve iyot bazlı ovma işlemine batırılmış pamuk topları arasında toplam üç kez geçiş yaparak cerrahi bölgeyi nazikçe fırçalayın.
- Boynun orta çizgisinin sağ tarafındaki klavikulanın yakınındaki cildi forseps ile dikkatlice kaldırın ve bir çift cerrahi makasla göğse doğru yaklaşık 1.5-2.0 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
- Künt, alt juguler veni açığa çıkarmak için ince doku kapağını iris makası ile diseke eder. Dış juguler venin proksimal sefalik ucu, görsel olarak tanımlanabilen iki daldan oluşur.
NOT: Sıçanın yaşına ve cinsiyetine bağlı olarak, juguler veni kaplayan yumuşak doku (örneğin, tükürük bezleri, lenfatik düğümler ve yağ dokuları) değişir. Genç sıçanlarla karşılaştırıldığında, yaşlı sıçanlar daha şişmandır (örneğin, BW > 300 g) ve bu nedenle juguler ven görünmeden önce daha fazla doku ayrımına ihtiyaç duyarlar. - Juguler vene, juguler vene bağlı lenf bezini görselleştirmek için bağ membranöz dokularıyla birlikte juguler veni kaldırın. Damar yönü boyunca damarı çevreleyen kas, yağ ve diğer dokulardan dikkatlice ayırın.
- Forsepsleri kollateral kan damarlarına zarar vermeden juguler venin altına dürtün ve kan damarının iki ucunu ayrı ayrı işaretlemek için damarın altına iki parça 6-0 dikiş geçirin.
- Dikişin bir parçasını sıçan kafasına doğru mümkün olduğunca çekin ve forseps kullanarak damarı kraniyal olarak 2-3 knot ile yağlayabilirsiniz.
- İkinci ligattürü damarın kaudal ucuna 1 gevşek düğümle yerleştirin.
- Juguler ven kanülasyonu
NOT: Bu bölüm için tahmini çalışma süresi 15 dakikadır.- 11 cm poliüretan (PU) kateter içeren paketi açın (I.D. 0.6 mm x O.D. 0.9 mm, Şekil 1B) ve kateteri heparinize salin ile doldurulmuş hazırlanmış künt uçlu şırıngaya takın.
- Hava kabarcıklarını önlemek için heparinize salini yavaşça kateterin içine itin.
- Forsepslerin uçsuz bucaksız düz tarafını juguler venin altından diğer taraftan çıkmak için dürtün. Bir çift castroviejo mikro makas ile kraniyal bağın yakınındaki damarda küçük bir v şeklinde kesik yapın ve dirsek damarı dilatatör forsepslerinin ucuyla insizyonu yavaşça açın.
NOT: Az miktarda kan fışkırırsa, insizyonu önceden ısıtılmış normal salin (37 ° C) ile durulayın. - Juguler ven kateterinin ön ucunun eğik açıklığını kesin. Tüpün eğik ucunu forseps ile kelepçeleyin ve juguler damara kaydırın.
NOT: Bu adım, kateter kaymasını kolaylaştırmak için başka bir kişiye ihtiyaç duyabilir. - Kateteri ilerletirken, dirsek mikrocerrahi forsepslerini yavaşça geri çekin ve damarın dış yüzeyini forseps ile sıkıştırın.
NOT: Doğru kan damarı seçilirse ve kateterin ucu başarılı bir şekilde kan damarına kaydırılırsa, tüm kateter yerleştirme işlemi herhangi bir akış direnci hissetmemelidir. - Yaklaşık 3.0 cm uzunluğundaki PU tüpünün ilk mavi işaretine (Şekil 1B) çarptıktan sonra kateteri yerleştirmeyi bırakın.
- Yerleştirilen kateteri forseps kullanarak hem kaudal hem de rostral ligatürlerle damara sabitleyin.
- Bir dikiş iğnesi (1/2 kavisli kesim, 12 mm) kullanarak insizyonun sağ tarafındaki açıkta kalan dokudan 6-0'lık bir dikiş geçirin ve ligattürü bir hemostat ile bağlayın.
- Aynı ligatürle (adım 3.3.8'de) bağlanmak ve PU borusunun tıkanmasını önlemek için kateteri ikinci mavi işarette (Şekil 1B) bükün.
- Tüm ekstra dikiş ipliğini kesin ve künt uçlu şırıngayı 22 G paslanmaz çelik bir tıkaç ile değiştirerek kateteri kapatın.
- Kateter dış cephe izasyonu
NOT: Bu parça için tahmini çalışma süresi 10 dakikadır.- Sıçanı sırt pozisyonuna yerleştirin ve% 75 tıbbi alkole batırılmış pamuk topu ile kürek kemiği arasındaki alanı nazikçe temizleyin.
- Cerrahi makasla dorsal boynun merkezinde çok küçük bir kesi yapın. Dorsal insizyondan, cildin altındaki trokarı boynun sağ tarafındaki ventral insizyona doğru yönlendirin ve yavaşça itin.
- Venöz kateteri trokar içine koyun ve ardından dışarı çekin ve venöz kateteri dorsal insizyona doğru yönlendirin.
- Dışsal kateteri kas tabakasına dikişle aynı şekilde sabitleyin (adım 3.3.8 ve 3.3.9'daki prosedüre bakınız).
- Ventral ve dorsal insizyonların deri tabakasını 6-0 naylon sütür ve dikiş iğnesi (3/8 kavisli kesim, 17 mm) ile kapatın. Tüm cerrahi insizyonları iyodofor ile sürün.
NOT: Yara klipsleri cilt insizyonunu kapatmak için alternatif bir yöntemdir. - Kateteri parmak uçlarıyla sıkıştırarak kateter tıkacını çıkarın. Yeni bir künt uçlu şırınga yerleştirin ve kan akışını test etmek için şırıngayı yavaşça geri çekin.
NOT: Sıçan sırtüstü pozisyonda olduğundan, kan örnekleri alınamayabilir. Kan örnekleri, yan vücut pozisyonuna geçerek elde edilebilir. - Kateteri parmak uçlarıyla tekrar tutun ve künt uçlu şırıngayı kullanarak kateterin içine 0.2 mL heparinize salin ve 0.1 mL kilit çözeltisi enjekte edin.
- Kateteri parmak uçlarıyla tutun ve şırıngayı paslanmaz çelik bir tıkaç ile değiştirin. Kateteri açın ve kateterin sıkılığını sağlamak için fişi hafifçe itin.
4. Ameliyat sonrası acil bakım
- Sıçanı dorsal decubitus pozisyonunda, taze mısır koçanı yataklarıyla ayrı ayrı kafesleyerek kurtarın. Genellikle, çekirdek vücut sıcaklığını korumak için sıcaklık ayarlı bir ısıtma yastığı sağlayın.
NOT: Hayvan refahı için, yataklarda yiyecek ve su bırakmak, yemek yerken ve içerken boyun hareketlerinin neden olduğu ağrıyı hafifletmenin etkili bir yoludur. - Ameliyatın bitiş zamanını kaydedin ve sıçanı en az 4 saat boyunca 2 saat aralıklarla izleyin. Sıçan ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteriyorsa iyileşme için ek analjezi sağlayın.
5. İyileşme aşamasında fizyolojik ve hematolojik izleme
- Vücut ağırlığını ve günlük yiyecek ve su alımını izleyin ve verileri kaydedin.
- Hematolojik test için az miktarda taze kan toplamak için, sıçanı bir tutucuya yerleştirin. Fişi açın ve kateterin tıkanmadığından emin olmak için şırıngayı venöz PU kateterine yerleştirin.
NOT: Kan alımı art arda 6 gün boyunca her gün aynı anda yapıldı. - Kan, heparinize salin ve kateter kilit çözeltisi karışımı içeren ilk çekilen kanı atın.
- 150 μL taze kan örneği toplamak için yeni bir şırınga kullanın ve kan örneğini tüp duvarında kurutulmuş K2EDTA (1.8 mg / mL kan) spreyi içeren 0.5 mL tüpe aktarın.
NOT: Kateter bloke edilirse, bir sonraki kan toplama zamanından birkaç dakika önce kateteri yıkamak için kateterin içine 0.2 mL heparinize salin enjekte edilebilir. - Geri çekilen kanı telafi etmek için aynı hacimde steril salin enjekte edin. 150 μL önceden ısıtılmış normal salin (37 ° C) enjekte edin ve kateterden 0.2 mL steril heparinize normal salin enjekte edin.
- Bir sonraki numune toplamadan önce kateterin sızdırmazlığını ve sterilitesini sağlamak için kilit çözeltisinin 100 μL'sini kateterin içine enjekte edin.
- Otomatik bir kan hücresi sayacı kullanarak kan örneklerini toplandıktan sonraki 2 saat içinde analiz edin.
6. Oral yoldan verilen ilacın farmakokinetik çalışmaları için tekrarlanan kan örneklemesi
NOT: Kilo alımı >10 g ve stabil hematolojik düzeyi olan sıçanların gelecekteki çalışmalara kaydedilmesi önerilmektedir. Mevcut protokolü takiben, JVC sıçanlarının iyileşmesi için 4 ila 6 gün gerekiyordu.
- 4-6 günlük ameliyattan sonra, sıçanı suya serbest erişim ile 12 saat boyunca oruç tutun.
NOT: Deney amacına bağlı olarak, hayvanın oruç tutulması isteğe bağlıdır. - Oruç tutan sıçanı doğal fenol biyoaktif ellajik asit ile düz bir gavage iğnesi16 ile 6 mg / kg'lık bir dozda oral olarak gavage edin.
- Heparinize tüplerde juguler ven kanülü yoluyla 200 μL kan örneğini, oral uygulama sonrası 24 saat boyunca önceden belirlenmiş zaman noktalarında toplayın. Kan toplama işlemi, adım 5.5'teki prosedürü izler.
NOT: Kan alımı tamamlanana kadar kateterin kilit solüsyonu ile kapatılmasına gerek yoktur. - Kan örneğini derhal 10 dakika boyunca 4 ° C'de 3000 x g'de santrifüj edin.
- Ekstrakte edilen plazma örneğini sıvı kromatografisi-kütle spektroskopisi17,18 ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, seri kan alımı için mikrocerrahi becerileri kullanarak uzun vadeli bir JVC modelinin nasıl oluşturulacağını kapsamlı bir şekilde göstermiştir. Şekil 1A , ameliyatı yürütmek için kullanılan temel cerrahi aletleri ve malzemeleri göstermektedir. Üç mavi işaretli PU kateterinin spesifikasyonu da gösterilmiştir, bu da araştırmacıya damar kanülünü adım 3.3'e yerleştirmesi için rehberlik etmek için yararlıdır., kanülasyonu yönlendirmek için PU kateteri üzerindeki işaretlerin nasıl kullanılacağı (Şekil 1B). JVC sıçan modelini oluşturmak için gereken zaman çizelgesinin farkında olmak da önemlidir (Şekil 1C). JVC için çalışma süresi yaklaşık 35 dakika olmasına rağmen, araştırmacı becerikliyse, JVC sıçan modelinin kullanıma hazır hale gelmesi, uygun eğitimle hemen kullanılabilecek kuyruk kesme veya orbital sinüs delinmesi gibi cerrahi olmayan yaklaşıma kıyasla, 10-14 gün (adaptasyon ve iyileşme aşaması) alır.
Postoperatif 6 gün içindeki fizyolojik ve hematolojik durumlar da araştırıldı (Şekil 2). Sıçanın vücut ağırlığı artışı, yiyecek ve su alımı ve tam kan hücresi sayısı iyileşme aşamasında değişkendi (Şekil 2A, B). Mevcut çalışma koşulu altındaki sıçanların çoğunluğunun, vücut ağırlığı artışı >10 g, düzenli diyet alımı ve beyaz kan hücresi sayımı, kırmızı kan hücresi sayısı da dahil olmak üzere enfeksiyon, dehidrasyon ve inflamasyonla ilgili seçilmiş kan bileşenleri gibi bazı temel özelliklerin restore edilmiş seviyeleri ile kanıtlandığı gibi, ameliyattan sonraki 4-6 gün içinde iyileştiği bulunmuştur. hemoglobin ve trombosit sayısı (Şekil 2C-F). Sıçanlarda su alımı miktarının, operasyon sonrası ilk günde nispeten büyük olduğunu ve dehidrasyona işaret ettiğini belirtmek gerekir.
Doğal polifenol, ellajik asidin farmakokinetiği, kurulan JVC sıçan modelinde incelenmiştir (Şekil 3). Ellagik asit, zayıf ilaç biyoyararlanımı ile karakterizedir. Düşük dozda (örneğin, 6 mg / kg) uygulandığında, plazmadaki konsantrasyonunu tespit etmek için büyük miktarda kan örneği gerekir. Şekil 3, 24 saat boyunca ng / mL'de düşük plazma konsantrasyonlu ellajik asit konsantrasyonunu ve zayıf çözünürlüğü ve geçirgenliği nedeniyle çeşitli gastro-intestinal sistem (GIT) emilimini göstermektedir.
Şekil 1: JVC sıçan modelinin kurulması için kullanılan ana cerrahi aletlere ve malzemelere genel bakış. (A) Üst: a-d, sırasıyla% 75 tıbbi alkol içeren normal salin, iyodofor, plastik eşya, sprey şişesidir; Orta: e-o sırasıyla 5.0 mL şırınga, 1.0 mL şırınga, künt uçlu şırınga, steril kanül, cerrahi makas, iris makas, yarı kavisli forseps, damar dilatörü dengeli forseps, castroviejo mikro makas, paslanmaz çelik trokar, evcil hayvan tıraş bıçağı; alt: p-w pamuklu çubuklar, 6-0 steril emilemeyen naylon sütür ipliği, pamuk topları, iki tip sütür iğnesi, paslanmaz çelik tapa, kavisli hemostat, yapışkan bant, anestezik burun parçası, sırasıyla. (B) Sıçanlarda juguler venin kanülasyonu için kullanılan PU kateterinin spesifikasyonu. Kateter toplam uzunluğu 11 mm'dir ve O.D 0.6 mm x I.D 0.9 mm'dir. Kateter, kanülasyon sırasında bir bağlantı noktası olarak hizmet etmek için üç mavi işarete sahiptir; (C) JVC sıçan modelinin oluşturulması için önerilen zaman çizelgesi. Bu çalışmada, sıçanın vücut ağırlığının yanı sıra yiyecek ve su alımı, iyileşme aşamasında günlük olarak kaydedildi ve rutin hematolojik izleme için günde bir kez kan örnekleri toplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıçanların ameliyat sonrası 6 gün boyunca fizyolojik ve hematolojik olarak izlenmesi. (A) Vücut ağırlığı değişimi; (B) Su ve gıda alımındaki değişim; (C-F) Beyaz kan hücresi sayımı, kırmızı kan hücresi sayımı, hemoglobin ve trombosit sayısı, sırasıyla. Veriler, n = 6 ile SEM'± ortalamasını temsil eder. Mavi renkteki sayısal değerler ortalama değeri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıçanların oral gavajdan sonra 24 saat boyunca plazma ellagik asit konsantrasyon-zaman profilleri. Veriler, n = 3 ile SEM'± ortalamasını temsil eder. PK parametrelerinin değerleri, bir elektronik tablo yazılımında PKSolver eklenti programı kullanılarak elde edilir (örneğin, Microsoft Excel)19. C max: tepe konsantrasyonu, T max: C max'a ulaşma süresi; AUCinf: sıfırdan sonsuzluğa kadar plazma konsantrasyon-zaman eğrisinin altındaki alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Damar kanülasyonu tekniğinde ustalaşmak, önemli bir uygulama ve her işlemden ders çıkarmayı gerektirir. Christakis ve ark. kümülatif toplam (CUSUM) analizini kullanarak, bir araştırmacının ilaç adaylarının PK değerlendirmesine hazır olmadan önce bir yıllık bir süre boyunca200 sıçan uygulaması gerektiğini bulmuşlardır 20. Bununla birlikte, damar kanülasyonu için gereken çalışma süresi,13,20 yapılan sıçan sayısı ile önemli ölçüde azaltılabilir. Protokolümüzü kullanarak, juguler veni etkili bir şekilde kanüle etme ve kan örneğini toplama başarı oranı yaklaşık% 50'den% 80'in üzerine çıkmıştır (gerçekleştirilen toplam sıçanlar 15 idi) ve ilk ameliyat süresi 2 saatten 35 dakikaya düşürülmüştür.
Bir JVC sıçan modeli oluşturmanın gösterilmesi birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, boynun etrafındaki kesi alanı, juguler venin başlangıçta yerini belirlemek için önemlidir. Sağ JVC yapılırsa, insizyon alanı genellikle klavikulanın üst tarafında, boyun orta hattının sağ tarafı boyunca seçilir (bkz. bölüm 3.2 juguler ven izolasyonu). İkincisi, JVC damarın temiz bir bölümünün hazırlanmasına bağlıdır. Yumuşak dokunun künt diseksiyonu üzerine, juguler ven görülebilir ve bu iki özellik ile tanımlanır: 1) proksimal uçta iki dal ve 2) ona bağlı bir lenf nodu. Üçüncüsü, kateteri juguler venin içine kaydırırken (bakınız bölüm 3.3 juguler ven kanülasyonu), kateterin ön ucunu kesmek ve kan damarını sabit dış kuvvetle desteklemek, kanülasyonun başarı oranını büyük ölçüde artırabilir. Ayrıca, sıçanı rahatlatmak için uygun analjezi ve ısı sağlanmalıdır, çünkü stres ve ağrı, hayvanın davranışlarında ameliyat sonrası iyileşmelerini etkileyebilecek değişikliklere neden olabilir. Son olarak, anestezi süresi, ısı kaybı ve komplikasyon beklenmedik sıçan ölümüne neden olabilir; Bu nedenle, ameliyat sırasında ve sonrasında sıçanları en az 3 gün boyunca yakından izlemek önemlidir. İyileşme döneminde sıçanların vücut ağırlığı artışı, diyet ve içme durumu ve hematolojik bileşenleri gibi çoklu sağlık göstergelerinin değerlendirilmesi, veritabanındaki sağlıklı SD sıçanların ilgi duyduğu referans değerlerle karşılaştırılabilecek bilgiler sağlayabilir21,22,23,24 . Sıçanlar dehidrasyon yaşarsa, vücut ağırlığının% 3 -% 5'indeki steril izotonik sıvılar, sıvı kaybını telafi etmek için ameliyatın sonunda deri altından enjekte edilebilir. Çoğu sıçan vücut ağırlığını (örneğin, >10 g) ameliyat sonrası 3. güne kadar kazanır ve bu nedenle kullanıma hazır olmalıdır. Bununla birlikte, kan biyobelirteçlerinin değerlendirilmesini içeren çalışmalar için (örneğin, lökosit, sitokinler), sıçanlar için normal hematolojik indeksleri sağlamak için sıçanların ameliyat sonrası 4-6. güne kadar kaydedilmesi önerilir.
PK çalışmasındaki yararlılığına rağmen, kateter materyallerine bağlı olarak, tüm ilaç adayları tek kanülasyon için uygun değildir. Gaud ve ark., yüksek log P bileşiklerinin PE kateter materyaline bağlandığını ve PK25'in değişmesine neden olduğunu bulmuşlardır. Ek olarak, analjezikler (örneğin, meloksikam) genellikle ameliyat sonrası sıçanlarda ağrıyı azaltmak için uygulanır. Meloksikamın eliminasyon yarı ömrünün 19-23 saat26,27 civarında olduğu göz önüne alındığında, enjekte edilen tek doz meloksikam (2 mg / kg) sq. 24 saat sonra vücuttan neredeyse temizlenir. Bununla birlikte, potansiyel ilaç-ilaç etkileşimleri meloksikam kullanımında ortaya çıkabilir. Örneğin, meloksikam Sitokrom P450 metabolizması28,29 için diğer ilaçlarla rekabet edebilir. Bu nedenle, seçilen analjeziklerin dozu ve tipi, farmakokinetik çalışma için seçilen ilaca bağlı olarak taranmalıdır. İlgilenilen ilaç meloksikam ile etkileşime girerse, diğer ağrı kesiciler (örneğin, buprenorfin) kullanılabilir.
Sonuç olarak, bu protokol laboratuvar ortamında kan alımı için uzun vadeli bir JVC sıçan modelinin nasıl oluşturulacağını ve cerrahi sonrası iyileşme aşamasında sıçanların fizyolojik durumunun nasıl araştırılacağını kapsamlı bir şekilde göstermiştir. Vurgulanan hayati cerrahi adımlar ve deneyimler, araştırmacının kanülasyon modelinin uygulanmasını verimli bir şekilde başarması için yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82003692) tarafından R.X. Zhang'a desteklenmektedir; Northwestern Politeknik Üniversitesi'nde R. Miao'ya En İyi Akademik Bursu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
