Summary
Demiyelinasyon çoklu santral sinir sistemi hastalıklarında görülür. Remiyelinizan ilaç testi için güvenilir bir in vivo ilaç dağıtım tekniği gereklidir. Bu protokol, uzun süreli ilacın doğrudan beyin parankimine verilmesine izin veren ve remiyelinasyon araştırmalarında geniş bir uygulama ile ilaç biyoyararlanımını geliştiren ozmotik pompa bazlı bir yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Demiyelinasyon sadece multipl sklerozda (MS) değil, Alzheimer hastalığı ve otizm gibi diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarında da tanımlanmıştır. Kanıtlar, remiyelinasyonun hastalık semptomlarını etkili bir şekilde iyileştirebileceğini gösterdiğinden, miyelin rejenerasyon sürecini teşvik etmek için ilaç geliştirmeye artan bir odaklanma vardır. Bu nedenle, bu ilaçların in vivo etkinliğini ve özgüllüğünü test etmek için bölgesel olarak seçilebilir ve sonuç açısından güvenilir bir ilaç dağıtım tekniği gereklidir. Bu protokol, ozmotik pompa implantını, lizositinle indüklenen demiyelinasyon fare modelinde yeni bir ilaç dağıtım yaklaşımı olarak tanıtmaktadır. Ozmotik pompa, kan-beyin bariyerini (BBB) atlayabilen ve ilaçları fare beyninin belirli bölgelerine istikrarlı ve doğrudan verebilen küçük bir implante edilebilir cihazdır. Ayrıca, kısa bir yarı ömre sahip peptitler ve proteinler gibi ilaçların biyoyararlanımını etkili bir şekilde artırabilir. Bu nedenle, bu yöntem merkezi sinir sistemi miyelin rejenerasyonu araştırması alanında büyük bir değere sahiptir.
Introduction
Ozmotik pompa, implante edilebilir küçük bir çözelti salgılayıcı cihazdır. Deri altından veya karın boşluğuna implante edildiğinde sistemik doğum için kullanılabilir. Ozmotik pompanın yüzeyi yarı geçirgen bir membrandır ve iç tarafı geçirgen bir tabakadır. Ozmotik pompa, ozmotik tabaka ile pompanın implante edildiği doku ortamı arasındaki ozmotik basınç farkını kullanarak çalışır. Ozmotik tabakanın yüksek ozmolalitesi, dokudaki suyun pompa yüzeyindeki yarı geçirgen membrandan ozmotik tabakaya akmasını sağlar. Ozmotik tabaka, pompanın içindeki esnek rezervuarı genişletir ve sıkıştırır, böylece çözeltiyi esnek rezervuardan uzun süre belirli bir oranda yer değiştirir1. Pompa, 100 μL, 200 μL ve 2 mL olmak üzere üç farklı rezervuar hacmine sahiptir ve teslimat oranları 0,11 μL/h ile 10 μL/h arasında değişmektedir. Seçilen pompa tipine bağlı olarak, cihaz 1 günden 6 haftaya kadar çalışabilir2. Bu protokolde, 14 gün boyunca çalışabilen 0,25 μL/h transfer hızına sahip 100 μL ozmotik pompa kullanılmıştır.
1970'lerde, ozmotik pompa nörobilimaraştırmalarında 3,4 olarak kullanılmıştır. Örneğin, Wei ve ark. uyuşturucu bağımlılığı3 çalışmasında opioid peptitleri ventriküle enjekte etmek için ozmotik pompa yaklaşımını benimsemişlerdir. Sürekli iyileştirmeden sonra, ozmotik pompa şimdi peptitler, büyüme faktörleri, bağımlılık yapan ilaçlar, hormonlar, steroidler, antikorlar vb. dahil olmak üzere binlerce ilacın kontrollü olarak verilmesinin incelenmesinde kullanılmıştır. Ek olarak, özel kateterler (Beyin İnfüzyon Kitleri) takılıyken, omurilik, beyin, dalak ve karaciğerdahil olmak üzere belirli doku veya organlara hedefli infüzyon için kullanılabilir 5,6,7.
Remiyelinasyon çalışmasında, birçok ilacın in vitro miyelin rejenerasyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir, ancak bunların çoğu, muhtemelen uygun bir uygulama yönteminin bulunmaması nedeniyle, in vivo olarak önemli etkiler elde etmemiştir. İntraperitoneal enjeksiyon, subkutan enjeksiyon ve intragastrik uygulama gibi geleneksel uygulama yöntemlerinin ilaçların biyoyararlanımında sınırlamaları vardır. Ek olarak, bazı ilaçlar zayıf kan-beyin bariyeri geçirgenliğine sahiptir ve bu da beyin parankimine erişimlerini zayıflatır. Birlikte, bu sınırlamalar yeni ve verimli bir teslimat yöntemi gerektirir. Beyin infüzyon kitleri ile kombinasyon halinde, ozmotik pompalar kan-beyin bariyerini atlayabilir ve ilaçları doğrudan korpus kallozuma iletebilir, bu da özellikle kısa bir yarı ömre sahip bazı polipeptit ve protein ilaçları için ilaçların biyoyararlanımını etkili bir şekilde geliştirir. Bu nedenle, yeni bir ilaç dağıtım tekniği olarak ozmotik pompa, merkezi sinir sistemi miyelin rejenerasyonu araştırması alanında büyük değer taşımaktadır. Bu tekniğin uygulanması aşağıda ayrıntılı olarak tanıtılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi'nin hayvan refahı ve etik komitesi tarafından onaylanan kurumsal kılavuzlar ve protokoller altında yürütülmüştür.
1. Lizositin-indüklenen demiyelinasyon fare modelinin kurulması
- Steril PBS ile% 1 lizosetin (L-α-Lizofosfatidilkolin olarak da adlandırılır) çözeltisi hazırlayın.
- Makas, forseps, kavisli hemostat ve diğer cerrahi aletleri otoklav sterilizasyonu ile sterilize edin. Cerrahi bölgeyi sterilize edin ve steril tabakaları yerleştirin. Ameliyat için kullanılan tüm materyaller ve reaktifler aseptik olarak hazırlanmalıdır. İşlem boyunca cerrahi bölgenin steril tutulması önemlidir.
- Doğum sonrası gün 56 (P56) C57BL6 fareyi aşağıdaki gibi anestezi altına alın.
- Fareyi küçük hayvan anestezi makinesinin izofluran odasına yerleştirin. O2 akışını 300-500 mL/dak'ya ve izofluranı %3-%4'e ayarlayın. Yeterli anesteziden sonra, fare yavaş ve sabit bir nefesle hareketsiz hale geldiğinde, fareyi bir ısıtma yastığı ile stereotaksik aparata aktarın.
- Gaz çıkışını odadan anestezi maskesine geçirin ve fareyi anestezi durumunda tutmak için izofluranı% 1 -% 1.5'e ayarlayın. Fare tamamen anestezi altına alınana kadar bekleyin, ağrıyı hafifletmek için ketoprofen (3 – 5 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edin. Ameliyattan önce, farenin ayak parmaklarını sıkıştırın ve başarılı anestezi8'i onaylamak için reaksiyonunu kontrol edin.
- Fare uyuşturulduğunda, vücut ısısını düzenleyemez. Bu nedenle, ameliyat sırasında farenin vücut ısısını izleyin ve düzenleyin. Anestezi altındayken farenin gözbebeklerini nemli tutmak için, göz kürelerinin yüzeyini eritromisin göz merhemi ile örtün.
- Fare kafasını stereotaksik aparattaki diş çubuğu ve kulak çubuklarıyla sabitleyin. (Şekil 1A).
- Başın üstünden saçları çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Baş derisini üç döngü betadin ve% 75 etanol ile sterilize edin. Etik kaygılar için, ameliyat bölgesi dışında hayvan vücudunu örtün. Bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için boynun tabanından gözlerin arasına kadar cildin 1 cm uzunluğunda orta sagital bir kesisini yapın (Şekil 1B).
- Kraniyal sütürleri görselleştirmek için kafatasının yüzeyini% 30 hidrojen peroksit içeren steril bir pamuklu çubukla nazikçe silin (Şekil 1C). Lambda noktasını ve bregma noktasını aynı yüksekliğe (yani, iğne ucu noktalara dokunduğunda aynı z ekseni koordinatlarıyla) yerleştirmek için diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın, böylece sagital sütür yatay olur.
- Mikrolitre şırınga iğnesinin ucunu (10 μL, 33 G) yavaşça bregma noktasına yerleştirin ve x, y ve z koordinatlarını 0'a sıfırlayın (Şekil 1D). Şırıngayı enjeksiyon bölgesine (x: 1.04; y: 1.0, yani orta hatta 1.04 mm lateral ve bregma noktasına 1.0 mm posterior) dijital okumanın istemine göre hareket ettirin (Şekil 1E).
- 1 mL'lik bir şırınga iğnesi (26 G, 0,45 mm) ile duraya nüfuz etmeden enjeksiyon bölgesinde kafatasından yavaşça küçük bir çapak deliği açın (Şekil 1F). Mikrolitre şırınga iğnesini, belirli bir derinliğe ulaşılana kadar delikten beyin dokusuna yavaşça yerleştirin (çoğu P56 faresi için z = -1.62 mm) (Şekil 1G).
NOT: Ampirik olarak, -1.62 mm'lik yerleştirme derinliği, iğne ucunun çoğu P56 faresinin korpus kallozumunun ortasına ulaşmasına izin verir, böylece lizositin doğrudan korpus kallozumun içine verilerek demiyelinizasyon indüklenebilir. - 0,3 μL/dak hızında 1,5 μL %1 lizositin enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjeksiyon iğnesi yolu boyunca sıvı sızıntısını önlemek için mikrolitre şırıngayı yavaşça çekmeden önce 5 dakika bekleyin.
- 5-0 cerrahi dikişle cildi dikiş atın (Şekil 1H).
- Vücut ısısında bir düşüşü önlemek için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Ağrıyı hafifletmek için her 24 saatte bir 5 mg / kg karprofen deri altı enjeksiyonu uygulayın. Yaranın düzgün bir şekilde iyileşmesini sağlamak için her gün kesiye eritromisin merhem uygulayın. Ameliyat olan fareyi tek başına bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar nemli yiyeceklerle besleyin. İşlemden sonra fareyi günlük olarak izleyin.
Şekil 1: Lizositinin kaynaklı demiyelinasyon fare modelinin kurulması . (A) Fareyi stereotaksik aparata sabitleyin. (B) Kafatasını ortaya çıkarmak için 1 cm'lik bir orta sagital kesi açın. (C) Kraniyal dikişleri görselleştirin. (D) Bregma noktasında x, y ve z koordinatlarını 0'a sıfırlayın. (E) Şırıngayı enjeksiyon bölgesine taşıyın. (F) Enjeksiyon bölgesinde kafatasında bir delik açın. (G) İğneyi yavaşça beyin dokusuna yerleştirin ve lizosisini enjekte edin. (H) Cildi dikin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Ozmotik pompanın hazırlanması
NOT: Pompanın temel bileşenleri Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Beyin infüzyon kanülünün beyne yerleştirilme derinliğini belirleyin. Kullanılan beyin infüzyon kanülünün iğnesinin 3 mm uzunluğunda olduğundan ve her derinlik ayar aralayıcısının 0,5 mm olduğundan emin olun. 1,5 mm'lik bir enjeksiyon derinliği elde etmek için (kallozuma yakın), doku yapıştırıcısı ile beyin infüzyon kanülünün iğnesine üç derinlik ayar aralayıcısı takın (Şekil 2B, C).
- Ozmotik pompayı doldurmak için, pompa paketiyle birlikte gelen şırınga iğnesini 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve ilacı aspire edin. Pompayı dik tutun, şırıngayı pompanın üstündeki açıklığa yerleştirin ve kabarcıkoluşturmamaya dikkat ederek ilacı yavaşça enjekte edin 9 (bkz. Şekil 2D). Sıvı açıklıktan dışarı aktığında, şırıngayı yavaşça dışarı çekin.
- Akış moderatörünü bükmemeye veya ezmemeye dikkat ederek beyaz flanşı akış regülatöründen makas veya pense ile çıkarın. Ardından, akış moderatörünü pompaya takın (Şekil 2E). Ozmotik pompada kabarcıklar olup olmadığını belirlemek için, ozmotik pompayı doldurmadan önce ve sonra ayrı ayrı tartın.
- Kateteri hayvanın büyüklüğüne göre belirli bir uzunluğa kadar kesin (yaklaşık 25 g ağırlığındaki P56 fareleri için 20-25 mm kateterler). Kateteri beyin infüzyon kanülüne takın.
- Kateteri hava vermeden şırıngayı kullanarak ilaçlarla doldurun (Şekil 2F).
- Kateteri akış moderatörüne bağlayın. Taktıktan sonra, kateterin açıkta kalan akış moderatörünün yaklaşık 4 mm'sini kapladığından emin olun (Şekil 2G).
- Ozmotik pompanın implantasyondan hemen sonra çalışabilmesini sağlamak için, pompa yüzeyindeki yarı geçirgen membranı doku ortamıyla aynı ozmotik basınca sahip çözeltilerle önceden ıslatmak için doldurulmuş pompaları 37 °C'de steril% 0,9 salin veya PBS'ye en az 4 ila 6 saat boyunca batırın (tercihen gece boyunca uzatın) (Şekil 2H).
- Pompalara yüklenen tüm çözeltiler steril olmalıdır. ALZET pompaları, 60Co'luk bir sterilizasyon dozuna maruz bırakılmış steril olarak tedarik edilmektedir. Bununla birlikte, dış kirlenme meydana gelirse, pompanın yüzeyi izopropil alkol (% 70 suda) ile silinerek temizlenebilir.
Resim 2: Ozmotik pompanın hazırlanması. (A) Ozmotik pompanın temel bileşenleri. (B,C) Derinlik ayar aralayıcılarını beyin infüzyon kanülünün iğnesine takın. (D) Ozmotik pompayı 1 mL'lik bir şırınga kullanarak doldurun. (E) Akış moderatörünü pompaya takın. (F) Şırıngayı kullanarak kateteri doldurun. (G) Kateteri akış moderatörüne bağlayın. (H) Doldurulmuş pompaları steril %0,9 salin veya PBS'ye 37 °C'de batırın.
3. Ozmotik pompanın implantasyonu
- Korpus kallozum demiyelinizasyon modelinin kurulmasından sonra 3 gün bekleyin. Küçük hayvan anestezi sistemini açın. Makas, cımbız ve hemostatik penseyi dezenfekte edin ve% 75 alkol çözeltisine batırın. Cerrahi bölgeye steril tabakalar yerleştirin.
- Fareleri stereotaksik aparattaki fareleri tekrar anestezi altına alın ve sabitleyin. Kuruluğu önlemek için göz kürelerinin yüzeyini bir göz merhemi ile örtün.
- Orijinal yarayı% 75 alkol ile dezenfekte edin. Daha önce dikilmiş olan cerrahi insizyonu açın (Şekil 3A) ve insizyonu omuz bıçaklarına kadar genişletin (Şekil 3B).
- Bir boşluk açmak için cildi deri altı bağ dokusundan kürek kemiğinde hemostatik pense veya cımbızla ayırın (Şekil 3C). Ozmotik pompayı boşluğa yerleştirin (Şekil 3D,E).
- Bir pamuklu çubukla, demiyelinizasyon modelini oluştururken oluşturulan kafatasının yüzeyindeki iğne deliğini nazikçe silin ve açığa çıkarın (bkz. adım 1.8). Beyin infüzyon kanülünü bu iğne deliğinden dik olarak yerleştirin ve doku yapıştırıcısı ile kafatasına hızlı bir şekilde sabitleyin (Şekil 3F).
- Beyin infüzyon kanülünün üzerindeki çıkarılabilir tırnağı bir çift makasla çıkarın (Şekil 3G, H). Alternatif olarak, bu işlemde titremeyi önlemek için kanülü takmadan önce sekmeyi çıkarın.
- İnsizyonu dikin veya doku yapıştırıcısı ile takın (Şekil 3I).
- Ameliyattan sonra, vücut ısısının düşmesini önlemek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Ağrıyı hafifletmek için her 24 saatte bir 5 mg / kg karprofen deri altı enjeksiyonu uygulayın. Yaranın düzgün bir şekilde iyileşmesini sağlamak için her gün kesiye eritromisin merhem uygulayın. Hayvanı tek başına bir kafese koyun ve tamamen iyileşene kadar nemli yiyeceklerle besleyin. Fareleri her gün izleyin ve beyin infüzyon kanülünün sıkıca bağlanıp bağlanmadığını kontrol edin.
- Ameliyattan 11 gün sonra intraperitoneal olarak 150-200 mg/kg Pentobarbital sodyum enjekte ederek fareyi ötenazi haline getirin ve ardından %4 formaldehit ile transkardiyal perfüzyon uygulayın.
- Çözeltinin normal şekilde verildiğini doğrulamak için, ozmotik pompayı dikkatlice çıkarın ve beyin diseksiyonundan önce pompa rezervuarındaki kalan hacmi ölçün.
- Artık hacmi ölçmek için, beyin infüzyon kanülünü çıkarın, katetere 1 mL'lik bir şırınga takın ve daha sonra hacmini belirlemek için kalan çözeltiyi aspire edin. Gerçek artık hacmi teorik artık hacimle karşılaştırın (başlangıç hacmi - ortalama pompalama hızı * infüzyon süresi).
NOT: Aşırı kalıntı hacim, kateter tıkanıklığı veya pompa arızasından kaynaklanabilecek başarısız infüzyonu gösterir.
- Artık hacmi ölçmek için, beyin infüzyon kanülünü çıkarın, katetere 1 mL'lik bir şırınga takın ve daha sonra hacmini belirlemek için kalan çözeltiyi aspire edin. Gerçek artık hacmi teorik artık hacimle karşılaştırın (başlangıç hacmi - ortalama pompalama hızı * infüzyon süresi).
Resim 3: Ozmotik pompanın implantasyonu. (A) Cerrahi kesiyi açın. (B) Kesisi omuz bıçaklarına doğru genişletin. (C) Bir boşluk oluşturmak için cildi deri altı bağ dokusundan ayırın. (D,E) Ozmotik pompayı boşluğa yerleştirin. (F) Beyin infüzyon kanülünü kafatasının yüzeyindeki iğne deliğine yerleştirin ve kafatasına sıkıca sabitleyin. (G,H) Çıkarılabilir sekmeyi kanülden çıkarın. (I) Kesisi dikin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ozmotik pompanın miyelin rejenerasyon araştırmasındaki etkisini doğrulamak için, P56 farelerde lizositin kaynaklı bir demiyelinasyon modeli oluşturuldu, ardından UM206 (1.5 mL% 0.9 salinde 1 mg), kısa bir yarı ömre sahip bir peptid ve zayıf BBB geçirgenliğine sahip bir peptid içeren ozmotik pompaların implantasyonu10 . Kontrol olarak %0.9 salin kullanıldı. Modelin kurulmasından on dört gün sonra, fareler kesitleme için beyinleri izole etmek için% 4 formaldehit ile transkardiyal olarak perfüze edildi, ardından remiyelinasyon seviyesini değerlendirmek için in situ hibridizasyon ve iletim elektron mikroskobu yapıldı.
DAPI'nin boyanması, beyaz maddenin hemen üzerindeki beyin dokusundaki iğne deliğini ortaya çıkardı ve ozmotik pompanın beyin infüzyon kanülünün başarılı bir şekilde implantasyonunu gösterdi (Şekil 4A). In-situ hibridizasyon deneyinde, olgun oligodendrosit belirteci MAG probu, önceki çalışmalarda gösterildiği gibi yeni farklılaşmış oligodendrositleri etiketlemek için kullanıldı 10,11,12. Sonuçlar, UM206 tedavisinin demiyelinizli bölgede kontrol grubundan daha fazla MAG-pozitif hücre verdiğini göstermiştir (Şekil 4B). Demiyelinli bölgenin transmisyon elektron mikroskobu ayrıca UM206 tedavi grubunda miyelinli akson sayısının kontrol grubuna kıyasla arttığını göstermiştir (Şekil 4C), bu da UM206'nın daha yüksek bir remiyelinasyon seviyesine neden olduğunu düşündürmektedir. Bu sonuçlar, ozmotik pompanın remiyelinasyon araştırmasında korpus kallozuma etkili bir şekilde ilaç verebileceğini göstermektedir.
Şekil 4: Temsili sonuçlar . (A) Beyin dokusundaki iğne deliğini gösteren DAPI lekeli dilimin temsili görüntüsü. Ölçek çubuğu: 1.000 μm. (B) DAPI boyaması ile gösterildiği gibi demiyelinli bölgede MAG'nin in situ hibridizasyonunu gösteren temsili görüntüler. UM206 tedavisi, MAG etiketli oligodendrositlerin sayısını arttırdı. Ölçek çubuğu: 100 μm. (C) Demiyelinli bölgenin temsili iletim elektron mikroskobu görüntüleri. UM206 tedavisi miyelinli aksonların sayısını arttırdı. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, ozmotik pompayı, ilaçları doğrudan tedavi bölgesine ulaştırabilen ve uzun bir süre boyunca tutarlı ilaç dağıtımına izin veren, tüm deneysel süre boyunca merkezi sinir sisteminin mikro ortamında stabil bir ilaç konsantrasyonu yaratan, miyelin rejenerasyon araştırması için yeni bir ilaç dağıtım tekniği olarak tanımlamaktadır. Diğer ilaç dağıtım yöntemleriyle karşılaştırıldığında, ozmotik pompa demiyelinasyon lezyonunda ilaç konsantrasyonunu korumak için daha elverişlidir13. Örneğin, bazı nörotrofik faktörler için, sistemik ilaç, lezyon bölgesinde ilacın düşük konsantrasyonu nedeniyle herhangi bir etki elde edemez. Ancak dozaj arttırılırsa, yan etkiler daha önemli olacaktır14. Bu gibi durumlarda, ozmotik bir pompa aracılığıyla belirli bir bölgeye uygulanması, periferik yan etkileri etkili bir şekilde azaltabilir15. Ek olarak, miyelin rejenerasyonu ile ilgili birçok ilaç zayıf kan-beyin bariyeri (BBB) geçirgenliğine sahiptir veya proteolitik bozunmaya duyarlılık nedeniyle kısa bir in vivo yarı ömür gösterir. Bu problemler ozmotik pompalar tarafından iyi bir şekilde ele alınabilir.
Bununla birlikte, ozmotik pompa yöntemi uyarı ve sınırlamalar olmadan değildir. İlk olarak, invaziv bir ilaç dağıtım sistemi olarak, kaçınılmaz olarak beyin infüzyonu kanül yerleştirme bölgesinde beyin dokusu hasarına ve nöroinflamasyona neden olur ve bu da ilaçların etkisini gizleyebilir. Bu nedenle, uygun bir sadece solvent kontrol grubu kurulmalıdır. İkincisi, bazı ilaçların çözünmesi için dimetil sülfoksit (DMSO), N-metil-2-pirolidon (NMP) gibi çözücüler gerekir, ancak bu çözücüler rezervuar malzemesiyle uyumlu değildir ve pompalarda önemli bir arızaya neden olabilir. Örneğin, yüksek konsantrasyonlarda dimetil sülfoksit (DMSO) ve PEG400'ün pompa salınımını olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir ve ozmotik pompalarda kullanım için uygun olmayabilir16,17,18. Üçüncüsü, 37 ° C'de kararsız olan ilaçlar, ozmotik pompayı kullanarak uzun süreli infüzyon için uygun olmayabilir. Tüm bu konular, ozmotik pompayı uygulamayı planlıyorsanız dikkat çekicidir.
Bu protokoldeki birkaç adım, deneyler sırasında ekstra dikkat gerektirir. Ozmotik pompaların normal çalışması için, araştırmacılar ozmotik pompanın doğru şekilde monte edildiğinden ve pompaya herhangi bir kabarcık girmediğinden emin olmalıdır, aksi takdirde infüzyon verimliliğini büyük ölçüde zayıflatır. Ek olarak, kateter tıkanıklığı veya ozmotik pompa arızası, deneyden sonra pompa rezervuarındaki artık hacmin ölçülmesiyle belirlenebilen infüzyon arızasına neden olabilir19. Ozmotik pompanın daha küçük beyin boyutlarına sahip genç farelerde uygulanması için, uygun bir yerleştirme derinliği sağlamak için bir deneme deneyi önerilir. Ayrıca, beyin infüzyon kanülü, infüzyon sırasındaki hareketini en aza indirmek için kafatasına sıkıca sabitlenmelidir.
Şu anda, birçok in vitro çalışma, miyelin rejenerasyonunu teşvik edebilecek çeşitli ilaçlar bulmuştur, ancak zayıf BBB geçirgenliği, kısa yarı ömrü ve diğer problemler nedeniyle, bu ilaçların in vivo olarak başarılı bir şekilde doğrulanması zordur. Bu nedenle, ozmotik pompa, özellikle kısa yarı ömrü, zayıf BBB geçirgenliği ve belirgin periferik yan etkileri olan ilaçlar için geçerli olan merkezi sinir sistemi miyelin rejenerasyonu araştırması alanında büyük bir değere sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC 32070964, 31871045) J.N.'ye ve Shenzhen Temel Araştırma Vakfı'ndan (JCYJ20210324121214039) YS'ye yapılan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
- Theeuwes, F., Yum, S. I. Principles of the design and operation of generic osmotic pumps for the delivery of semisolid or liquid drug formulations. Annals of Biomedical Engineering. 4 (4), 343-353 (1976).
- Herrlich, S., Spieth, S., Messner, S., Zengerle, R. Osmotic micropumps for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1617-1627 (2012).
- Wei, E., Loh, H.
- Pettigrew, J. D., Kasamatsu, T. Local perfusion of noradrenaline maintains visual cortical plasticity. Nature. 271 (5647), 761-763 (1978).
- Wang, Y., et al. Reduced oligodendrocyte precursor cell impairs astrocytic development in early life stress. Advanced Science (Weinheim). 8 (16), 2101181 (2021).
- Tang, C., et al. Neural stem cells behave as a functional niche for the maturation of newborn neurons through the secretion of PTN. Neuron. 101 (1), 32-44 (2019).
- Watanabe, S., Komine, O., Endo, F., Wakasugi, K., Yamanaka, K. Intracerebroventricular administration of Cystatin C ameliorates disease in SOD1-linked amyotrophic lateral sclerosis mice. Journal of Neurochemistry. 145 (1), 80-89 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50326 (2013).
- Tang, C., Guo, W. Implantation of a mini-osmotic pump plus stereotactical injection of retrovirus to study newborn neuron development in adult mouse hippocampus. STAR Protocols. 2 (1), 100374 (2021).
- Niu, J., et al. Oligodendroglial ring finger protein Rnf43 is an essential injury-specific regulator of oligodendrocyte maturation. Neuron. 109 (19), 3104-3118 (2021).
- Breitschopf, H., Suchanek, G., Gould, R. M., Colman, D. R., Lassmann, H. In situ hybridization with digoxigenin-labeled probes: sensitive and reliable detection method applied to myelinating rat brain. Acta Neuropathologica. 84 (6), 581-587 (1992).
- Cree, B. A. C., et al. Clemastine rescues myelination defects and promotes functional recovery in hypoxic brain injury. Brain. 141 (1), 85-98 (2018).
- Eckenhoff, B., Yum, S. I. The osmotic pump: novel research tool for optimizing drug regimens. Biomaterials. 2 (2), 89-97 (1981).
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature Neuroscience. 5, 1046-1050 (2002).
- Hagg, T.
- Bittner, B., Thelly, T., Isel, H., Mountfield, R. J. The impact of co-solvents and the composition of experimental formulations on the pump rate of the ALZET osmotic pump. International Journal of Pharmaceutics. 205 (1-2), 195-198 (2000).
- Arnot, M. I., Bateson, A. N., Martin, I. L. Dimethyl sulfoxide/propylene glycol is a suitable solvent for the delivery of diazepam from osmotic minipumps. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36 (1), 29-31 (1996).
- Gullapalli, R., et al. Development of ALZET osmotic pump compatible solvent compositions to solubilize poorly soluble compounds for preclinical studies. Drug Delivery. 19 (5), 239-246 (2012).
- White, J. D., Schwartz, M. W. Using osmotic minipumps for intracranial delivery of amino acids and peptides. Methods in Neurosciences. 21, 187-200 (1994).
