基于Hoffmann反射（H反射）并利用外周神经电刺激对痉挛状态进行临床评估是一种成熟的方法。本文提供了一种在小鼠前爪中用于定量H反射的终末直接神经刺激方案。
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摘要
摘要
作为牵张反射的电生理类似物，Hoffmann反射（H反射）可用于在脊髓损伤或中风等损伤后，对神经回路完整性的电生理评估。H反射反应增强，伴随相应肌肉出现非自主性肌肉收缩、病理性增强的牵张反射和肌张力增高等症状，是中风后痉挛状态（PSS）的指征。
与相对缺乏神经特异性的经皮测量方法相比，本文介绍了一种直接在前肢的尺神经和正中神经上定量测定H反射的实验方案，该方法经少量修改后也可适用于后肢的胫神经和坐骨神经。基于直接刺激并针对不同神经进行的优化，该方法是一种可靠且多功能的工具，可用于验证与痉挛相关疾病模型中的电生理变化。
引言
Hoffmann反射（H反射）以生理学家Paul Hoffmann的名字命名，可通过电刺激外周神经诱发，这些外周神经包含起自并支配 同一肌肉的感觉神经元和运动神经元的轴突。H反射是单突触牵张反射的电诱发类似现象，二者具有相同的传导通路1。与肌肉牵拉不同，H反射由电刺激引发。当以外周神经施加低强度电流刺激时，由于Ia传入纤维的轴突直径较大，通常会首先发生去极化2。其动作电位激活脊髓中的α运动神经元（αMNs），继而引发动作电位沿αMN轴突向肌肉传导（图1）。这一级联反应产生幅度较小的肌肉反应，表现为所谓的H波。通过逐步增加刺激强度，由于更多运动单位被募集，H波的幅度随之增大。当刺激强度达到某一阈值时，αMN较细的轴突可被直接激发产生动作电位，此反应记录为M波。M波的潜伏期短于H波（图2）。若进一步提高刺激强度，由于更多αMN轴突被募集，M波幅度进一步增大，而H波则逐渐减小。在高强度刺激下，H波可被抑制，原因是αMN轴突中动作电位发生逆向传导，这些被触发的动作电位与来自Ia纤维刺激的动作电位相碰撞，从而相互抵消。在超强刺激强度下，所有运动神经元轴突中均同时发生顺向（朝向肌肉）和逆向（朝向脊髓）的动作电位；前者产生最大M波幅度（Mmax），后者则导致H反射完全消失3。
为了评估卒中后肌张力障碍（PSS）或脊髓损伤（SCI），H反射已被用于研究人类运动和肌张力障碍的神经基础1。通过使用H波与M波的比值（H/M比值），可以更准确地量化不同测量之间以及不同受试者之间的H反射变化。另一种方法是测量频率依赖性抑制（RDD），即采用一组递增频率（例如0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 Hz）进行刺激。RDD反映了可能因卒中或SCI而受损的抑制性神经回路的完整性。当所有神经回路均完整时，H反射会表现出一致且不依赖频率的抑制效应。然而，若由于卒中或SCI导致神经抑制功能减弱，则随着刺激频率的增加，H反射的抑制作用会逐渐减弱4。
使用表面电极进行正确的电生理记录可能具有挑战性，并可能受到运动任务、抑制性机制以及α运动神经元兴奋性的影响5在啮齿类动物的经皮记录中，刺激电极置于胫神经附近，记录电极置于前爪相关肌肉附近。然而，根据我们的经验，经皮电极的正确放置（图1A在啮齿类动物中，该技术比在人类中使用表面电极更为复杂且变异性更大。这可能导致引发H反射所需的刺激时长、频率和强度存在差异。这些方法学上的挑战或许可以解释为何目前仅有极少数关于H反射测量的研究（例如，在实验性脑卒中模型中）。3,4以及其他痉挛性模型6原则上，可通过在目标神经周围植入电极，实现对单个神经H反射的精确（长期）刺激与记录7,8由于该手术对动物具有挑战性，可能带来副作用，且探针可能存在不稳定性，因此该方法尚未成为本领域的标准技术。本文介绍的方法同样需要一定的手术操作经验，但能够实现对孤立神经进行新颖、精确的刺激与记录。 体内 使用低强度刺激，以避免同时刺激邻近神经。
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方案
所有实验均遵循欧洲和国家动物护理法律法规以及机构指南， 并经北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局批准（编号：81-02.04.2019.A309）。本方案优化用于成年小鼠（约8–16周龄的C57Bl/6J小鼠）的前肢记录。通过刺激后肢相应神经并记录后爪肌肉，可轻松适配用于后肢实验（图1B）。记录电极和刺激电极的详细说明见于材料表。请注意，本方案仅用于终末性测量。
1. 准备
- 称重动物，并通过注射开始麻醉 通过 腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的混合物。
- 将小鼠置于保温箱中直至达到手术耐受状态。等待数分钟，直至小鼠状态平静、呼吸稳定且反射消失。通过检测脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
- 将小鼠仰卧置于加热垫上（最佳方式是使用直肠温度探针进行反馈控制的加热）。用胶带固定前肢，注意胶带的放置位置应便于将测量电极插入前肢。
- 插入直肠探针以测量动物体温，并用胶带固定。涂抹眼药膏以防止眼睛干涩。
2. 手术
注意：在整个操作过程中，应定期监测麻醉动物的稳定状态，即呼吸、体温和反射消失情况。前肢掌部的桡神经/尺神经/正中神经的直接神经H波测量步骤如（图3A）所示。该测量方法也可经适当调整后应用于后肢掌部（坐骨神经/胫神经）。
- 为了更清楚地观察手术区域，可事先在另一处使用电动剃刀或剪刀去除毛发。对于经验丰富的手术操作者，此步骤为可选。
注意：此处无需消毒，因为本实验为终点实验，动物后续将被实施安乐死。 - 用镊子提起皮肤，使用精细圆头剪刀沿前肢掌侧后轴方向（腋窝及胸壁上方区域）在皮肤上做约1 cm的切口。
- 小心去除结缔组织，暴露其下方的肌肉和神经。用镊子移除暴露的胸小肌，以显露正中 神经（图3E,F）。使用柔软组织清除暴露的血液和组织液。
- 下一步，从上至下小心剪开乳腺或腋部肌肉，以暴露其下方的神经束。将神经束从结缔组织和肌肉组织中游离约1.5 cm的长度。
注意：此步骤需特别注意避免损伤与正中神经平行走行的血管。切割组织时，应始终沿神经方向进行，以防损伤神经。若发生损伤，需用棉签清除渗出的液体和血液。整个实验过程中无需使用体视显微镜，但在神经解剖阶段可酌情使用以辅助操作。 - 使用弯头玻璃移液管小心分离前肢的尺神经和正中神经（图3E）。两条神经中位置较上方的为尺神经，较下方的为正中神经。
注意：分离两条神经时，应注意避免损伤其下方的血管。
3. 电极放置
- 将刺激钩状电极平行放置，间距为 0.5–1.0 mm，并使用显微操作器将双钩电极移至靠近神经的位置。
- 使用玻璃钩作为工具，将尺神经轻轻提起并置于刺激钩状电极上。利用显微操作器将带有神经的电极向后拉，并将其与其他神经分离约 1–2 mm（图 3D、F）。
- 将电极沿足掌的长轴方向放置，以减少肌肉间的串扰。
注意：由于个体解剖结构的差异，电极的放置至关重要但难以标准化，需要经验丰富的外科医生准确操作。若信号幅度不理想，也可重新调整电极位置。 - 将附着在神经上的电极钩表面轻轻擦干，并用注射器涂抹凡士林，以实现与周围组织的电绝缘。
注意：应小心操作，确保在电极表面以及两个钩之间充分涂抹凡士林，以保证电绝缘效果，并防止神经干燥。
4. 记录电极和参考电极的放置
- 为测量H反射，将肌电图（EMG）电极插入前肢肌肉内，同时将参考电极皮下置于后肢（例如使用微小针头），并用微型鳄鱼夹固定（图3B）。
- 开启刺激器后，可通过前肢轻微抽动观察刺激是否成功。引发M波及前肢轻微可见抽动的最小刺激电流应在10–50 µA范围内。
注意：若在50 µA时仍无可见抽动，应调整刺激电极并重新涂抹凡士林。此外，在小鼠中，M波常在较H波更低的刺激强度下出现5。
5. 测量
- 使用持续时间为 0.2 ms 的脉冲重复刺激神经 15 次。每组刺激之间间隔 2 分钟，刺激频率依次从 0.1、0.5、1.0、2.0 增加至 5 Hz。
注意：若需后续计算反射衰减（RDD），则必须采用上述频率。所有肌电图（EMG）数据均通过软件（例如 Spike2 软件，CED，版本 7.19）进行记录、数字化和分析。H 波振幅在 0.1 Hz 时最大；随着频率升高，由于反射衰减（RDD）效应，H 波振幅逐渐减小。 - 实验结束后，根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规程处死动物。本实验中，在深度麻醉下对小鼠进行经心脏灌注，依次使用 PBS 和 4% 多聚甲醛（PFA）。
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结果
针对每个刺激频率和每只足垫的 n = 15 次刺激试验，应至少选取 n = 10 次成功记录用于分析。存在测量误差（例如缺失M波）的试验将被排除在分析之外。需对每次试验单独进行分析，后续再生成平均值以进行组间或时间点间的比较。每次试验中均需记录刺激与M波和H波出现之间的时间潜伏期。根据我们的经验，由于信号通过脊髓的传导时间较长，M波通常在刺激后约 2 ms 出现，而H波则在 6–8 ms 后出现（图 1A 和 图 2B）。M波和H波的波幅应以峰-峰幅值进行测量。
为了评估脊髓损伤或脑卒中后发生的生理变化，H波与M波振幅的比值（H/M比值，图2）受实验变异性的干扰较小，而这种变异性可能体现在振幅差异上。因此，该比值能够更可靠地评估与疾病相关的电生理变化。例如，在初级和次级运动皮层发生脑卒中的小鼠中，H波振幅增大，而M波保持不变（图2），提示α运动神...
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讨论
与先前报道的小鼠经皮H反射测量方法6相比，本方法提供了更直接且针对特定神经的测量方式。该新方法可应用于前肢和后肢的神经（例如正中神经、尺神经和桡神经，以及胫神经和坐骨神经），因此可作为多种疾病模型（如脑卒中、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、创伤性脑损伤和脊髓损伤）的诊断工具，具有良好的适应性。根据所选神经的不同，建议对H波振幅随刺激强度变化的关系进行验证。H波振幅可能因神经直径、运动神经元兴奋性以及电接触情况而产生变化。通过测量H/M比值和反射潜伏期差值（RDD），可减少实验因素（如针电极位置）对结果的影响，从而显著提高所获数据的可靠性。
本方案的主要局限性在于其为终末性应用，无法进行纵向测量。此外，还需考虑若干方法学细节。持续的麻醉应保持最小程度的肌肉松弛，这对获得可靠的测量结果至关重要，且需针对每种特定模型或应用进行验证。与异氟烷麻醉不同，后者会引起肌肉反射（如H反射）的强烈抑制9,10,
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者们衷心感谢T. Akay（达尔豪西大学）在MG访问其实验室期间提供的支持。本工作获得了Friebe基金会（T0498/28960/16）以及德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）——项目编号431549029——SFB 1451的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吸水垫 | VWR | 115-0684 | |
| 模数转换器 | Cambridge Electronic Design, 英国 | CED 1401micro | |
| 放大器 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | - | |
| 数字刺激器 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | MS 501 | |
| 肌电图电极 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | 将两根绞合的绝缘铜线（外径 50 µm）焊接到公插头上，并连接至差分放大器。 | |
| 眼药膏 | 拜耳 | Bepanthen | |
| 玻璃移液管 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | - | 在本生灯火焰中将玻璃移液管弯成简单的玻璃钩。 |
| 加热箱 | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| 加热垫 | WPI | 61840 加热垫 | |
| 钩状电极 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | - | 制作电极时，将不锈钢微型针在一端弯成钩状，并插入钝头套管中以形成直接机械接触。将套管末端焊接到铜线上（长度约 50 cm），铜线再连接至刺激或记录设备。 |
| 氯胺酮 | 辉瑞 | Ketavet | |
| 直肠探头 | WPI | RET-3 | |
| 刺激器隔离单元 | 动物学研究所车间，乌得勒支大学 | MI 401 | |
| 灭菌器 | CellPoint Scientific | Germinator 500 | 手术器械的常规术前和术后消毒应通过热灭菌完成。在加热的玻璃珠浴中（260°C）对器械去污 15 秒。 |
| 温度控制器 | WPI | ATC200 | |
| 凡士林 | 拜耳 | - | |
| 赛拉嗪 | 拜耳 | Rompun |
参考文献
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重印与许可
